PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

אינטראקציות מרובות תהליכים ביוכימיים מתרחשים על משטחים נוזל מימדי דו מימדי. אורגניזמים בממברנה בתאים אאוקריוטים ייחודיים לא רק בתהליכים ביוכימיים ובפרוטאומה הקשורה אליהם, אלא גם בהרכב השומנים שלהם. מחלקה יוצאת דופן אחת של phospholipids היא phosphoinositides (PIPs). למרות שהם מהווים רק 1% של lipidome הסלולר, הם ממלאים תפקיד מכריע transduction האות, autophagy, וסחר קרום, בין היתר ^{1 , 2 , 3 , 4} . זרחון דינמי של קבוצת הראש inositol על ידי קינאזות PIP הסלולר מעורר שבעה קבוצות ראשיות PIP כי הם מונו, bis, או tris-phosphorylated ⁵ . בנוסף, PIPs מגדירים את הזהות התת-תאית של הממברנות ומשמשים כאתרי עגינה מיוחדים לממברנות / אנזימים המכילים פוספוינוס אחד או יותרתחומים מחייב, למשל, Pleckstrin הומולוגיה (PH), Phox הומולוגיה (PX), epsin N- מסוף הומולוגיה (ENTH) ^{6 , 7} . אחד התחומים הנחקרים ביותר PIP מחייב הוא phospholipase C (PLC) -δ1 PH תחום זה באופן ספציפי אינטראקציה עם phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P ₂ ) בתוך טווח גבוה nromomolar נמוך מיקרומטר טווח זיקה ^{8 , 9 , 10 , 11} .

מגוון של שיטות איכותיות וכמותיות במבחנה פותחו והשתמשו כדי ללמוד את המנגנון, התרמודינמיקה, ואת הספציפיות של אינטראקציות אלה. בין מבחני ה- PIP המחוברים הנפוצים ביותר הם תהודה של פלסמון על פני השטח (SPR), קלורימטרי איזותרמי (ITC), ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), הצפת ליפוזום / אסאי משקעים, כתמי שומנים (כתמי שומן / רצועות PIP)^{12 , 13} . למרות אלו הם בשימוש נרחב, לכולם יש חסרונות רבים. לדוגמה, SPR, ITC ו- NMR דורשים כמויות גדולות של מדגם, מכשור יקר ו / או כוח אדם מיומן ^{12 , 13} . כמה פורמטים assay כגון נוגדנים מבוססי ליפידים כתמים לנצל מים מסיסים צורות של PIPs ולהציג אותם בצורה לא פיזיולוגיים ^{12 , 14 , 15 , 16} . בנוסף, כתמי שומנים לא ניתן לכמת באופן מהימן והם הביאו לעתים קרובות תצפיות כוזבות / שליליות כוזבות ^{12 , 17 , 18} . כדי להתגבר על אתגרים אלה ולשפר על הכלי הנוכחי להגדיר, שיטה חדשה ללא תווית הוקם מבוסס על השומנים נתמך bilayer (SLB) בהקשר של am פלטפורמה icrofluidic, אשר הוחל בהצלחה במחקר של אינטראקציות חלבון PIP ( איור 1 ) ¹⁹ .

האסטרטגיה המשמשת לגילוי אינטראקציות חלבון PIP מבוססת על חישה אפנון pH. זה כרוך צבע רגיש-pH כי יש B Ortho -Sulforhodamine (o SRB) מצומד ישירות לקבוצת ראש השומנים phosphatidylethanolamine ^20. O SRB-POPE בדיקה ( איור 2 א ) הוא פלואורסצנטי מאוד ב pH נמוך ו הרווה ב pH גבוה עם pKa סביב 6.7 בתוך 7.5% מול PI (4,5) P ₂ המכיל SLBs ( איור 5 ב ). תחום ה- PLC-δ1 PH נעשה בהרחבה לאימות מתודולוגיות של חלבונים-PIP, בשל הייחודיות הגבוהה שלו כלפי PI (4,5) P ₂ ( איור 5 א ' ) ^{21 , 22 ,}"> 23 ^{, 24 , 25} .לפיכך, הנחנו כי תחום ה- PLC-δ1 PH יכול לשמש לבדיקת המחיצה ל- PI (4,5) P ₂ דרך ה- PIP-on-a-chip. השתמשו במחקר זה יש מטען חיובי נטו (PI 8.4), ובכך מושך OH ^-. יונים (איור 5 ג) עם קשירה PI (4,5) P ₂ SLBs המכילים, תחום PH מביא את OH ^- יונים אל משטח הממברנה, אשר בתורו מודולציה פוטנציאל interfacial משמרות מדינת protonation של o SRB-האפיפיור (איור 5 ג) ^26. כפועל יוצא של ריכוז תחום PH, הקרינה הוא רווה (איור 6 א). לבסוף, הנתונים המנורמלים הוא כדי להתאים את הזיקה של PH-PI (4,5) P ₂ אינטראקציה ( איור 6 ב , 6 ג ). </ P>

