מאמר שיטה

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

DOI:

10.3791/55869

⸱

27 ביולי 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים תאיים רבים אינטראקציה עם משטחי קרום להשפיע על תהליכים תאיים חיוניים. אינטראקציות אלו יכולות להיות מכוונות כלפי רכיב שומנים מסוים בתוך קרום, כמו במקרה של phosphoinositides (PIPs), כדי להבטיח לוקליזציה תת-תאית ספציפית ו / או הפעלה. PIPs ותחומים PIP מחייב הסלולר נחקרו בהרחבה כדי להבין טוב יותר את תפקידם פיזיולוגיה הסלולר. אנו להחיל assay pH אפנון על bilayers השומנים הנתמכים (SLBs) ככלי ללמוד אינטראקציות חלבון PIP. במחקרים אלה, phosphatidylethanolamine אורתו רגיש pH -Sulforhodamine B מצומדות משמש לזיהוי אינטראקציות חלבון-PIP. על מחייב של חלבון על משטח קרום המכיל PIP, פוטנציאל interfacial מאופנן ( כלומר שינוי pH המקומי), הזזת מצב פרוטוניון של בדיקה. מחקר מקרה של שימוש מוצלח של assay אפנון pH מוצג באמצעות phospholipase C delta1 Pleckstrב Homology (PLC-δ1 PH) תחום ו phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) אינטראקציה כדוגמה. קבועה דיסוציאציה לכאורה ( K ד, App ) עבור אינטראקציה זו היה 0.39 ± 0.05 מיקרומטר, בדומה K , ד ערכים שהושגו על ידי אחרים. כפי שנצפה בעבר, תחום PLC-δ1 PH הוא PI (4,5) P 2 ספציפי, מראה מחייב חלש יותר כלפי phosphatidylinositol 4-phosphate, ולא מחייב טהור phosphatidylcholine SLBs. ה- PIP על שבב assay הוא יתרון על פני מבחני PIP מחייב המסורתית, כולל אך לא מוגבל נפח מדגם נמוך ולא ליגנד / קולטן תיוג דרישות, היכולת לבדוק אינטראקציות קרום גבוה זיקה נמוכה זיקה עם קטן ו מולקולות גדולות, ושיפור האות לרעש יחס. לפיכך, השימוש בגישה PIP-on-a-chip יאפשר הבהרה של מנגנונים של מגוון רחב של אינטראקציות קרום. יתר על כן, שיטה זו עלולה להיות uSed בזיהוי תרפויטים המווסתים את יכולתו של החלבון לקיים אינטראקציה עם ממברנות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות מרובות תהליכים ביוכימיים מתרחשים על משטחים נוזל מימדי דו מימדי. אורגניזמים בממברנה בתאים אאוקריוטים ייחודיים לא רק בתהליכים ביוכימיים ובפרוטאומה הקשורה אליהם, אלא גם בהרכב השומנים שלהם. מחלקה יוצאת דופן אחת של phospholipids היא phosphoinositides (PIPs). למרות שהם מהווים רק 1% של lipidome הסלולר, הם ממלאים תפקיד מכריע transduction האות, autophagy, וסחר קרום, בין היתר 1 , 2 , 3 , 4 . זרחון דינמי של קבוצת הראש inositol על ידי קינאזות PIP הסלולר מעורר שבעה קבוצות ראשיות PIP כי הם מונו, bis, או tris-phosphorylated 5 . בנוסף, PIPs מגדירים את הזהות התת-תאית של הממברנות ומשמשים כאתרי עגינה מיוחדים לממברנות / אנזימים המכילים פוספוינוס אחד או יותרתחומים מחייב, למשל, Pleckstrin הומולוגיה (PH), Phox הומולוגיה (PX), epsin N- מסוף הומולוגיה (ENTH) 6 , 7 . אחד התחומים הנחקרים ביותר PIP מחייב הוא phospholipase C (PLC) -δ1 PH תחום זה באופן ספציפי אינטראקציה עם phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) בתוך טווח גבוה nromomolar נמוך מיקרומטר טווח זיקה 8 , 9 , 10 , 11 .

