מאמר שיטה

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית העכבר הרזולוציה על קוליים כדי לסייע הזרקה תוך-עיני במחקר ריפוי גנטי ברשתית

DOI:

10.3791/55894

⸱

2 בנובמבר 2018

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנחנו מדגימים גישה מוזרה לשימוש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (HR-SD-אוקטובר) כדי לסייע משלוח של סוכנים טיפול גנטי לחלל subretinal להעריך את פעולתה אמיתיות, לאפיין את קולט אור חיוניות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-אוקטובר מנוצל כדי לעקוב אחר ההתקדמות של ניוון קולט אור במודלים של העכבר בשידור חי, להעריך את המסירה של סוכני טיפולית לחלל subretinal, וכן להעריך רעילות והיעילות ויוו. HR-SD-אוקטובר משתמשת ליד אור אינפרא-אדום (800-880 ננומטר) ויש אופטיקה במיוחד המיועד של אופטיקה ייחודי של העין העכבר עם רזולוציה צירית sub-2-מיקרון. העכבר הטרנסגניים מודלים של ניוון הרשתית החיצונית (קולט אור) ופקדים היו עם תמונה כדי להעריך את התקדמות המחלה. Microneedles זכוכית משך שימשו כדי לספק זריקות ברשתית sub של adeno-הקשורים וירוס (AAV) או חלקיקים (NP) דרך בגישה טרנס-scleral, טרנס-חיבור. מיצוב זהיר של המחט לתוך מרחב subretinal נדרשה לפני זריקה מכויל ללחץ, אשר מספק נוזלים לחלל תת ברשתית. ניתוח subretinal בזמן אמת נערך על הרשתית שלנו מערכת (RIS) הדמיה. HR-SD-אוקטובר הפגינו מתקדמת ניוון הרשתית אחיד עקב ביטוי רעילים מוטציה האנושי מוטציה אופסין # רודופסין (P347S) transgene (RHOP347S) בעכברים. HR-SD-OCT מאפשר כימות קפדני של כל השכבות ברשתית. השכבה החיצונית גרעינית (גרת) בעובי ואת קולט אור מדידות אורך (OSL) קטע החיצוני לתאם עם קולט אור חיוניות, ניוון או הצלה. מערכת משלוח RIS מאפשר הדמיה בזמן אמת של זריקות subretinal במחלקת יולדות (~ P10-14) או עכברים בוגרים, ו- HR-SD-אוקטובר מיד קובע ההצלחה של משלוח ומפות המכסים איזורים. HR-SD-אוקטובר הוא כלי רב עוצמה שיכול להעריך את ההצלחה של הניתוח subretinal בעכברים, בנוסף כדי מדידה החיוניות photoreceptors vivo בתוך. HR-SD-אוקטובר יכול לשמש גם כדי לזהות אחיד גדודים בעלי חיים כדי להעריך את היקף ניוון הרשתית, רעילות, והצלה טיפולית בתוך הגן פרה טיפול מחקרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חוקרים מפתחים ג'ין טיפולים למגוון רחב של מחלות ניוון רשתית ברשתית עם התקוות של הריפוי לתרגם טיפולים עבור מחלות אנושיות1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ובזמן תחום או תחום ספקטרלי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (SD-אוקטובר) נעשה שימוש כדי לחקור את ההיבטים של ניוון הרשתית החיצונית במודלים של העכבר ספציפיים של המחלה12,13,14 . HR-SD-אוקטובר לא, לעומת זאת, היה נרחב בשימוש בהקשר של אופטימיזציה של הערכה של מודלים העכבר כדי לקבוע את שיעור ואחידות המרחבי של ניוון הרשתית, או בהקשר של הערכת פרה ג'ין מבוסס הרפוי, לדוגמה, ל להעריך הצלה, רעילות או להיקף המרחבי של וקטור משלוח8,15,16. פעם דוגמנית העכבר מאופיין באופן מלא, הנתונים HR-SD-אוקטובר יכול לשמש משאב מקיף ואמין כדי למדוד את ההשפעה של הרפוי להפעיל חילוץ או רעילות במודלים של העכבר של ניוון הרשתית17. קבוצות רבות משתמשים הזרקת subretinal כשיטה של וקטור משלוח בשל היעילות שלה-transducing photoreceptors, תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית. עם זאת, זה עדיין שיטה קשה להתמחות, בהתחשב בכך שזה נעשית בדרך כלל על ידי ניתוח סגנון חופשי ממשטח הקרנית, כרוך לעיתים קרובות עם קטרקט, דימום, לא מכוונות detachments ברשתית מתרחשים על-ידי מניפולציה של הצד האחורי בזגוגית. קבוצות רבות עדיין ניסיון זריקות subretinal בצורה עיוורת ולספק את הווירוס באמצעות זריקות ידנית עם קוטר גדול יחסית פלדת אל-חלד מחטים (34 גר')8,17,18,19 ,20,21,22, ואת מספר שימושים טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) הדמיה כדי לאשר מסירה נכונה של וקטור רשתית8,17, 20 , 22. כמה שיפורים בשיטה לאחרונה תוארו באמצעות מחטים microscale מונע על ידי micromanipulator22.