במחקר זה, פרוטוקול מפורט מסופק לבצע חלבון מחייב PIP המכילים SLBs בתוך פלטפורמה microfluidic. פרוטוקול זה לוקח את הקורא מ הרכבה את המכשיר microfluidic הכנה שלפוחית ​​כדי היווצרות SLB וחלבון מחייב. בנוסף, ניתנים הוראות לניתוח נתונים כדי לחלץ מידע זיקה עבור האינטראקציה PLC-δ1 PH-PI (4,5) P ₂ .

1. ניקוי זכוכית Coverslips

1. לדלל ניקוי 7x פתרון (ראה טבלה חומרים ) 7-פי עם מים deionized ב 100 מ"מ עמוק בורוסיליקט צלחת זכוכית עם תחתית שטוחה לחמם אותו עד 95 מעלות צלזיוס על צלחת חמה ברמה במשך 20 דקות או עד פתרון מעונן מתבהר .
   הערה: הפתרון יהיה חם, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פציעות גופניות. פתרון ניקוי 7x הוא תערובת קניינית של hexasodium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] oxyphosphoryl] פוספט, 2 (2-butoxyethoxy) אתנול, נתרן 1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutane -2-sulfonate ותוספות לא מסוכנים.
2. באמצעות פינצטה, לארגן את coverslips (40 מ"מ אורך x 22 מ"מ רוחב x 0.16-0.19 מ"מ גובה) על מכתים אלומיניום מדף לסירוגין כיוונים. שמור נקודה ריקה בין coverslip כל כדי למנוע מהם נוגעים זה בזה.
3. לגמרי להטביע את המדף מכתים עם coverslips בפתרון ניקוי. שמור את coverslips בהפתרון עבור 1 h.
   הערה: כמו המים מתאדה, לשמור על הוספת מים deionized טריים כדי לשמור על ריכוז הפתרון ללא שינוי.
4. קח את המדפים מכתים מתוך פתרון ניקוי ולשטוף את coverslips עם כמויות רבות של מים deionized להסיר את חומר הניקוי.
5. יבש coverslips עם גז חנקן (כ 5 דקות לכל מדף מכתים), ולאחר מכן למקם coverslips בכבשן עבור 6 שעות ב 550 מעלות צלזיוס עבור חישול.
   הערה: זהו צעד מכריע אשר מחליקה תכונות גסות על משטח הזכוכית.
6. מניחים את coverslips במיכל פלסטיק ולשמור אותם הרחק אבק.

2. בודה Micropatterned PDMS בלוקים

1. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) prepolymer ואת סוכן ריפוי ב 10: 1 (w / w) יחס פלסטיק גדול לשקול סירה degas אותו ואקום עבור 1 שעות עם כוח ואקום ב 500 טור או פחות.
   הערה: PDMS הוא פולימר סיליקון שקוף ואינרטי. כדי לקבל את לחסום PDMS הרצוי לא(0.5 ס"מ), לערבב 55 גרם של prepolymer עם 5.5 גרם של סוכן ריפוי.
2. מניחים את יחידת הסיליקון המכיל מספר משכפל של micropattern SU-8 אותו בקוטר גדול (10 ס"מ בסיס) פלסטיק לשקול סירה ויוצקים PDMS degassed. לאחר מכן, לרפא אותו בתנור יבש ב 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: Micropatterns הם גדולים מספיק כדי להיראות בעין בלתי מזוינת. כל תבנית מכילה 8 microchannels (100 מיקרומטר רוחב x 40 מיקרומטר גובה x 1 ס"מ אורך) עם המרווח 40 מיקרומטר בין ( איור 1A , 1B ). עובש סיליקון עובש המורכב קשה אפוי SU-8 photoresist היה מפוברק במתקן nanofabrication ²⁷ . גישות אחרות להכנת האב כוללות חומצה הידרופלואורית (HF) תחריט, טמפרטורת מים בטמפרטורה גבוהה, xurography, והדפסה 3D ^{28 , 29 , 30 , 31} . CommercIal מקורות להכנת אבץ סיליקון יכול לשמש גם. הדפוסים של המכשיר microfluidic תוכנן עם תוכנת שרטוט (ראה טבלה של חומרים). הקובץ המקורי המכיל את תבנית העיצוב מסופק כקובץ משלים "תבנית Design.dwg", אשר ניתן לספק ישירות ליצרן.
3. בעדינות, לקלף את PDMS מאסטר הסיליקון עם הידיים. סמן את הגבולות של כל micropattern במלבנים באמצעות מנתח כירורגי וסרגל. לאחר מכן, לחתוך את PDMS לתוך בלוקים.
4. אגרוף 16 חורים (8 מפרצון 8 שקעים לכל בלוק) בשני הקצוות של כל microchannel עם אגרוף ביופסיה (1.0 מ"מ חור בקוטר) כפי שצוין באיור 3 ב .
5. החל קלטת על כל בלוק PDMS כדי להגן על micropatterns מפני נזק ואבק. אחסן אותם במיכל פלסטיק.