מגוון של שיטות איכותיות וכמותיות במבחנה פותחו והשתמשו כדי ללמוד את המנגנון, התרמודינמיקה, ואת הספציפיות של אינטראקציות אלה. בין מבחני ה- PIP המחוברים הנפוצים ביותר הם תהודה של פלסמון על פני השטח (SPR), קלורימטרי איזותרמי (ITC), ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), הצפת ליפוזום / אסאי משקעים, כתמי שומנים (כתמי שומן / רצועות PIP)12 , 13 . למרות אלו הם בשימוש נרחב, לכולם יש חסרונות רבים. לדוגמה, SPR, ITC ו- NMR דורשים כמויות גדולות של מדגם, מכשור יקר ו / או כוח אדם מיומן 12 , 13 . כמה פורמטים assay כגון נוגדנים מבוססי ליפידים כתמים לנצל מים מסיסים צורות של PIPs ולהציג אותם בצורה לא פיזיולוגיים 12 , 14 , 15 , 16 . בנוסף, כתמי שומנים לא ניתן לכמת באופן מהימן והם הביאו לעתים קרובות תצפיות כוזבות / שליליות כוזבות 12 , 17 , 18 . כדי להתגבר על אתגרים אלה ולשפר על הכלי הנוכחי להגדיר, שיטה חדשה ללא תווית הוקם מבוסס על השומנים נתמך bilayer (SLB) בהקשר של am פלטפורמה icrofluidic, אשר הוחל בהצלחה במחקר של אינטראקציות חלבון PIP ( איור 1 ) 19 .

האסטרטגיה המשמשת לגילוי אינטראקציות חלבון PIP מבוססת על חישה אפנון pH. זה כרוך צבע רגיש-pH כי יש B Ortho -Sulforhodamine (o SRB) מצומד ישירות לקבוצת ראש השומנים phosphatidylethanolamine 20. O SRB-POPE בדיקה ( איור 2 א ) הוא פלואורסצנטי מאוד ב pH נמוך ו הרווה ב pH גבוה עם pKa סביב 6.7 בתוך 7.5% מול PI (4,5) P 2 המכיל SLBs ( איור 5 ב ). תחום ה- PLC-δ1 PH נעשה בהרחבה לאימות מתודולוגיות של חלבונים-PIP, בשל הייחודיות הגבוהה שלו כלפי PI (4,5) P 2 ( איור 5 א ' ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25 .לפיכך, הנחנו כי תחום ה- PLC-δ1 PH יכול לשמש לבדיקת המחיצה ל- PI (4,5) P 2 דרך ה- PIP-on-a-chip. השתמשו במחקר זה יש מטען חיובי נטו (PI 8.4), ובכך מושך OH -. יונים (איור 5 ג) עם קשירה PI (4,5) P 2 SLBs המכילים, תחום PH מביא את OH - יונים אל משטח הממברנה, אשר בתורו מודולציה פוטנציאל interfacial משמרות מדינת protonation של o SRB-האפיפיור (איור 5 ג) 26. כפועל יוצא של ריכוז תחום PH, הקרינה הוא רווה (איור 6 א). לבסוף, הנתונים המנורמלים הוא כדי להתאים את הזיקה של PH-PI (4,5) P 2 אינטראקציה ( איור 6 ב , 6 ג ).

במחקר זה, פרוטוקול מפורט מסופק לבצע חלבון מחייב PIP המכילים SLBs בתוך פלטפורמה microfluidic. פרוטוקול זה לוקח את הקורא מ הרכבה את המכשיר microfluidic הכנה שלפוחית ​​כדי היווצרות SLB וחלבון מחייב. בנוסף, ניתנים הוראות לניתוח נתונים כדי לחלץ מידע זיקה עבור האינטראקציה PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניקוי זכוכית Coverslips

  1. לדלל ניקוי 7x פתרון (ראה טבלה חומרים ) 7-פי עם מים deionized ב 100 מ"מ עמוק בורוסיליקט צלחת זכוכית עם תחתית שטוחה לחמם אותו עד 95 מעלות צלזיוס על צלחת חמה ברמה במשך 20 דקות או עד פתרון מעונן מתבהר .
    הערה: הפתרון יהיה חם, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פציעות גופניות. פתרון ניקוי 7x הוא תערובת קניינית של hexasodium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] oxyphosphoryl] פוספט, 2 (2-butoxyethoxy) אתנול, נתרן 1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutane -2-sulfonate ותוספות לא מסוכנים.
  2. באמצעות פינצטה, לארגן את coverslips (40 מ"מ אורך x 22 מ"מ רוחב x 0.16-0.19 מ"מ גובה) על מכתים אלומיניום מדף לסירוגין כיוונים. שמור נקודה ריקה בין coverslip כל כדי למנוע מהם נוגעים זה בזה.
  3. לגמרי להטביע את המדף מכתים עם coverslips בפתרון ניקוי. שמור את coverslips בהפתרון עבור 1 h.
    הערה: כמו המים מתאדה, לשמור על הוספת מים deionized טריים כדי לשמור על ריכוז הפתרון ללא שינוי.
  4. קח את המדפים מכתים מתוך פתרון ניקוי ולשטוף את coverslips עם כמויות רבות של מים deionized להסיר את חומר הניקוי.
  5. יבש coverslips עם גז חנקן (כ 5 דקות לכל מדף מכתים), ולאחר מכן למקם coverslips בכבשן עבור 6 שעות ב 550 מעלות צלזיוס עבור חישול.
    הערה: זהו צעד מכריע אשר מחליקה תכונות גסות על משטח הזכוכית.
  6. מניחים את coverslips במיכל פלסטיק ולשמור אותם הרחק אבק.