אנו מציגים גישה אינטגרטיבית אשר מסייע מיקום המחט, הזריקות הן בהנחייתם של ophthalmoscope מותאם אישית סטריאו מכוונת תוכנן במעבדה במיוחד להמחשת בתוך העין קטן של העכבר17, 23. השימוש זכוכית משך מחטים מיקרו בשיתוף עם micromanipulator stereotaxic לספק שליטה טובה יותר של מיקום המחט ללא חיתוך כירורגי למטה נדרש (קרי, דרך conjunctivae, רקמת חיבור) לפני זריקה. השימוש של הלחץ מוסדר מזרק מיקרו מסייע לספק הזרקת עקבי אמצעי אחסון ולאחר הזרקת יכול להיעשות עם יציבות גדול בהרבה, דיוק, איטית יותר מאשר זריקות ידנית המבוצעת על ידי מזרק ידניים, ובכך להקטין מופע של הזרקת קצף לתוך העין. המחט קטן עוזר למנוע את זליגת בעקבות הנסיגה המחט שהנתיב אינו עצמית איטום. כדי להעריך את היקף הזרקה/מסירה, קבוצות חקירה רבות להסתמך על מציאת הערכת מידת אמיתיות פלורסצנטיות ירוק משופרת ביטוי חלבון (EGFP) ברשתית (לבנות ביטוי מועברים על ידי וקטור) בסוף ניסיוני הצבע (המתת חסד) כדי לאשר זריקות מוצלחות11,19,20,24. זה מתקרב (אינו מנצל OCT) כדי לוודא הצלחה ניתוחי מבזבז כמות עצומה של משאבים בעלי חיים, ושעת פרוצדורלי כירורגי מאז כל החיות עם כשלים כירורגי (לא ידוע) צריך להיות מתוחזק, ואחריו עם מידות החוזרות על עצמן עד המתת חסד ועין הקציר (כאשר EGFP נמדדת). אישור על המיקום של הזרקת ברשתית ניתן לשפר באמצעות HR-SD-OCT כדי להדגים כי הזרקת ממוקם בין שכבות הנכון של הרשתית (כלומר החלל subretinal). HR-SD-אוקטובר יכול לשמש גם כדי מיד ניסחו נסיונות כושלים (כישלונות כירורגי) לזהות את המשתנים הרלוונטיים בזמן אמיתי כירורגית כדי לשפר את הגישה. מצאנו כי HR-SD-אוקטובר מספק יתרונות רבים בגן פרה לימודי טיפול על-ידי מתן ראפיד הערכה כמותית של ניוון הרשתית החיצונית, המאפשר זיהוי/ליקוט של מחקר בבעלי חיים אשר אינם עומדים בקריטריונים ניסיוני ( למשל, הזרקת subretinal שגוי), וכדי לכוון ומעקב הדמיה לאזור העין איפה וקטור נמסרה (אפקט פרה איפה הכי סביר), כמו גם לשלוט אזורים שבהם לא נמסרה וקטור. מאז התפתחותו, השימוש SD-אוקטובר המשיכה להיות מקובלים, משמשים חוקרים אופתלמולוגיה ונחשב כיום התקן של הדמיה ברשתית במחקרים מדעיים רשתית העכבר או מכרסם מודלים13,25. HR-SD-אוקטובר ויכולות התוכנה שלה נוצלו בדרכים משולב ייחודי כדי לקדם את המטרה של ריפוי גנטי כמותי מוצלחת במודלים של העכבר בכל שלב בתהליך, כולל הבחירה במודל חיה, אפיון מנוון הנבחר מחלת מודלים, משלוח טיפולית, מיפוי של וקטור משלוח והערכה רעילות/יעילות. השימוש של HR-SD-OCT מאפשר גילוי התרופה יעילה יותר בכל רמה של התהליך. כאן נתאר גישות אלה המשמשים בתוכנית שלנו גילוי תרופות ה-RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים בבעלי חיים היו שנסקרו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש ועדות של HCS יורד את VA והאוניברסיטה באוניברסיטה-באפלו. חיות שימשו בהתאם לאמור של האגודה לחקר חזון, רפואת עיניים (ארוו), את הצהרת הלסינקי.