3. הכנת קטן Unilamar שלפוחית ​​(SUVs)

הערה: שלילי שליטה bilayer הרכבהוא 99.5 mol% 1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (POPC) ו 0.5% mol יָשָׁר Sulforhodamine B-1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine (o SRB- אַפִּיפיוֹר). הבדיקה bilayer הרכב הוא 92.0 mol% POPC, 0.5 mol% o SRB-POPE, 7.5% מול של או L-α-phosphatidylinositol-4-Posphate (PI4P) או L-α-phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate (PI ( 4,5) P ₂ ). להלן הליך להכנת 92.0 mol% POPC, 0.5 mol% o SRB-POPE, ו 7.5 מול% PI (4,5) P _2- SUVs המכילים. הסינתזה של o SRB-האפיפיור השתמשו במחקר זה היה בעבר תיאר ^20.

1. לחשב את עוצמת הקול של POPC, PI (4,5) P ₂ , ו- o SRB-POPE אשר צריך לערבב, אשר מהווה את הסכומים הבאים: 2.22 מ"ג של POPC, 0.26 מ"ג של PI (4,5) P ₂ , ו 2.1 x 10 ^-5 מ"ג של האפיפיור SRB o.
2. פיפטה נפח מחושב של POPC, PI (4,5) P ₂ , <Em> o SRB-POPE לתוך בקבוק יחיד 20 מ"ל בקבוק נצנץ.
   הערה: פתרונות POPC ו- O -SRB-POPE מגיעים בפתרון של כלורופורם, ואילו PI (4,5) P ₂ (ופוספויוסיטידים) מגיע במלאי ממיצוי: כלורופורם: מתנול: מים (20: 9: 1). לקבלת דיוק, רטוב קצה פיפטה עם כלורופורם לפני השימוש בו. עבור בטיחות, שלב זה צריך להתקיים בתוך מכסה המנוע קטר כימי.
3. יבש את התערובת בזרם של גז חנקן בתוך מכסה המנוע כימיים קטר במשך 10 דקות או עד המאייד מתאדים סרט סרט שומנים דק בתחתית הבקבוקון.
4. לתמצת את התערובת תחת ואקום עבור ≥ 3 בשעה כוח ואקום של 10 mTorr להסיר כל שאריות אורגני ממס.
   הערה: 3 שעות זמן יובש מספיק בקנה מידה של הכנה SUV המתואר בפרוטוקול זה, אשר מתאים ל -50 ניסויים. אם בקנה מידה גדול יותר של הכנה SUV נדרש, ייבוש לילה יכול להתבצע.
5. Rehydrate את ד"רIed ליפיד הסרט עם 5 מ"ל של חיץ פועל (20 מ"מ HEPES, 100 mM NaCl, ב pH 7.0) ומניחים אותו באמבט קולי בתדר הפעלה של 35 קילוהרץ במשך 30 דקות ב RT.
   הערה: ערבוב כמויות השומנים המפורטים בשלב 3.1 והוספת 5 מ"ל של חיץ פועל בשלב 3.5 מניב השעיית השעיה ב 0.5 מ"ג / מ"ל. בשלב זה, ההשעיה שלפוחית ​​הוא שילוב של unilamellar ו multilamellar שלפוחית ​​( איור 2 ב ). הפתרון יופיע בצבע ורוד / סגול ועכורים יחסית.
6. הקפאה להפשיר את ההשעיה שלפוחית ​​עם חנקן נוזלי אמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס כדי לקבל שלפוחית ​​unilamellar. חזור על ההקפאה להפשיר 10 פעמים.
   הערה: (אופציונלי) כדי להבטיח את היעדר unilamellar שלפוחית ​​ההשעיה, צעד צנטריפוגה ניתן להחיל ^{32 , 33} .
7. Extrude ההשעיה שלפוחית ​​דרך 0.10 מיקרומטר מסלול חרוט פוליקרבונט פוליקרבונט באמצעות extruder השומנים (ראהטבלה של חומרים) כדי להעשיר עבור SUV. חזור על הבלטה 10 פעמים.
   הערה: צינור חרוטי 15 מ"ל ניתן להשתמש כדי לאסוף את שלפוחית ​​extruded. הפתרון צריך להיות ריק של עכירות בשלב זה. קוטר SUV ניתן לאשר באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) ( איור 2 ג ). רכבי השטח הם המתאימים ביותר ליצירת SLBs ³⁴ .
8. מכסים את צינור חרוטי עם רדיד אלומיניום לאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.