2. בודה Micropatterned PDMS בלוקים

  1. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) prepolymer ואת סוכן ריפוי ב 10: 1 (w / w) יחס פלסטיק גדול לשקול סירה degas אותו ואקום עבור 1 שעות עם כוח ואקום ב 500 טור או פחות.
    הערה: PDMS הוא פולימר סיליקון שקוף ואינרטי. כדי לקבל את לחסום PDMS הרצוי לא(0.5 ס"מ), לערבב 55 גרם של prepolymer עם 5.5 גרם של סוכן ריפוי.
  2. מניחים את יחידת הסיליקון המכיל מספר משכפל של micropattern SU-8 אותו בקוטר גדול (10 ס"מ בסיס) פלסטיק לשקול סירה ויוצקים PDMS degassed. לאחר מכן, לרפא אותו בתנור יבש ב 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: Micropatterns הם גדולים מספיק כדי להיראות בעין בלתי מזוינת. כל תבנית מכילה 8 microchannels (100 מיקרומטר רוחב x 40 מיקרומטר גובה x 1 ס"מ אורך) עם המרווח 40 מיקרומטר בין ( איור 1A , 1B ). עובש סיליקון עובש המורכב קשה אפוי SU-8 photoresist היה מפוברק במתקן nanofabrication 27 . גישות אחרות להכנת האב כוללות חומצה הידרופלואורית (HF) תחריט, טמפרטורת מים בטמפרטורה גבוהה, xurography, והדפסה 3D 28 , 29 , 30 , 31 . CommercIal מקורות להכנת אבץ סיליקון יכול לשמש גם. הדפוסים של המכשיר microfluidic תוכנן עם תוכנת שרטוט (ראה טבלה של חומרים). הקובץ המקורי המכיל את תבנית העיצוב מסופק כקובץ משלים "תבנית Design.dwg", אשר ניתן לספק ישירות ליצרן.
  3. בעדינות, לקלף את PDMS מאסטר הסיליקון עם הידיים. סמן את הגבולות של כל micropattern במלבנים באמצעות מנתח כירורגי וסרגל. לאחר מכן, לחתוך את PDMS לתוך בלוקים.
  4. אגרוף 16 חורים (8 מפרצון 8 שקעים לכל בלוק) בשני הקצוות של כל microchannel עם אגרוף ביופסיה (1.0 מ"מ חור בקוטר) כפי שצוין באיור 3 ב .
  5. החל קלטת על כל בלוק PDMS כדי להגן על micropatterns מפני נזק ואבק. אחסן אותם במיכל פלסטיק.

3. הכנת קטן Unilamar שלפוחית ​​(SUVs)

הערה: שלילי שליטה bilayer הרכבהוא 99.5 mol% 1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (POPC) ו 0.5% mol יָשָׁר Sulforhodamine B-1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine (o SRB- אַפִּיפיוֹר). הבדיקה bilayer הרכב הוא 92.0 mol% POPC, 0.5 mol% o SRB-POPE, 7.5% מול של או L-α-phosphatidylinositol-4-Posphate (PI4P) או L-α-phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate (PI ( 4,5) P 2 ). להלן הליך להכנת 92.0 mol% POPC, 0.5 mol% o SRB-POPE, ו 7.5 מול% PI (4,5) P 2- SUVs המכילים. הסינתזה של o SRB-האפיפיור השתמשו במחקר זה היה בעבר תיאר 20.