1. עכבר מודלים

  1. לזהות העכבר מודלים להערכה כולל פקדים.
    הערה: הדמיה בוצע עבור C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, מודל ניוון רשתית העכבר humanized חלקית homozygous עבור האדם מוטציה רוP347S hC1 אללים-הפראי-סוג (WT) העכבר רו+ + גנוטיפ26 , 27, hC1 x BL/6(J), מודל humanized חלקית עם עותק יחיד של מוטציה האנושי רוP347S hC1 אלל על העכבר WT רו+ + גנוטיפ (hC1 /-/ / mWT/mWT) (מתקבל על ידי מעבר hC1/hC1 / / mWT/mWT עם C57BL/6 ( J) עכברים). מעל אוטוזומלית דומיננטית רטיניטיס פיגמנטוזה (adRP) הן על רקע C57BL/6(J). דגם עכבר כי הוא homozygous על שני עותקים של הגן WT רו אנושי על העכבר רו נוקאאוט הרקע היה גם בשימוש28,29. הקו הזה הוא על רקע 129Sv. כאשר הקו הזה היה חצה עם פצצה רו העכבר על רקע 129Sv, מנה אחת של האדם רו מתרחשת על רקע רו העכבר.
  2. לשמור על החיות בעקבות התנאים הקשורה הנבחנים.
    הערה: החיות היו שמרו ב וטרינרי רפואי יחידה (VMU)-HCS יורד VA. העכברים קיבלו צ'או מעבדה רגיל ו- h h:12 מתחת לגיל 12 מבוגר אור: אורות עם 300 לאקס ברמה כלוב-˚F כ 72 לבנים, מחזורי כהה עם תקורה פלורסנט רך.

2. העכבר ג'ל לאזור העיניים

  1. הכינו את הג'ל אופטי המשמש הדמיה ברשתית30 של ניתוחים.
  2. לשלב משקל מולקולרי גבוה של 2 מ"ג/מ"ל w/v (4 x 106 גר'/מול carbomer עקר 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS).
  3. מערבבים בטמפרטורת החדר עד הג'ל יוצר ג'ל שקוף אופטית צמיגה.
  4. להעביר את הג'ל לתוך בקבוקים סטריליות, צנטריפוגה ומפרידה שולחן מתנדנד דלי ב g 350 x כדי להסיר בועות אוויר לכוד.
  5. להחיל את הג'ל ישירות על הקרנית ליצור ממשק בין הקרנית העכבר פרימיום כיסוי זכוכית (18 מ מ x 18 מ"מ).

3. בית-SD-אוקטובר הדמיה

  1. לראות את המכשיר HR-SD-אוקטובר (איור 1).
  2. שוקלים את החיה כדי לקבוע את המינון הנכון של תרופות להרדמה. לאחר מכן עזים ומתנגד העכבר באמצעות 25 µL גרם של משקל הגוף של הפתרון 2.5% של 2,2,2 במאגר-tribromoethyl אלכוהול (Avertin) פתרון באמצעות בקרום הבטן הזרקת (IP), להוסיף שטיפות העיניים להתרחב התלמידים לאחר החיה. הוא מרותק למיטה.
  3. לאשר החיה הוא מורדם לחלוטין על ידי צביטה הבוהן, ותהיה בטוח שבעל החיים אינו מגיב.
  4. לקצץ את שפם, מקם את העכבר על המזחלת HR-SD-אוקטובר.
  5. מקמו את העין של העכבר ישירות מול העדשה סליחה ולטפל הפקדים שלב עד ה קרנית וה איריס ממוקמים. שמור את הקרנית להתייבש על-ידי החלת דמעות מלאכותיות.
    הערה: Micromanipulators התאמת משובח על המזחלת HR-SD-אוקטובר משמשות מיקום העכבר כך הצמצם התלמיד הוא במרכז, מונחה. ראש אופטי מתקדם ואז עד הרשתית הופך לגלוי החיה מכוונן נוסף כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר האפשרית.
  6. ראשית, לפתוח את התוכנה "העכבר" ולחץ על "החולה/מבחן". שנית, לחץ על "הוסף את החולה" והזן את המידע הרלוונטי כדי לזהות את החיה החולה בחלון חדש, "שמור וצא". שלישית, לחץ על "הוסף מבחן" ואחריו "התחל מבחן". רביעית, לחץ על "הוסף סריקה מותאמת אישית", בחר "אחסון מלבנית", לבחור יתר או OS עבור העין להיות עם תמונה ולאחר מכן לחץ על "הוסף את הבחינה". לבסוף, להתחיל מכוון המכשיר והמיקום את החיה כדי להשיג את האזור של ריבית. לאחר מציאת האזור הנכון, להסיר את כל הנוזלים העודפים ממשטח העין בעזרת כותנה סטרילי משופעת המוליך בדיוק לפני ייבוא תמונות כדי לשפר עוד יותר את איכות התמונה ולאחר מכן לחץ על התחל בזק, אם מתקבל דימוי טוב, לחץ על "שמור סרוק".
    הערה: פרמטרים אופייני לתמונות HR-SD-אוקטובר מלבני 900-סריקות/b-סריקה הינם 90 b-סריקות/תמונה. תמונות נרכשות הן 1.4 מ"מ x 1.4 מ"מ. האזור של הרשתית עם תמונה תלוי בניסוי מסוים, אבל רוב התמונות מרוכזים על ראש עצב הראייה (ONH).