4. הרכבת המכשיר Microfluidic

1. בדוק את פתחי הכניסה של שקע PDMS לחסימה על ידי מתיז מים deionized דרך החורים באמצעות בקבוק לשטוף מים. לאחר מכן, יבש את בלוק PDMS עם גז חנקן.
   הערה: צעד זה גם להסיר כל חלקיקי אבק שאולי היה לכוד בתוך ו / או בין הערוצים. במידת הצורך, dedust מראש ניקוי coverslips עם גז חנקן כדי להסיר כל חלקיקי אבק.
2. מניחים את PDMS לחסום מראש לנקות(ראה טבלה 1) בתוך מערכת פלזמה חמצן (ראה טבלה של חומרים) תא המדגם לחשוף עם פלזמה חמצן עבור 45 שניות עם הגדרת כוח ב 75 וואט, מהירות זרימת החמצן ב 10 ס"מ ³ / min, כוח ואקום ב 200 mTorr .
3. מניחים את פני השטח בדוגמת לחסום PDMS במגע עם coverslip מיד לאחר הטיפול פלזמה חמצן. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר באתרי קשר.
4. מניחים את המכשיר על צלחת חמה ברמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי לשפר את מליטה.
5. השתמש רטוב מוך חינם לנגב ( למשל kimwipe) עם אתנול 100% להסיר כל חלקיקי אבק מהחלק העליון (PDMS) ואת התחתון (זכוכית) של המכשיר. לאחר מכן, הקלטת את המכשיר על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית.
   הערה: אין להשתמש בכמות מופרזת של אתנול ולמנוע אתנול להיכנס לערוצי הכניסה והשקע. ביצוע שלב זה בעוד המכשיר עדיין חם מומלץ על מנת להבטיח אתנול מתאדה מיד. זכוכית micrOscopy שקופיות ניתן לאחסן בפתרון אתנול 100% כדי להסיר אבק ומזהמים אחרים.

5. יצירת Blayers שומנים נתמכים (SLBs)