  1. לחשב את עוצמת הקול של POPC, PI (4,5) P 2 , ו- o SRB-POPE אשר צריך לערבב, אשר מהווה את הסכומים הבאים: 2.22 מ"ג של POPC, 0.26 מ"ג של PI (4,5) P 2 , ו 2.1 x 10 -5 מ"ג של האפיפיור SRB o.
  2. פיפטה נפח מחושב של POPC, PI (4,5) P 2 , o SRB-POPE לתוך בקבוק יחיד 20 מ"ל בקבוק נצנץ.
    הערה: פתרונות POPC ו- O -SRB-POPE מגיעים בפתרון של כלורופורם, ואילו PI (4,5) P 2 (ופוספויוסיטידים) מגיע במלאי ממיצוי: כלורופורם: מתנול: מים (20: 9: 1). לקבלת דיוק, רטוב קצה פיפטה עם כלורופורם לפני השימוש בו. עבור בטיחות, שלב זה צריך להתקיים בתוך מכסה המנוע קטר כימי.
  3. יבש את התערובת בזרם של גז חנקן בתוך מכסה המנוע כימיים קטר במשך 10 דקות או עד המאייד מתאדים סרט סרט שומנים דק בתחתית הבקבוקון.
  4. לתמצת את התערובת תחת ואקום עבור ≥ 3 בשעה כוח ואקום של 10 mTorr להסיר כל שאריות אורגני ממס.
    הערה: 3 שעות זמן יובש מספיק בקנה מידה של הכנה SUV המתואר בפרוטוקול זה, אשר מתאים ל -50 ניסויים. אם בקנה מידה גדול יותר של הכנה SUV נדרש, ייבוש לילה יכול להתבצע.
  5. Rehydrate את ד"רIed ליפיד הסרט עם 5 מ"ל של חיץ פועל (20 מ"מ HEPES, 100 mM NaCl, ב pH 7.0) ומניחים אותו באמבט קולי בתדר הפעלה של 35 קילוהרץ במשך 30 דקות ב RT.
    הערה: ערבוב כמויות השומנים המפורטים בשלב 3.1 והוספת 5 מ"ל של חיץ פועל בשלב 3.5 מניב השעיית השעיה ב 0.5 מ"ג / מ"ל. בשלב זה, ההשעיה שלפוחית ​​הוא שילוב של unilamellar ו multilamellar שלפוחית ​​( איור 2 ב ). הפתרון יופיע בצבע ורוד / סגול ועכורים יחסית.
  6. הקפאה להפשיר את ההשעיה שלפוחית ​​עם חנקן נוזלי אמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס כדי לקבל שלפוחית ​​unilamellar. חזור על ההקפאה להפשיר 10 פעמים.
    הערה: (אופציונלי) כדי להבטיח את היעדר unilamellar שלפוחית ​​ההשעיה, צעד צנטריפוגה ניתן להחיל 32 , 33 .
  7. Extrude ההשעיה שלפוחית ​​דרך 0.10 מיקרומטר מסלול חרוט פוליקרבונט פוליקרבונט באמצעות extruder השומנים (ראהטבלה של חומרים) כדי להעשיר עבור SUV. חזור על הבלטה 10 פעמים.
    הערה: צינור חרוטי 15 מ"ל ניתן להשתמש כדי לאסוף את שלפוחית ​​extruded. הפתרון צריך להיות ריק של עכירות בשלב זה. קוטר SUV ניתן לאשר באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) ( איור 2 ג ). רכבי השטח הם המתאימים ביותר ליצירת SLBs 34 .
  8. מכסים את צינור חרוטי עם רדיד אלומיניום לאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.

4. הרכבת המכשיר Microfluidic

  1. בדוק את פתחי הכניסה של שקע PDMS לחסימה על ידי מתיז מים deionized דרך החורים באמצעות בקבוק לשטוף מים. לאחר מכן, יבש את בלוק PDMS עם גז חנקן.
    הערה: צעד זה גם להסיר כל חלקיקי אבק שאולי היה לכוד בתוך ו / או בין הערוצים. במידת הצורך, dedust מראש ניקוי coverslips עם גז חנקן כדי להסיר כל חלקיקי אבק.
  2. מניחים את PDMS לחסום מראש לנקות(ראה טבלה 1) בתוך מערכת פלזמה חמצן (ראה טבלה של חומרים) תא המדגם לחשוף עם פלזמה חמצן עבור 45 שניות עם הגדרת כוח ב 75 וואט, מהירות זרימת החמצן ב 10 ס"מ 3 / min, כוח ואקום ב 200 mTorr .
  3. מניחים את פני השטח בדוגמת לחסום PDMS במגע עם coverslip מיד לאחר הטיפול פלזמה חמצן. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר באתרי קשר.
  4. מניחים את המכשיר על צלחת חמה ברמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי לשפר את מליטה.
  5. השתמש רטוב מוך חינם לנגב ( למשל kimwipe) עם אתנול 100% להסיר כל חלקיקי אבק מהחלק העליון (PDMS) ואת התחתון (זכוכית) של המכשיר. לאחר מכן, הקלטת את המכשיר על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית.
    הערה: אין להשתמש בכמות מופרזת של אתנול ולמנוע אתנול להיכנס לערוצי הכניסה והשקע. ביצוע שלב זה בעוד המכשיר עדיין חם מומלץ על מנת להבטיח אתנול מתאדה מיד. זכוכית micrOscopy שקופיות ניתן לאחסן בפתרון אתנול 100% כדי להסיר אבק ומזהמים אחרים.