4. הערכת את נוכחות קצב, אחידות של מודל Degenerations ברשתית החיצוני

  1. ניוון הרשתית החיצונית הערכת דגם HR-SD-אוקטובר
    1. להשיג חיות עם קשת רחבה של גילאים עבור שליטה והן נושאים ניסיוני כדי להעריך את נוכחות קצב, אחידות של ניוון הרשתית החיצונית.
    2. לבצע הדמיה HR-SD-אוקטובר על בעלי חיים מרובים בכל גיל של שני גדודים (מחלה, רגיל). השתמש בשיטה המתוארת בעלון 3.1.6 כדי לקבל את התמונות OCT.
      הערה: ניתן לאסוף נתונים מתוך קבוצה גדולה של חיות בבת אחת, אשר ההפצה ימי הולדת המתפרסות על-פני פרק זמן (1 שנה) רחב, או קבוצה קטנה של בעלי חיים יכול לשמש כדי לאסוף תמונות מרובות על פני תקופה ארוכה של זמן (1 שנה) כדי להשיג תוצאות דומות.
    3. לפתוח את תמונת אמצעי אחסון מלבנית HR-SD-אוקטובר נרשם, ולזהות את הסריקה-b הראשונה שברצונך למדוד (אידיאלי יכללו את ONH או ציון לזיהוי אחרים) מן ההרכב של תמונות. להגדיל את התמונה כדי שתמלא את המסך באמצעות תכונת הזום בתוכנה.
    4. פתח מספר מחוגה הרצוי על-ידי לחיצה ימנית על התמונה של הסריקה b ו ולחיצה על "מאוזנים" סוף סוף לחיצה על מחוגה רבים לפי הצורך (הם ממוספרים מ-1 עד 10). ודא כי הרכיבים מאוזנים מופיע בפינה הימנית התחתונה של התמונה. באמצעות התכונה "קביעת תצורה של Caliper", להקצות להם כמו "אנכי" זווית בלוק בעמודה, הפעל את "המיקום Caliper התצוגה" כדי להקל על השמה אחיד על פני הרשתית, לבסוף, לחץ על החל.
      הערה: Caliperst 1 להניחה על הצד השמאלי של התמונה בעת עיבוד אוקולוס (OD) דקסטר עין ימין, 1סט קליפרים של צריך להיות ממוקם בצד ימין של התמונה בעת עיבוד הדימויים עין שמאל אוקולוס (OS) מאיים. התוצאה מסיכת לכיוון הטמפורלי של כל הנתונים עבור שתי העיניים ימינה ושמאלה בעת התוויית.
    5. שימוש בעכבר המחשב, לעבור כל caliper למיקום הרצוי (2.0 מ מ אחד מהשני) על פני b-הסריקה, הקפד למקם caliper אחד במרכז של ראש עצב הראייה, תמונות b-scan לכלול אותה (מוגדר caliper הזה אפס). ואז להשתמש בעכבר כדי ללחוץ ולגרור את caliper אורך כדי להתפרס באזור עניין. הגדר באופן שרירותי מחוגה לא כיסוי מדיד מחוזות b-scan כדי האורך המרבי, ולא להתעלם במהלך ניתוח הנתונים.
    6. למדוד את עובי גרת באמצעות הכלים Caliper, על ידי הצבת העליון של caliper קרום המגביל חיצוני (אלם), בתחתית caliper בתחתית השכבה החיצונית plexiform (OPL). חזור על הפעולה עבור כל caliper על פני הרשתית-0.2 מ מ והפרשים קבועים. שמור את המידות.
    7. לאחר כל מחוגה יש כבר הניח, מותאם לגודל, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על "שמור נתונים Caliper".
    8. חזור על המידות עוקבות b סריקות (כל 10בתאנון סריקה טוב עובד) מאמצעי האחסון מלבני באותה תמונת OCT המתפרסות על-פני הרשתית כולו מן נחות לאזורים מעולה. מחוגה תישאר פתוחה, באותו מיקום על ציר ה-x. להתאים את האורך של הרכיבים מאוזנים מבלי להזיז אותם X-כיוון.
    9. פתח שמור קבצי נתונים על-ידי לחיצה על סמל קובץ קטן ליד b-הסריקה מעובד תמונה ולחץ על "ללכת על נתונים". לחץ על "תאריך השתנה כדי לסדר את הקבצים לפי סדר בהתבסס על זמן נשמר ולפתוח כל הקבצים עבור כל סריקה-b נמדד.