1. העברת 100 μL של PI (4,5) P ₂ המכילים SUVs משלב 3.8 לתוך צינור microcentrifuge 0.65 מ"ל. התאם את ה- pH של הפתרון ~ 3.2 על ידי הוספת 6.4 μL של 0.2 N חומצה הידרוכלורית.
   הערה: לאשר את ה- pH של הפתרון עם מטר pH מצויד בדיקה מיקרו pH (ראה טבלה של חומרים).
2. פיפטה 10 μL של ה- pH מותאם SUV פתרון לתוך כל ערוץ דרך כניסת ולהחיל לחץ דרך פיפטה עד הפתרון מגיע לשקע. לנתק את קצה מהפיפטה ולהשאיר אותו מחובר למכשיר.
3. חזור על השלב הנ"ל עבור כל ערוץ ולאחר מכן דגירה המכשיר למשך 10 דקות ב RT.
   הערה: הזרקת שלפוחית ​​לתוך microchannels צריך להתבצע מיד לאחר הרכבה המכשיר.
4. גזור סטים של כניסת מפרצון צינורות EACh 60 ס"מ (צינורות מפרצון) ו 8 ס"מ (צינורות מוצא) ארוך, בהתאמה.
   הערה: חיתוך צינורות באלכסון ויצירת קצה חד, מקל להכניס את צינורות לתוך פתחים שקעים. צינורות מוצא צריך להיות בצורת קשת. אורך צינורות כניסת עשוי להשתנות בהתאם להגדרת המיקרוסקופ. הקוטר הפנימי של הצינור הוא 0.05 ס"מ.
5. באמצעות פינצטה, לחבר את צינור מוצא למכשיר, ולאחר מכן הקלטת המכשיר על הבמה מיקרוסקופ.
6. לצלול סוף אחד של צינורות כניסת כניסה 25 מ"ל של חיץ פועל הכלול צינור חרוטי קלטת זה כדי לוודא כי הצינור מאובטח.
7. מניחים את צינור חרוטי על קרקע גבוהה יותר (~ 20 ס"מ) מאשר המכשיר כדי לדחוף את הפתרון דרך microchannels באמצעות זרימת הכבידה; שקע במעבדה ניתן להשתמש כדי להשיג זאת.
8. עבור כל צינור מפרצון, להשתמש מזרק לצייר 1 מ"ל של חיץ פועל מהקצה החופשי של הצינור. הסר את קצה פיפטה מן כניסת ולהכניס אתסוף חינם של כניסת צינורות לתוך המכשיר.
   הערה: הכניסו טיפה של חיץ פועל על המפרק כדי להפחית את ההסתברות של בועה אווירית לתוך הערוץ במהלך שלב זה. לאחר צינור הכניסה מחוברת למכשיר, השתמש במחק ללא מוך כדי להסיר את המאגר עודף.
9. חזור על השלב לעיל כדי לחבר את כל חלקי צינורות הכניסה למכשיר.
   הערה: זרימת חיץ פועל דרך הערוצים מסייעת להסיר שלפוחיות עודף לאזן את bilayer לתנאים ניסיוניים.
10. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים). בחלונית השמאלית, לחץ על הכרטיסייה "מיקרוסקופ" ובחר את "10X" המטרה.
11. לחץ על "Live" ולאחר מכן "Alexa 568" סמלים התמונה על סרגל הכלים. באמצעות הכפתורים בסדר התאמה כמובן, להתמקד microchannels.
12. סרוק דרך ההתקן כדי לבדוק את האיכות של SLBs והערוצים ( איור 8 ). לאחר מכן,לחץ על סמל "Shutter Closed" סגור בסרגל הכלים.
13. לחץ על הכרטיסייה "רכישה", תחת "התאמות בסיסיות" בחר "זמן חשיפה". הגדר את זמן החשיפה ל - "200 ms".
14. בחלונית השמאלית, לחץ על "רכישה רב ממדית" ותחת תפריט המסננים בחר את הערוץ האדום (מסומן "Alexa 568"). לאחר מכן, לחץ על "זמן לשגות" בתפריט, להגדיר את מרווח הזמן ל 5 דקות, משך עד 30 דקות, ולחץ על "התחל".
    הערה: בהתבסס על משך (30 דקות) ואת קצב הזרימה (~ 1.0 μL / min), 30 μL של חיץ פועל משמש כדי לאזן את SLB בתוך ערוץ, כלומר 240 μL של חיץ פועל משמש לכל 8 ערוצים.
15. בחר בכלי 'מעגל' שמתחת לכרטיסייה 'מדידה' וצייר מעגל בכל ערוץ. לחץ לחיצה ימנית בזמן שהמעגל נבחר ובחר "מאפיינים". תחת "פרופיל" הכרטיסייה, לבדוק "כל T" כדי להציג אתעוצמת הקרינה כפונקציה של זמן.
    1. ודא עקומה זו מגיעה הרמה, אשר מציין שיווי משקל, לפני שתמשיך לשלב הבא.
16. הנמך את תמיסת המאגר לקרקע שוות כמכשיר כדי לעצור את הזרימה.
17. שמור את הקובץ לשגות זמן.

6. אינטראקציה תחום PH בדיקת PLC-δ1 עם PI (4,5) P ₂ המכילים SLBs

1. הכן דילולים של תחום PH באמצעות המאגר פועל כמפחית.
   הערה: מכיוון שיש שמונה ערוצים בתוך המכשיר, השתמש לפחות שניים מהם עבור פקדים ריקים. בחר את הקצוות הרחוקים בכל צד ולהשתמש בערוצים הנותרים עבור דילולים חלבון. ריכוזי ה- PH הבאים נבדקו: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 ו- 2.50 מיקרומטר. כ 200 μL של דילול כל היה מספיק כדי להגיע שיווי המשקל בתוך 30 דקות.
2. אחד בכל פעם, לנתק כל צינור מוצא ולהחיל 200 μL של דילול כל חלבון לתוךאת ערוץ מוצא באמצעות פיפטה. אין להפעיל לחץ כלשהו, ​​תן כוח הכבידה לעשות את העבודה. לנתק את קצה מהפיפטה ולהשאיר אותו מחובר למכשיר microfluidic.
3. חזור על השלב הנ"ל עבור כל ערוץ ולוודא כי בועות אוויר לא הציג לתוך הערוצים במהלך תהליך זה.
4. מנמיכים את צינורות מפרצון לקרקע מתחת למכשיר microfluidic להתחיל לזרום את החלבון דרך microchannels. קלטת את הקצה החופשי של הצינור למיכל פסולת. תזרים דילולים חלבון למשך 30 דקות.
   הערה: זה יהיה להפוך את זרימת ולאפשר החלבון להיות הציג לתוך הערוצים. הזמן כדי equilibration ונפח של דילולים חלבון הצורך יהיה תלוי הזיקה של האינטראקציה.
5. בחלונית השמאלית של התוכנה, תחת לשונית "זמן לשגות", לחץ על "התחל" כדי להתחיל הדמיה שוב.
6. חזור על הצעד 5.15 כדי להגיע לשיווי משקל בטוח. כאשר הניסוי הושלם, שמור את הזמן לשגותקוֹבֶץ.