5. יצירת Blayers שומנים נתמכים (SLBs)

  1. העברת 100 μL של PI (4,5) P 2 המכילים SUVs משלב 3.8 לתוך צינור microcentrifuge 0.65 מ"ל. התאם את ה- pH של הפתרון ~ 3.2 על ידי הוספת 6.4 μL של 0.2 N חומצה הידרוכלורית.
    הערה: לאשר את ה- pH של הפתרון עם מטר pH מצויד בדיקה מיקרו pH (ראה טבלה של חומרים).
  2. פיפטה 10 μL של ה- pH מותאם SUV פתרון לתוך כל ערוץ דרך כניסת ולהחיל לחץ דרך פיפטה עד הפתרון מגיע לשקע. לנתק את קצה מהפיפטה ולהשאיר אותו מחובר למכשיר.
  3. חזור על השלב הנ"ל עבור כל ערוץ ולאחר מכן דגירה המכשיר למשך 10 דקות ב RT.
    הערה: הזרקת שלפוחית ​​לתוך microchannels צריך להתבצע מיד לאחר הרכבה המכשיר.
  4. גזור סטים של כניסת מפרצון צינורות EACh 60 ס"מ (צינורות מפרצון) ו 8 ס"מ (צינורות מוצא) ארוך, בהתאמה.
    הערה: חיתוך צינורות באלכסון ויצירת קצה חד, מקל להכניס את צינורות לתוך פתחים שקעים. צינורות מוצא צריך להיות בצורת קשת. אורך צינורות כניסת עשוי להשתנות בהתאם להגדרת המיקרוסקופ. הקוטר הפנימי של הצינור הוא 0.05 ס"מ.
  5. באמצעות פינצטה, לחבר את צינור מוצא למכשיר, ולאחר מכן הקלטת המכשיר על הבמה מיקרוסקופ.
  6. לצלול סוף אחד של צינורות כניסת כניסה 25 מ"ל של חיץ פועל הכלול צינור חרוטי קלטת זה כדי לוודא כי הצינור מאובטח.
  7. מניחים את צינור חרוטי על קרקע גבוהה יותר (~ 20 ס"מ) מאשר המכשיר כדי לדחוף את הפתרון דרך microchannels באמצעות זרימת הכבידה; שקע במעבדה ניתן להשתמש כדי להשיג זאת.
  8. עבור כל צינור מפרצון, להשתמש מזרק לצייר 1 מ"ל של חיץ פועל מהקצה החופשי של הצינור. הסר את קצה פיפטה מן כניסת ולהכניס אתסוף חינם של כניסת צינורות לתוך המכשיר.
    הערה: הכניסו טיפה של חיץ פועל על המפרק כדי להפחית את ההסתברות של בועה אווירית לתוך הערוץ במהלך שלב זה. לאחר צינור הכניסה מחוברת למכשיר, השתמש במחק ללא מוך כדי להסיר את המאגר עודף.
  9. חזור על השלב לעיל כדי לחבר את כל חלקי צינורות הכניסה למכשיר.
    הערה: זרימת חיץ פועל דרך הערוצים מסייעת להסיר שלפוחיות עודף לאזן את bilayer לתנאים ניסיוניים.
  10. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים). בחלונית השמאלית, לחץ על הכרטיסייה "מיקרוסקופ" ובחר את "10X" המטרה.
  11. לחץ על "Live" ולאחר מכן "Alexa 568" סמלים התמונה על סרגל הכלים. באמצעות הכפתורים בסדר התאמה כמובן, להתמקד microchannels.
  12. סרוק דרך ההתקן כדי לבדוק את האיכות של SLBs והערוצים ( איור 8 ). לאחר מכן,לחץ על סמל "Shutter Closed" סגור בסרגל הכלים.
  13. לחץ על הכרטיסייה "רכישה", תחת "התאמות בסיסיות" בחר "זמן חשיפה". הגדר את זמן החשיפה ל - "200 ms".
  14. בחלונית השמאלית, לחץ על "רכישה רב ממדית" ותחת תפריט המסננים בחר את הערוץ האדום (מסומן "Alexa 568"). לאחר מכן, לחץ על "זמן לשגות" בתפריט, להגדיר את מרווח הזמן ל 5 דקות, משך עד 30 דקות, ולחץ על "התחל".
    הערה: בהתבסס על משך (30 דקות) ואת קצב הזרימה (~ 1.0 μL / min), 30 μL של חיץ פועל משמש כדי לאזן את SLB בתוך ערוץ, כלומר 240 μL של חיץ פועל משמש לכל 8 ערוצים.
  15. בחר בכלי 'מעגל' שמתחת לכרטיסייה 'מדידה' וצייר מעגל בכל ערוץ. לחץ לחיצה ימנית בזמן שהמעגל נבחר ובחר "מאפיינים". תחת "פרופיל" הכרטיסייה, לבדוק "כל T" כדי להציג אתעוצמת הקרינה כפונקציה של זמן.
    1. ודא עקומה זו מגיעה הרמה, אשר מציין שיווי משקל, לפני שתמשיך לשלב הבא.
  16. הנמך את תמיסת המאגר לקרקע שוות כמכשיר כדי לעצור את הזרימה.
  17. שמור את הקובץ לשגות זמן.