    10. בצע הידור הנתונים הגולמיים של כל b-סריקה לתוך קובץ בודד מהנמוכה הגבוה ביותר בהתבסס על מספר מסגרת. בחר את העמודות של נתונים כולל "Caliper שם", "משך" ו- "מרכז X".
    11. ודא המרכז X זהה עבור כל b-סריקות נמדד עבור כל תמונה OCT נפח מלבני מעובד. מחיקת נתונים כלשהם מחוגה ששימשו לא להקליט מדידות והגדר את caliper הממוקם במרכז של ראש עצב הראייה לאפס.
    12. להתוות את הנתונים עבור X לעומת מספר ערכות נתונים Y כדי לקבל פונקציה מגרש תלת-ממד כדי להתוות את עובי הכוללת גרת או אחר שנמדד שכבה ברשתית.
    13. השווה גרת המידות בין שליטה חיות ניסוי עם הגילאים המתאים כדי לקבוע את קצב ואת אחידות בכל ההשתלות פוטנציאליים.
    14. חזור על התהליך עבור מדידות OSL באמצעות אותן תמונות b-scan. בצע את המתודולוגיה אותו נהגו למדוד את גרת, למעט הצבת הרכיבים מאוזנים בין קרום אלם אנד של ברוך (מוניטור).
      הערה: דוגמה כיצד למקם את caliper מוצג במקטע תוצאות נציג (איור 3ב). זה צריך להיעשות על תמונה מוגדלת ב כדי להקטין את השגיאה.
    15. חזור על ניתוח הנתונים לבעלי מרובים עבור כל יום הולדת עבור שנינו ניסיוני, שליטה גדודים.
  2. מקיף מדידה ומיפוי תלת-ממד של עובי גרת או OSL באמצעות הכלי מחוגה תוכנה
    1. סקור את התמונות OCT של הזרקת פוסט ובצע כל ציוני דרך לזיהוי, כמו ONH או כלי הדם ברשתית. אז הצב את העכבר כדי לקבל המשך טיפול SD-אוקטובר באותו האזור, הקפד לכלול ציוני לזיהוי באותה הדרך.
      הערה: ודא כי האזור של הרשתית עם תמונה, מעורב את הרשתיות מזוהה של תמונות הזרקת SD-אוקטובר פוסט. תמונת אמצעי אחסון מלבנית SD-אוקטובר להקליט ולשמור אותו.
    2. לעבד תמונות מוקלטות כמתואר לעיל צעדים 4.1.3. כדי 4.1.14. שמור את הנתונים caliper ואת מגרש כמתואר לעיל.
      הערה: מערך כתוצאה של מדידות גרת משמש ליצירת מגרש 3D המתארים את עובי גרת. המיקום של הרכיבים מאוזנים לאורך ציר ה-x מאפשרים לאדם replot על הגרף הצבת עצב הראייה על המקור (0) לאורך ציר ה-x. ציר ה-y מותווים באמצעות מספר b-scan, עצב הראייה משמש לאחר מכן כדי להגדיר את נקודת ההתחלה, המאפשר למצב כראוי את עצב הראייה על המקור בציר ה-y. זיהוי עצב הראייה של כל ערכת נתונים מאפשר מעקב תמונות ייושר באופן אמין.
  3. מיפוי היקף ההזרקה על גבי התמונה הפונדוס
    1. לבצע פוסט הזרקת נפח מלבני OCT כדי לאשר את ההצלחה של הזריקה. יש להשתמש בשיטה המתוארת ב 3.6.
    2. השתמש בתכונה Caliper בתוכנה לזיהוי נקודת פיתול בגבול של הרשתית מנותקת ממספר b סריקות המתפרסות על-פני התמונה OCT כולה. השתמש בשיטה כדי לפתוח מחוגה המתוארים 4.1.4.
    3. להקליט את התמונות הפונדוס עם המיקום ממופה של OCT b-סריקה, מיקום caliper המתאים בתמונה הפונדוס, התואם למיקום שלו.
    4. בצע הידור כל התמונות הפונדוס לתוך תמונה מורכבת, כולל את העמדות caliper, כשהתוצאה היא מפה מדויקת של ההזרקה על גבי התמונה הפונדוס (למשל בסעיף התוצאות נציג, איור 5א).