7. הערכת קרום הממברנה

הערה: פלואורסצנטי לשחזר לאחר Photobleaching (FRAP) ניסויים צריך להתבצע עם אצווה חדשה של רכבי השטח ו coverslips זכוכית נקי כדי להבטיח כי SLBs הם נוזל.

1. בצע את ההליך לניקוי coverslips זכוכית (1.1-1.6), בודה micropatterned בלוקים PDMS (2.1-2.5), הכנת SUVs (3.1-3.8), הרכבה של המכשיר microfluidic (4.1-4.5) ויצירת SLBs (5.1-5.17) כמו בעבר מְתוּאָר.
2. פוקוס המיקרוסקופ על bilayer, להגדיר את זמן החשיפה 200 ms, ואת binning ל 1.
3. תמונה להלבין נקודה מעגלית באמצעות 532 ננומטר, 2 לייזר לייזר MW (רדיוס 13 מיקרומטר). מיד לאחר photobleaching, להתחיל לכידת סדרה של תמונות כל 3 שניות עבור 45 הראשון, ואחריו מרווח של 30 למשך שארית הזמן (15 דקות משך כולל). לאחר רכישת הנתונים הושלם, שמור את הקובץ זמן לשגות.
4. בחר את מולבן אRea באמצעות כלי ציור מעגל לחלץ ערכים עוצמת הקרינה כפונקציה של זמן. בנוסף, בחר שני אזורים נוספים בקרבת מקום, אחד המתאים לאזור לא צמוד ואחד המתאים לאזור ללא SLBs.
5. חישוב התאוששות פלואורסצנטי ( y ) באמצעות המשוואה הבאה:
   
   הערה: כאן F _t מייצג את עוצמת האזור המולבן כפונקציה של הזמן, F _אני מייצג את עוצמת הקרינה לפני הלבנה (השתמש "1" כערך מנורמל במקרה זה); F ₀ הוא עוצמת הרקע.
6. Plot התאוששות הקרינה (ציר y) כפונקציה של זמן (ציר x) כדי ליצור עקומת FRAP. לאחר מכן, להתאים את הנתונים לפונקציה מעריכי יחיד כדלקמן,
   
   הערה: כאן מייצגת את השבר נייד t _1/2 ):
   
7. השתמש t _1/2 לחשב את קבוע דיפוזיה ( D ):
   
   הערה: כאן R מייצג את רדיוס קרן הלייזר (13 מיקרומטר). קבוע דיפוזיה עבור bilayer נוזל צריך להיות ≥ 1.0 מיקרומטר ² / s.

8. נתוני עיבוד

הערה: שגרת ניתוח הנתונים תהיה תלויה במיקרוסקופ, תוכנת עיבוד תמונה, ואת התוכנה מתאים עקומת בשימוש.

1. פתח את הקבצים לשגות זמן של לפני (משלב 5.17) ואחרי (מ 6.6 שלב) טיטרציה תחום PH. עבור אל המסגרת האחרונה של כל קובץ זמן לשגות ולעשות סריקה קו על פני כל microchannels להשיג את fluorescEnce נתוני עוצמת כפונקציה של המרחק בפיקסלים ( איור 6 א ). להעביר את הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני.
2. עבור כל microchannel (לפני ואחרי PH תחום בנוסף), מדגם כמה נתונים בתוך הערוץ ואת צדי הערוץ המייצג את הבסיס ( איור 7 א ).
   הערה: עוצמת הקרינה ערוץ ריק צריך להישאר ללא שינוי. כל הערוצים האחרים הם מנורמל לערוץ ריק, ולכן זה חיוני יש שני ערוצים ריקים ולוודא כי עוצמות הקרינה שלהם להישאר עקבית אחד עם השני.
3. החל את הנוסחה שלהלן כדי לנרמל את הנתונים לערוץ הריק; חישוב מדגם מסופק באיור 7 ב .
   
   הערה: כאן ΔF _חלבון מייצג את עוצמת הקרינה מופחתת רקע של ערוץ חלבון, Δ, F _ריק מייצג את עוצמת הרקע הקרינה מופחתת של הערוץ הריק, מראש לכתוב מתייחסים לפני ואחרי צעדים טיטרציה חלבון, ו α מייצג את גורם תיקון שהוא היחס בין עוצמות הקרינה של ערוץ חלבון הערוץ הריק ([ F _חלבון / F _ריק ] _מראש ) בשלב טרום חלבונים. מאז עוצמת הקרינה פוחתת כפונקציה של ריכוז תחום PH, נתונים מנורמל יהיה שלילי ערך.
4. באמצעות תוכנה עקומת הולם (ראה טבלת חומרים ), העלילה הקרינה מנורמל כפונקציה של ריכוז תחום PH ו בכושר האיזותרמה Langmuir ( איור 6 ג ):
   