6. אינטראקציה תחום PH בדיקת PLC-δ1 עם PI (4,5) P 2 המכילים SLBs

  1. הכן דילולים של תחום PH באמצעות המאגר פועל כמפחית.
    הערה: מכיוון שיש שמונה ערוצים בתוך המכשיר, השתמש לפחות שניים מהם עבור פקדים ריקים. בחר את הקצוות הרחוקים בכל צד ולהשתמש בערוצים הנותרים עבור דילולים חלבון. ריכוזי ה- PH הבאים נבדקו: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 ו- 2.50 מיקרומטר. כ 200 μL של דילול כל היה מספיק כדי להגיע שיווי המשקל בתוך 30 דקות.
  2. אחד בכל פעם, לנתק כל צינור מוצא ולהחיל 200 μL של דילול כל חלבון לתוךאת ערוץ מוצא באמצעות פיפטה. אין להפעיל לחץ כלשהו, ​​תן כוח הכבידה לעשות את העבודה. לנתק את קצה מהפיפטה ולהשאיר אותו מחובר למכשיר microfluidic.
  3. חזור על השלב הנ"ל עבור כל ערוץ ולוודא כי בועות אוויר לא הציג לתוך הערוצים במהלך תהליך זה.
  4. מנמיכים את צינורות מפרצון לקרקע מתחת למכשיר microfluidic להתחיל לזרום את החלבון דרך microchannels. קלטת את הקצה החופשי של הצינור למיכל פסולת. תזרים דילולים חלבון למשך 30 דקות.
    הערה: זה יהיה להפוך את זרימת ולאפשר החלבון להיות הציג לתוך הערוצים. הזמן כדי equilibration ונפח של דילולים חלבון הצורך יהיה תלוי הזיקה של האינטראקציה.
  5. בחלונית השמאלית של התוכנה, תחת לשונית "זמן לשגות", לחץ על "התחל" כדי להתחיל הדמיה שוב.
  6. חזור על הצעד 5.15 כדי להגיע לשיווי משקל בטוח. כאשר הניסוי הושלם, שמור את הזמן לשגותקוֹבֶץ.

7. הערכת קרום הממברנה

הערה: פלואורסצנטי לשחזר לאחר Photobleaching (FRAP) ניסויים צריך להתבצע עם אצווה חדשה של רכבי השטח ו coverslips זכוכית נקי כדי להבטיח כי SLBs הם נוזל.

  1. בצע את ההליך לניקוי coverslips זכוכית (1.1-1.6), בודה micropatterned בלוקים PDMS (2.1-2.5), הכנת SUVs (3.1-3.8), הרכבה של המכשיר microfluidic (4.1-4.5) ויצירת SLBs (5.1-5.17) כמו בעבר מְתוּאָר.
  2. פוקוס המיקרוסקופ על bilayer, להגדיר את זמן החשיפה 200 ms, ואת binning ל 1.
  3. תמונה להלבין נקודה מעגלית באמצעות 532 ננומטר, 2 לייזר לייזר MW (רדיוס 13 מיקרומטר). מיד לאחר photobleaching, להתחיל לכידת סדרה של תמונות כל 3 שניות עבור 45 הראשון, ואחריו מרווח של 30 למשך שארית הזמן (15 דקות משך כולל). לאחר רכישת הנתונים הושלם, שמור את הקובץ זמן לשגות.
  4. בחר את מולבן אRea באמצעות כלי ציור מעגל לחלץ ערכים עוצמת הקרינה כפונקציה של זמן. בנוסף, בחר שני אזורים נוספים בקרבת מקום, אחד המתאים לאזור לא צמוד ואחד המתאים לאזור ללא SLBs.
  5. חישוב התאוששות פלואורסצנטי ( y ) באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    הערה: כאן F t מייצג את עוצמת האזור המולבן כפונקציה של הזמן, F אני מייצג את עוצמת הקרינה לפני הלבנה (השתמש "1" כערך מנורמל במקרה זה); F 0 הוא עוצמת הרקע.
  6. Plot התאוששות הקרינה (ציר y) כפונקציה של זמן (ציר x) כדי ליצור עקומת FRAP. לאחר מכן, להתאים את הנתונים לפונקציה מעריכי יחיד כדלקמן,
    figure-protocol-2
    הערה: כאן מייצגת את השבר נייד k הוא קבוע הקינטי עבור החלק הנייד, המשמש לחישוב מחצית הזמן להתאוששות ( t 1/2 ):
    figure-protocol-3
  7. השתמש t 1/2 לחשב את קבוע דיפוזיה ( D ):
    figure-protocol-4
    הערה: כאן R מייצג את רדיוס קרן הלייזר (13 מיקרומטר). קבוע דיפוזיה עבור bilayer נוזל צריך להיות ≥ 1.0 מיקרומטר 2 / s.

8. נתוני עיבוד

הערה: שגרת ניתוח הנתונים תהיה תלויה במיקרוסקופ, תוכנת עיבוד תמונה, ואת התוכנה מתאים עקומת בשימוש.