5. תוך-עיני זריקות

הערה: פרטים על השימוש RIS בהמשך פירט מחקר האחרונות23.

  1. הכנת מחטים הזרקת זכוכית
    1. אוטוקלב צינורות קפילר זיריהם בקבוצות קטנות, באמצעות מחזור יבש.
    2. השתמש הגדרת תוכנית אשר יפיקו טיפ זכוכית עם הזווית החדה, קוטר בטווח של 2-5 מיקרומטר והגדוד פיפטה.
      הערה: תוכנית שלב דגימת 5 אשר הפיק מחטים יעיל על פולר פיפטה שלנו מוצג בטבלה 1.
    3. אחסן את המחטים זכוכית משך בצנצנת מחט סטרילית פיפטה בטמפרטורת החדר.
  2. למלא את המחט הזרקת הפתרון הרצוי עבור הזרקה
    1. לטעון את המחט לתוך למחזיק המחט, עוזב כ "5/8 בולטות שמעבר לקצה של בעל.
      הערה: א מרחק של פחות מ- 5/8 זה יהיה קשה להגיע הפתרון הזרקת כדי למלא את המחט, כי בעל מחט אינה מתאימה בקלות לתוך הפתח של צינורות 0.2 מ"ל. כמו כן, יש את המחט בולטות יותר מ- 5/8 תוצאות תנודה גדולים משמעותית או נקיפת של הקצה, מקשה על הדמיה בזמן אמת מאז הטיפ משאיר את מטוס מוקד או את שדה הראיה (FOV), תוך ניסיון ניקוב העין.
    2. להכין את הפתרון הזרקת בשפופרת סטרילי 0.2 מ"ל. להוסיף 1:10 דילול של fluorescein סטרילי סולפט (10 מ"ג/מ"ל ב- 1 x PBS) לפתרון של הזרקת בריכוז הסופי של fluorescein-1 מ"ג/מ"ל.
      הערה: הצבע המדויק נעשה שימוש ספציפיים למשתמש, יכול להיות דבר שהוא רעיל וגלוי לעין בתאורה אור לבן כדי לעזור להקל על המיקום המדויק של קצה המחט ברמה של RPE ומרחב subretinal.
    3. דמיינו את המחט דרך המיקרוסקופ סטריאו תוך שימוש בידית הבקרה של micromanipulator 3-ציר כדי למקם את המחט כך שיהיה מיושר עם המרכז של הצינור המכיל הפתרון הזרקת כדי לשמש ממלא את המחט.
    4. לנהוג בזהירות קצה המחט לתוך הצינור 0.2 מ"ל, עד קצה המחט הוא שקוע בתוך הנוזל. לצייר את עוצמת הקול הרצוי של הזרקת נוזל (למשל 1 µL) לתוך המחט הדרושות זריקה אחת. לשמור על הפתרון הנותרים בצינור הכניסו קרח.
  3. הכנת החיה להזרקה
    הערה:     המיקרוסקופ RIS נשמר נקי והוא מערכת ללא מגע. הצלחת חימום מכוסה משטח נקי adsorbent, מחטים בלוק לפני נמשכת. לאחר שהם נמשכים על ידי רצועה מתכת מחוממת עצמית לחיטוי, הם שמרו על תא סטיריליים סגור המיועד להכיל זכוכית משך מחטים. המחטים מטופלות רק באמצעות הידיים בכפפה, טיפול משמש למניעת לגעת את קצה המחט בזמן זה גובר לתוך למחזיק. הפתרונות מוזרק מוכנות תוך שימוש סטרילי טכניקה, והם נבדקו עבור זיהום על ידי ומבטא מדגם של ההכנות וירוס על פלטות אגר LB המקננת בהם במשך הלילה-הלעפה תרוטרפמט 37.
    1. שוקלים את החיה (g) כדי לקבוע את המינון המתאים של שיכוך כאב הרדמה.
    2. לנהל הרדמה (2.5% תמיסת כוהל 2,2,2 במאגר-tribromoethyl (Avertin)) באמצעות בקרום הבטן הזרקה (IP).
    3. מיד להחיל תרופות אנטיכולינרגיות (למשל, cyclopentylate) בשתי העיניים להתרחב לתלמידים.
    4. לקצץ שפם של החיה, מספר החיה באמצעות ניקוב האוזן או שיטה אחרת.
    5. לשטוף את העין ואת האזור שמסביב עם betadine מדולל.
      הערה: להימנע מקבלת כל פתרון סביב האף, כמו התוצאה יכולה להיות לא מכוונת טובע.
    6. הצב העכבר על משטח חימום, ומתוחזק על הלעפה תרוטרפמט 39, קליי מחזיק של המעצב מעוצבת מראש עכבר עם העין כדי להיות מוזרק לעבר המחט.
    7. ודא שהעכבר אינו מגיב באמצעות מבחן קמצוץ של כף הרגל האחוריות.
  4. ביצוע הזרקת subretinal
    1. השתמש זוג מלקחיים איריס בוטה סטרילי לזירוז בעדינות proptosis של כדור הארץ על-ידי הצבת קצות המלקחיים-7 ו- 10 o ' שעון עמדות על בעפעפיים תוך דחיפת פתוח וכלפי מטה באותו זמן.
    2. השתמש המלקחיים לפתות את העפעפיים תחת העולם העין לשמור אותו מהחשמל במהלך תהליך ההזרקה.
      הערה: בעלי חיים בן 10 עד 14 ימים לעיתים קרובות תקיים את העין מהחשמל בקלות רבה יותר מאשר בעלי חיים בוגרים.
    3. לכוון את קצה המחט כ 1-1.5 מ מ מתחת לקצה של לימבוס הקרנית, בזהירות לנהוג את זה לתוך העין דרך הלחמית, עד שהיא יוצרת גומה scleral כפי המחט חודרת לתוך הרקמה בסקלרה, מאפשר מניפולציה של העין.
    4. לסובב את העין כלפי מטה עם micromanipulator כדי להמחיש את הדיכאון scleral דרך האישון מורחבים עם המיקרוסקופ סטריאו RIS.
    5. החל טיפת ג'ל עיניים סטרילי או 1 x PBS פתרון ולכסות עם coverslip עקר.
    6. מתמקדים הדיכאון scleral שנוצרו על-ידי קצה מחט (2-5 מיקרומטר) והעברה כונן המחט עד לשיא חדה של הרשתית הטפסים באתר הזרקת.
    7. לסובב את המחט באמצעות בעל עד הקצה משעמם דרך בסקלרה, fluorescein במחט מוצגת מתחת הרשתית בסביבה הקרובה של טפט תאי RPE.
    8. כונן את קצה המחט אז היא סוטה העולם ולאחר מכן הפעל את משאבת הזרקה עם המתג דוושת רגל.
    9. לאחר האחסון הרצוי נמסרה (0.5-1 µL) למרחב subretinal, לשלוף את המחט ולבדוק אם bleb יציב, את הנוזלים אינה דולפת מהאתר בהזרקה, אשר הוא הקריטריון הראשון של זריקה מוצלחת.
      הערה: שמירה על קוטר עצה נכונה (2-5 מיקרומטר קוטר) הוא קריטי כדי למנוע זליגות ההזרקה.