   הערה: כאן ΔF מייצג את השינוי בעוצמת הקרינה ביחס לשינוי המרבי בפלו( ΔF _max ), בעוד ש- K _d, מייצג את קבוע הדיסוציאציה, השווה לריכוז החלבון ( [PLC-δ1 PH] ), שבו כיסוי של 50% קרום מאוגד מורכב) מושגת. זהו שיווי משקל מבוסס מחייב מדידה כך הנתונים מנורמל מתאים ל isherm Langmuir פשוט לחלץ פרמטר ניסיוני לכאורה K _{ד, App} . בהתבסס על התוכנה הולם K _{D, App} עבור PLC-δ1 PH-PI (4,5) אינטראקציה P ₂ הוא 0.39 ± 0.05 מיקרומטר ( איור 6 ב ).

השתמשנו assay אפנון pH ללמוד את PLC-δ1 PH תחום PI (4,5) P 2 אינטראקציה בתוך מיקרופרוויס PIP על שבב ( איור 1 ). באמצעות פרוטוקול מפורט, אנחנו הוכיחו כיצד להכין ולהרכיב רכיבים המכשיר microfluidic, לעשות קטן שלפוחית ​​unilamellar (SUVs) ( איור 2 ), טופס SLBs בתוך המכשיר ( איור 3 ), וחלבון נבדק מחייב PIP המכילים SLBs. תרשים זרימה של ניסוי טיפוסי של SLB מתואר באיור 4 . העיקרון של assay אפנון pH מודגם באיור 5 באמצעות PH- תחום PI (4,5) P 2 מחייב כדוגמה. התוצאות שהתקבלו במחקר זה הציע כי תחום PH נקשר PI (4,5) P 2 SLBs המכילים. ליתר דיוק, ראינו כי על מחייב, ה- pH המקומי הפך בסיסי יותר. זֶה שינוי ה- pH המקומי היה חשה על ידי o -SRP-POPE בדיקה ניאון נוכח בתוך SLBs, אשר לאחר מכן הרווה בהתאם ( איור 6 א , 6C ). מרווה היה תלוי ריכוז ו saturable, כך הולם את הנתונים כדי איזותרמה Langmuir הניב K ד, App של 0.39 ± 0.05 מיקרומטר ( איור 6 ב , 6D ). תחום ה- PH הראה סלקטיביות כלפי PI (4,5) P 2 מאחר שלא נצפתה שום מחייב כלפי POPC (ליפידים zwitterionic), וחלשה חלשה יותר ל- SLBs המכילים PI4P ( K d, app = 1.02 ± 0.20 מיקרומטר) ( איור 6 ב ). חישוב מדגם כלול כדי להראות כיצד הנתונים פלואורסצנציה מעובד ( איור 7 ). באיור 8 , סדרה של תמונות microchannel מוצגים לספק רמזים חזותיים בקביעת איכות SLBs ו microchannels.

איור 2. קטן unilamellar שלפוחית ​​(SUV) הכנה ומחקרי בקרת איכות. ( א ) מרכיבי שומנים המשמשים לייצור שלפוחית: אורתו -סולפורחמין B-POPE ( O -SRB-POPE), L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P), L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PI (4,5) P 2 ), ו- 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (POPC). ( B ) סוגי שלפוחית ​​השומנים: SUV, שלפוחית ​​unilamellar גדול (LUV), שלפוחית ​​unilamellar ענק (GUV), ו multilamellar שלפוחית ​​(MLV). רכבי השטח הם המתאימים ביותר להכנת SLBs 34 . ( ג ) דינאמי אור פיזור (DLS) אישור מבוסס על גודל שלפוחית ​​שלאחר השומנים שלפוחית ​​(דרך 0.1 מיקרומטר מסנן). רדיוס הידרודינמי (Rh) של 53.9 ננומטר מאשר כי m EAN של התפלגות גודל שלפוחית ​​הוא ~ 100 ננומטר. התוצאות מייצגות את המדידה מ PI (4,5) P 2- SUVs המכילים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: היווצרות SLB על זכוכית תמיכה. ( א ) שלפוחית ​​הרכב השומנים הרצוי מוכנים ואז זרמו דרך microchannels. שלפוחית ​​הם adsorbed על משטח זכוכית מעוות. לאחר כיסוי משטח קריטי מושגת, שלפוחית ​​לקרוע באופן ספונטני כדי ליצור SLBs. הסתגלות הפניות 35 , 36 . ( ב ) SLBs בתוך מכשיר תחת מטרה 10X מוצג. אלקסה 568 סט מסנן (עירור / פליטה ב 576/603 ננומטר) משמש."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank" לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: תרשים זרימה של ניסוי SLB טיפוסי. רכיבי המכשיר Microfluidic כלומר דפוסים PDMS לחסום coverslips ניקה, מטופלים עם פלזמה חמצן לעשות שני משטחים הידרופילית ולאחר מכן התאספו. רכבי השטח זורמים דרך microchannels כדי ליצור SLBs. עודף שלפוחית ​​יוסרו SLBs הם equilibrated לתנאים ניסיוניים על ידי זרימת פתרון חיץ פועל. לאחר מכן, דילולים חלבון זורמים דרך microchannels. לבסוף, הנתונים עוצמת הקרינה מנותח, מנורמל, ו זממו כפונקציה של ריכוז החלבון. הנתונים מנורמל מתאים פונקציה כדי לחלץ קבוע דיסוציאציה לכאורה ( K ד, App ) vaלואו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: עקרונות החישה המבוססת על אפנון pH. ( A ) מבנה גביש רנטגן של תחום PLC-δ1 PH במתחם עם PI (4,5) P 2 קבוצת ראש inositol 1,4,5-trisphosphate (Ins (1,4,5) P 3 ) (PDB מזהה: 1MAI) 37 . (ב) בדיקה o SRB-האפיפיור הוא פלורסנט מאוד ב- pH נמוך הרווה ב- pH גבוה עם pKa של 6.7 בתוך PI 7.5 mol% (4,5) P 2 המכילים SLBs כמצוין עקומת טיטרציה pH. ( ג ) תחום PH המשמש במחקר זה יש נקודת isoelectric (pI) של 8.4, כך ב pH ניסיוני (7.0) החלבון הוא טעון חיובי. נשיאת חיובי נטו cHarge, חלבון מושך OH - יונים. כאשר תחום PH נקשר PI (4,5) P 2 המכילים SLBs, זה מביא את OH - יונים על פני שטח הקרום, פוטנציאל interfacial הוא מווסת שבתורה מסיטה את מדינת protonation של o SRB-אפיפיור, הקרינה שלה הוא הרווה ב PH תחום תלוי ריכוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6: PLC-δ1 PH- ממברנה מחייב פיקוח באמצעות אפנון pH. ( א ) את התצוגה של microchannels לפני ואחרי הוספת תחום PH בריכוזים שצוינו. ( ב ) השוואה של הזיקה POPC, PI4P, ו PI (4,5) P 2 המכיל SLBs. PH תחום מחייב עד 7.5 mol% PI (4,5) P 2 המכיל SLBs הניב K ד, App של 0.39 ± 0.05 מיקרומטר. חלש חלש נצפתה סביב 7.5% MOL PI4P המכילים SLBs ( K ד, App של 1.02 ± 0.20 מיקרומטר) ולא מחייב נצפתה עבור POPC SLBs טהור. ברים שגיאה מצביעים על SEM (n = 3). שני זנב t- test שימש כדי להשוות את הזיקה בין PI4P ו PI (4,5) P 2 מחייב (* p = 0.0396). (ג) עוצמות הקרינה מקו לסרוק את פני microchannels נרשמות כפונקציה של המרחק בפיקסלים עבור POPC, PI4P, ו PI (4,5) P 2 ניסויים מחייב. ( D ) מנורמל וממוצע POPC, PI4P ו- PI (4,5) P 2 נתונים מחייב הוא זממו כפונקציה של ריכוז תחום PLC-δ1 PH ולאחר מכן להתאים איזותרם Langmuir לחלץ K , ד . ראה את המשוואה בשלב 8.4 לפרטים."Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: חישוב מדגם לעיבוד נתונים. ( A ) לפני (שחור) ואחרי (אדום) חלבון קו טיטרציה לסרוק נתונים עבור ריק (לא חלבון) וחלבון ערוץ, שבו נתונים עוצמת הקרינה מוצג כפונקציה של המרחק בפיקסלים. אזורים מוצלים מייצגים את האזורים ששימשו לחלוקת נתונים עבור החישובים. נתוני עוצמת הקרינה הבסיסית מופק ממש לפני ואחרי כל ערוץ. ( B ) נתונים מופק עבור ערוצי ריק חלבונים, לפני ואחרי טיטרציה חלבון. ממוצעים נלקחים על בסיס ובתוך נתוני פלואורסצנטי ערוץ. לאחר החיסור הבסיסי, הנתונים הקרינה הוא מנורמל לערוץ ריק. ראה את המשוואה בשלב 8.3 לפרטים. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8: הערכת שלמות SLBs ו microchannels. ( א ) תמונה הממחישה איכות גבוהה SLBs ו microchannels. ( ב ) היתוך לא שלם. ( ג ) microchannels התמזגו. ( ד ) חלקיק אבק לכוד בתוך microchannel. ( ה ) בועות אוויר לכודים בתוך microchannels. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

קובץ משלים 1: Pattern_Design.dwgריק "> אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.

למחברים אין מה לחשוף.