  1. פתח את הקבצים לשגות זמן של לפני (משלב 5.17) ואחרי (מ 6.6 שלב) טיטרציה תחום PH. עבור אל המסגרת האחרונה של כל קובץ זמן לשגות ולעשות סריקה קו על פני כל microchannels להשיג את fluorescEnce נתוני עוצמת כפונקציה של המרחק בפיקסלים ( איור 6 א ). להעביר את הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני.
  2. עבור כל microchannel (לפני ואחרי PH תחום בנוסף), מדגם כמה נתונים בתוך הערוץ ואת צדי הערוץ המייצג את הבסיס ( איור 7 א ).
    הערה: עוצמת הקרינה ערוץ ריק צריך להישאר ללא שינוי. כל הערוצים האחרים הם מנורמל לערוץ ריק, ולכן זה חיוני יש שני ערוצים ריקים ולוודא כי עוצמות הקרינה שלהם להישאר עקבית אחד עם השני.
  3. החל את הנוסחה שלהלן כדי לנרמל את הנתונים לערוץ הריק; חישוב מדגם מסופק באיור 7 ב .
    figure-protocol-5
    הערה: כאן ΔF חלבון מייצג את עוצמת הקרינה מופחתת רקע של ערוץ חלבון, Δ, F ריק מייצג את עוצמת הרקע הקרינה מופחתת של הערוץ הריק, מראש לכתוב מתייחסים לפני ואחרי צעדים טיטרציה חלבון, ו α מייצג את גורם תיקון שהוא היחס בין עוצמות הקרינה של ערוץ חלבון הערוץ הריק ([ F חלבון / F ריק ] מראש ) בשלב טרום חלבונים. מאז עוצמת הקרינה פוחתת כפונקציה של ריכוז תחום PH, נתונים מנורמל יהיה שלילי ערך.
  4. באמצעות תוכנה עקומת הולם (ראה טבלת חומרים ), העלילה הקרינה מנורמל כפונקציה של ריכוז תחום PH ו בכושר האיזותרמה Langmuir ( איור 6 ג ):
    figure-protocol-6
    הערה: כאן ΔF מייצג את השינוי בעוצמת הקרינה ביחס לשינוי המרבי בפלו( ΔF max ), בעוד ש- K d, מייצג את קבוע הדיסוציאציה, השווה לריכוז החלבון ( [PLC-δ1 PH] ), שבו כיסוי של 50% קרום מאוגד מורכב) מושגת. זהו שיווי משקל מבוסס מחייב מדידה כך הנתונים מנורמל מתאים ל isherm Langmuir פשוט לחלץ פרמטר ניסיוני לכאורה K ד, App . בהתבסס על התוכנה הולם K D, App עבור PLC-δ1 PH-PI (4,5) אינטראקציה P 2 הוא 0.39 ± 0.05 מיקרומטר ( איור 6 ב ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו assay אפנון pH ללמוד את PLC-δ1 PH תחום PI (4,5) P 2 אינטראקציה בתוך מיקרופרוויס PIP על שבב ( איור 1 ). באמצעות פרוטוקול מפורט, אנחנו הוכיחו כיצד להכין ולהרכיב רכיבים המכשיר microfluidic, לעשות קטן שלפוחית ​​unilamellar (SUVs) ( איור 2 ), טופס SLBs בתוך המכשיר ( איור 3 ), וחלבון נבדק מחייב PIP המכילים SLBs. תרשים זרימה של ניסוי טיפוסי של SLB ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל חלופה PIP, אם כי בריכוזים נמוכים, נמצא על פני השטח cytosolic של האברונים ספציפיים שבו הם תורמים להקמת הרכב פיזי ייחודי סגוליות תפקודית של קרום organellar 1 . אחד השימושים החשובים ביותר של PIPs הוא כמו פלטפורמת עגינה ספציפית עבור שפע של חלבונים המחייבים לוקליזציה subcellular ספציפיים ו / או הפעלה 6 , 7 . בשל תפקידם בפיזיולוגיה של תאים ומחלות, היכולת ללמוד אינטראקציות חלבון-PIP במבחנה , בה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DS ו CEC נתמכו, בין היתר, על ידי מתן AI053531 (NIAID, NIH); SS ו- PSC נתמכו על ידי מענק N00014-14-1-0792 (ONR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<כיסוי>חזק
זכוכית חזקה: מלבניםפישר סיינטיפיק12-544B22 x 40 x 0.16 - 0.19 מ"מ, מס' 1 1/2; בורוסיליקט זכוכית
7X תמיסת ניקויMP ביומדיקל976670חומר ניקוי
PYREX קורנינג כלים מתגבש3140-190צלחת זכוכית בורוסיליקט עם תחתית שטוחה; קוטר x גובה (190 x 100 מ"מ); מפיץ: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2כבשן
שםחברה>מספר קטלוגיComments
>PDMS
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning4019862פולידימתילסילוקסן (PDMS); מפיץ: Ellsworth Adhesives
PYREX DesiccatorVWR89134-402מדורג בוואקום
Harris15110-10Harris Uni-Core; קוטר 1.0 מ"מ; אגרוף ביופסיה של מילטקס עם בוכנה (Cat. מס' 15110-10) יכול לשמש כאלטרנטיבה<
חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
<חזק>התקן<>
ניקוי פלזמהPlasmaEtchPE25-JWדו-שלבי משאבת ואקום שמן הנעה ישירה, שירות O2 (Krytox Charged)
מדדפלטה חמה דיגיטליתH3760-Hנרכש דרך Denville Scientific (Cat. מס '1005640)
מיקרו שקופיות חלביותVWR48312-003חלביות, נבחרות ונקיות מראש; עשוי מזכוכית שוויצרית; עובי: 1 מ"מ; מידות: 75 x 25 מ"מ; GR 144
Name<strong>CompanyCatalog NumberComments
Mold
AutoCADAutodeskv.2016תוכנת שרטוט לעיצוב מסכת צילום
CAD/Art ServicesN/Aעיצוב עם רקע שחור ותכונות ברורות הודפס ברזולוציה של 20k dpi על מסכה שקופה (5 x 7 אינץ') על ידי CAD/Art
Services Silicone WafersUniversity Wafer1575Prime Grade, צד יחיד מלוטש; קוטר 100 מ"מ (4 אינץ'); 525 אום עובי
SU-8 50MicroChem Corp.לא ישיםגוון שלילי פוטו-רזיסט; נכס מתקן ננו-ייצור של פן סטייט
SU-8 מפתחתMicroChem Corp./APenn State Nanofabrication Facility Property
NameCompanyCatalog>Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphateAvanti Polar Lipids840045XPI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046XPI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850757CPOPE; נדרש לסינתזה של oSRB-POPE
ליסמין רודמין B סולפוניל כלוריד (איזומרים מעורבים)ThermoFisher ScientificL-20ל-pH oSRB-POPE
(oSRB-POPE)סינתזהשל N/A(Huang D. et al. 2013)
בקבוקון נצנוץ זכוכיתVWR66022-065קיבולת נפח 20 מ"ל
Aquasonic 250DVWRN / Aאמבט מים אולטרסאונד
ממברנות חרוטות מסלולWhatman110605ממברנת פוליקרבונט; קוטר: 25 מ"מ; גודל נקבוביות: 0.1 אום; מפיץ: Sigma-Aldrich
ChloroformVWRCX1054-6HPLC
כיתה LIPEX ExtruderTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 מ"ל מכבש Thermobarrel
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/Aפיזור אור דינמי; מתקן קריסטלוגרפיה רנטגן של פן סטייט נכס
שםחברהCatalog NumberComments
Data Analysis
GraphPadPrism GraphPad Softwarev.6תוכנה להתאמת עקומה לניתוח נתונים
שםחברהמספר קטלוגיהערות
מיקרוסקופ
Axiovert 200M מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיקרל זייס מיקרוסקופN/Aמיקרוסקופ
AxioCam MRm מצלמהקרל זייס מיקרוסקופיהמצלמתN/A
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/Aמקור אור
Alexa 568 סט מסנניםCarl Zeiss מיקרוסקופיהN/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 תוכנהCarl Zeiss MicroscopyN/Aתוכנת עיבוד תמונה
שםחברה מספר קטלוגיComments
אחר
טיפיםVWR10034-132200 uL טיפים לפיפטה; קצה דק וחלק למריחת תמיסת החלבון לתוך התעלה המיקרופלואידית
טיפיםVWR53509-07010 קצות פיפטה uL; קצה דק וחלק למריחת תמיסת השלפוחית לתוך התעלה המיקרופלואידית
Orion Star A321 מד pHThermo ScientificSTARA3210מד pH
Orion micro pHבדיקה Thermo Scientific8220BNWPמיקרו pH
בדיקה N-(2-הידרוקסיאתיל)-פיפרזין-N'-(2-חומצה אתנסולפונית)VWRVWRB30487HEPES, חומצה חופשית
נתרן כלורידVWRBDH8014-2.5KGRצינורות NaCl
חוטיבעלות הברית & כבלTFT-200-24 Nקוטר פנימי: 0.020-0.026 אינץ' (0.051-0.066 ס"מ); עובי דופן: 0.010 אינץ' (0.025 ס"מ); צינורות גמישים בעלי דופן דקה; גז
חנקן בצבע טבעי - תעשייתיPraxairN/Aספק מקומי
חמצן - תעשייתיPraxairN/Aספק מקומי
חנקן נוזליPraxairN/Aספק מקומי
אגרוף ביופסיה חזקמערכתN נדרש לסינתזה של בדיקת שומנים פלואורסצנטית רגישה פנימית גז

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158(2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1(2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PIP on a chippHPH C45

מאמרים קשורים