    10. במקום החיה על פלטפורמת הדמיה של המכשיר OCT. בצע את ההוראות HR-SD OCT הדמיה כדי להקליט תמונת אמצעי אחסון מלבנית.
    11. לאשר כי הנוזל מוזרק ממוקם בחלל subretinal, ולשמור את התמונות לצורך קביעת היקף bleb.
    12. הסר את החיה ממחזיק ולהחיל סכום נכבד של אנטיביוטית לעיניים מוזרק.
    13. במקום החיה על גבי כרית החימום עד שהוא לחלוטין משחזרת, ולאחר מכן למקם אותו בחזרה לתוך הכלוב המקורי. מאיפה זה הגיע.
      הערה: החיות שלנו מוזרקים בדרך כלל לפני הגמילה, לכן בעלי החיים צריך להחזיר את הכלוב עם האמא.
  5. מיפוי היקף bleb subretinal באמצעות כלי תוכנה מכשיר OCT.
    1. להשיג תמונת OCT אמצעי אחסון מלבנית, תוך שימוש בשיטות שתוארו לעיל, של bleb ומקם אותה כדי לכלול נקודת ציון לזיהוי בתוך העין כמו ONH.
      הערה: הקלטה 90 b סריקות עובד טוב זמן התגובה. ממפה את bleb, אך יכול לשמש בהתאם הרזולוציה הרצויה.
    2. להוסיף caliper יחיד של הדמות ומניחים אותו על נקודת פיתול איפה הרשתית לניתוק מן RPE דמית העין.
      הערה: התוכנה ממפה אוטומטית נקודה המקביל לקו על גבי התמונה הפונדוס המייצגים את caliper b-הסריקה חישובו.
    3. ללכוד את המסך בעקבות הצבת הרכיבים מאוזנים, ולעבד את התמונות למפות ביעילות על גבול bleb הזרקת על גבי התמונה הפונדוס, הממפה בדיוק ההזרקה. לשמור את התמונה הידור לעיון לסייע באיתור אזורי עניין במהלך ומעקב הדמיה.
      הערה: לחלופין, הנתונים caliper ניתן לשמור נענו, המותווה באמצעות שיטה דומה עבור ערכות נתונים תלת-ממדיים ההתווייה של עובי גרת.
  6. הזרקת Intravitreal
    1. מניחים את קצה המחט באמצעות ניתוח בגישה דומה כמו זריקה ברשתית sub, חוץ מזה המחט מונעת לחלוטין דרך בסקלרה- pars plana כ 0.25 מ מ מאחור את הקרנית לימבוס ולתוך את הזגוגיות.
    2. בעקבות מיקום המחט, להחיל את הדופק הזרקה עם דוושת רגל.
      הערה: דיפוזיה מהירה של לצבוע fluorescein ברחבי הזגוגיות של עיינית הוא ציין, ממלא את הצמצם תלמידו מורחבים עם זריחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת את הנוכחות, קצב ואת אחידות של ניוון הרשתית החיצונית מודל
מדידות של גרת נרשמו מ- OPL בוקיצה, הגדרת גבולות גרת באמצעות הכלי caliper הניתנים התוכנה כלי נגינה. המטרה הייתה למפות את ההתקדמות של ניוון הרשתית החיצונית במודל של עכברים adRP humanized חלקית. תמונות דומות בין עכבר C57BL/6(J) הבקרה של mWT hC1/hC1 / / / דגם העכבר mWT, המבטאת שני עותקים של הגנים אופסין (RHOP347S) רוד האנושי מוטציה, הוצגו שהפגינו הממצאים ברשתית שליטה והן אלה של חמור, במהירות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-אוקטובר מספק שיטה פשוטה פלואורסנציה פוטנציאליים מודלים חייתיים של מחלות אנושיות כדי לקבוע את התועלת שלהם בבדיקת פוטנציאל הרפוי. היכולת לאפיין במהירות ובאמינות מודל בעלי פוטנציאל של מחלות אנושיות חיוני לתהליך של גילוי תרופות טיפוליות (למשל, ריפוי גנטי חלופי, ריפוי גנטי תמונות ציפורים ריבוזים או shRNA, ריפוי גנטי משולב). HR-SD-אוקטובר מספק שיטה פשוטה, מהירה, לא פולשנית להערכת בריאות הרשתית יכול לשמש כדי לאפיין ולעקוב אחר ההתקדמות של ניוון רשתית במודל עכבר כמעט בכל. הדימויים OCT יכול לשמש כדי להשיג את המידות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יחסים מסחריים: MCB: כלום; JMS: אף אחד. רשתית הדמיה מערכת (RIS)23 השתמשו במחקר זה הוא מכשיר הרומן של שימוש משמעותי לקבוצה כלשהי המבקשים לבצע מחקרים משלוח של טיפול גנטי עכברים, מכרסמים או חיות קטנות. בעוד המחברים אין התנגשויות להכריז לגבי המכשיר הזה בשלב זה, אוניברסיטת ב באפלו - SUNY וניהול ותיקי יש זכויות הקניין הרוחני ומחפשים עשויים למסחר המכשיר הזה בעתיד.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומר זה מתבסס על עבודה נתמכת, בחלקו, על-ידי המחלקה של ותיקי פרשיות (וי אי), בריאות למינהלה, Office של מחקר ופיתוח (מחקר מעבדה ביו ופיתוח) (מענק הצטיינות VA 1I01BX000669). JMS מועסק, בחלקו, כמו צוות רופא-מדען, רפואת עיניים, על-ידי VA יורד; MCB הוא מועסק, בין השאר, על ידי VA יורד. המחקר שנערך, והוא נתמך בחלקה על ידי, ותיקי המינהל ווסטרן ניו יורק בריאות המערכת (באפלו, ניו יורק). תוכן אינם מייצגים את נופי המחלקה לענייני חיילים משוחררים או ממשלת ארצות הברית. גם נתמך, בחלק גדול, על-ידי NIH/NEI R01 הענק EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 להעניק EY016662 (UB חזון תשתית מרכז, PI: מ' שחיטה, מנהלת מודול ביו-פוטוניקה: JMS), גרנט בלתי מוגבלת כדי המחלקה של רפואת עיניים/אוניברסיטת ב תאו מן המחקר כדי למנוע עיוורון (ניו יורק), ומענק של הקרן Oishei (באפלו, ניו יורק). אנו להכיר את המתנה של הקוP347S hC1 רוהטרנסגניים והעכבר אקסון 1 נוקאאוט רו מ ד ר לם ג'ניס (המרכז הרפואי טאפטס ניו אינגלנד, בוסטון) ולאחר המתנה של המודל transgene NHR-E במדינה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים על העכבר אקסון 2 רו נוקאאוט רקע של ד"ר ג. ג'יין פאראר ו פיטר המפריז (בטריניטי קולג ', דבלין, חמתו).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 מכשיר טומוגרפיה קוהרנטית עינית (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
מערכת הדמיית רשתית (RIS)פנימיתN/A
Stemi 2000C מיקרוסקופZeiss000000-1106-133
P-97 חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSutter Instrument Cop-97
MMN-33 מיקרו מניפולטור Narishige USAMMN-33
PLI-100  מזרק מיקרומכשיר הרווארד64-1736
מחזיק מיקרופיפטה (מסתובב)פנימיN/A
שקע אחסון מיקרופיפטהWorld Precision Instruments Inc.E210
  צינורות נימי זכוכית בורוסיליקט 1.5-1.8 X 100 מ"מ,  הרווארד מנגנון30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
טרט-אמיל אלכוהולSIGMA Aldrich240486-100ML
תמיסת עיניים אטרופין סולפט, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
תמיסת עיניים ציקלופנטולאט הידרוכלוריד, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
משחת ג'נטמיצין סולפט USP, 0.1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
טטרקאין הידרוכלורידבאוש ולומבNDC 24208-920-64
תמיסת עיניים, USP 0.5%באוש ולומבNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
תכשירי וירוסיםViGene /UNCN/A
ננו-מוטות זהבNANOPARTzD12M-850-1.75
פלואורסצאין סולפט AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
כיסוייםפישר סיינטיפיק12-548-A
מלקחייםמילטון18-825
מחטים 30 גודבקטון דיקנסון   מזרקים W11604
בקטון דיקנסון   
חבילת תוכנה BioptigenBioptigenN/A
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
מספריים בקנה מידהמטלר
מכשירים מדויקים
אגרוף אוזנייםNat ' l להקה
CL 100 מקור אורWelch AllynCL100
חנקן גזג'קסון אספקת ריתוךN / A
אמבט מים מחומםNeslabRTE-140
צלחת חימוםבביתN / A
מחצלת חימוםCincinnatti Sub Zero273
מחזיק עכברחימר Plast.i.clay חברת אמריקן ארט קליילא ישים
בטדיןMedLine NDC53329-938-06
אפליקטורים של קצה כותנהCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
כפפות ניטרילVWR89038-272
מכשיר Diagnosys ERG Color DomeDiagnosys Inc.עדשות מגע D125
/A
Diagnosys SoftwareDiagnosys Inc.N/A
Origin 6.1 תוכנהOriginLab Corp.N/A
אלקטרודהOcuscienceF-Thread (DTL) 24 אינץ'
309659בעולם Inאלקטרודות ייחוס

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
  3. Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
  4. Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
  5. Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
  6. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
  7. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
  8. Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).
  9. Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
  10. Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
  11. Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
  12. Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
  13. Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494(2014).
  14. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9(2015).
  15. Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
  16. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).
  17. Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).
  18. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
  19. Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
  20. Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  21. Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).
  22. Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).
  23. Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
  24. Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
  25. Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203(2014).
  26. Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
  27. Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
  28. Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
  29. Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
  30. Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
  31. Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
  32. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  33. Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
  34. Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
  35. Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים