הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

29.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55898

⸱

7 בספטמבר 2017

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

במאמר זה

סיכום

וירוסים שפעת A (IAVs) הם חשובים פתוגנים הנשימה האנושית. כדי להבין את פתוגניות של IAVs וכדי לבצע בדיקות פרה גישות חיסון הרומן, חייתיים מחקה פיזיולוגיה אנושית נדרשים. כאן, אנו מתארים שיטות להערכת iav ב פתוגנזה, התגובות ההורמונאלית, יעילות החיסון באמצעות מודל של העכבר של זיהום.

תקציר

וירוסים שפעת לגרום למותם over 500,000 ברחבי העולם1 והן משויכות תמורת עלות שנתית של 12-14 מיליארד דולר בארצות הברית לבד בהתחשב רפואי ישיר, הוצאות אשפוז, עבודה ההיעדרויות2. מודלים בעלי חיים חיוני בלימודי וירוס (iav ב) שפעת A כדי להעריך פתוגנזה ויראלי, אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, תגובות מערכת החיסון, היעילות של החיסון הנוכחית ו/או רומן גישות כמו גם עלולות. עכברים הם מודל חיה קטנה יתרון כי המערכת החיסונית אבולוציונית דומה לזה נמצא אצל בני אדם, הם זמינים מספקי מסחרי כמו בנושאים זהים גנטית, ישנם זנים מרובים שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי להעריך בסיס גנטי של זיהומים, הם זולים יחסית, קל לתמרן. רוצה להתרכז iav ב זיהום בבני אדם באמצעות דרכי הנשימה, עכברים הם מרדימים קודם לפני חיסון תוך-אפי עם מדבקת IAVs תחת אבטחה נאותה הבלימה. לאחר ההדבקה, בפתוגנזה של IAVs נקבע על-ידי ניטור מדי יום התחלואה (ירידה במשקל הגוף) ושיעור התמותה (הישרדות). בנוסף, ניתן להעריך פתוגנזה ויראלי גם על-ידי הערכת שכפול וירוס העליון (רירית האף) או התחתון בדרכי הנשימה (ריאות) של עכברים נגועים. התגובות ההורמונאלית על זיהום iav ב ניתן להעריך במהירות על ידי דימום לא פולשנית וזיהוי נוגדן משני מבחני שמטרתו גילוי הנוכחות של סה כ או נטרול נוגדנים. כאן, אנו מתארים את שיטות נפוצות כדי להדביק עכברים intranasally (i.n) עם iav ב ולהעריך פתוגנזה, תגובות חיסוניות ההורמונאלית והיעילות הגנה.

מבוא

IAVs הם וירוסים מעטפת מסווג של משפחה Orthomyxoviridae 3. הם מכילים מולקולות RNA חד-גדילי שמונה עם קוטביות שלילית3. בבני אדם, IAVs לגרום מגיפות עונתיים ומגפות מזדמנים של תוצאה חשובה כאשר הרומן הנגיפים מוחדרים את האוכלוסייה האנושית4. יתר על כן, IAVs עונתית מאוד, במהירות מועברים בין בני אדם בהפקת הפסד כלכלי גבוה ברחבי העולם בכל שנה2,5. Iav ב התסמינים כוללים שיעול, גודש באף, חום, חולשה, כאב ראש, אנורקסיה, myalgia, אבל הנגיף גם להפיק מחלה חמורה יותר חולים immunocompromised6. למעשה, ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחשבת כי וירוסים שפעת עונתית לגרום 300,000-500,000 מקרי מוות ברחבי העולם בכל שנה1. ישנם רק שני סוגים של תרופות המאושרות כיום על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) עבור טיפול מונע שפעת וטיפול בבני אדם: מעכבי neuraminidase (NA) (למשל, אוסלטמיביר), חוסמי של הערוץ יון M2 (למשל, amantadine); הופעתה של וירוסים עמידים לתרופות גרסאות זאת, דאגה גוברת. החיסון, לכן, נותרת האפשרות הרפואית הטובה ביותר כדי להגן על בני אדם מפני זיהומים IAVs. עד כה, שלושה סוגים של שפעת חיסונים מורשה ע י ה-FDA לשימוש בני אדם הינם זמינים: חיסונים חלבון רקומביננטי נגיפי hemagglutinin (HA), לא פעיל שפעת חיסונים (IIV), ו- live-הקלוש שפעת חיסונים (LAIV)5, 7. שלושת החיסונים נועדו לגרום תגובה חיסונית אדפטיבית כנגד החלבון HA ויראלי, היעד העיקרי של נטרול נוגדנים נגד IAVs.

דגם העכבר המאומת לימודים iav ב זיהום ויוו

היו בשימוש בבעלי חיים כדי ללמוד, בין היתר, iav ב פתוגנזה8,9,10,11, נגיפי גורמים שתורמים למחלות12 ו/או ויראלי שידור13 ,14, ולא כדי לבדוק את היעילות של חיסונים חדשים או נגיפים סמים9,10,15. עכברים (ס. מאסכאלאס). הם המודל בעלי חיים בשימוש נרחב ביותר לחקר iav ב מכמה סיבות: 1) המערכת החיסונית דומה אבולוציונית כדי להציג את זה בבני אדם; 2) בעלות נמוכה, כולל רכישה בעלי חיים, דיור, רבייה; 3) גודל קטן בקלות לתפעל ולאחסן; 4) השתנות מארח מינימלי כדי לקבל תגובות הומוגניות ותוצאות; 5) ידע רב בביולוגיה עכברים, כולל רצף הגנום; 6) רבים זמינים ביולוגיה מולקולרית ו/או אימונולוגיה ריאגנטים; 7) מדהימה זמין (KO) עכברים ללמוד את התרומה של חלבון נתון המארח על זיהום ויראלי; ו, 8) מספר זנים העכבר, שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי להעריך את בסיס גנטי של זיהומים.

ישנם מספר זנים העכבר זמין כרגע לימודים iav ויוו. גיל, מצב המערכת החיסונית, סקס, זן רקע ועכבר גנטית, כמו גם מסלולים של זיהום, מינון וללחצים ויראלי להשפיע על התוצאה של זיהום iav בעכברים. זנים עכבר הנפוץ ביותר בשימוש במחקר iav ב הם C57BL/6, BALB/C ועכברים, לאחרונה, DBA.2, שכן הם רגישים יותר למחלות iav ב מאשר שני זנים לשעבר16,17,18, 19 , 20. חשוב, התגובה החיסונית גם יכולה להיות שונה בהתאם העכבר זן18,19,20. לכן, חשוב מאוד לשחזר את כל המידע זמין על העכבר על iav ב להתאמץ כדי לבחור את האפשרות הטובה ביותר עבור הניסוי אמור להתנהל.

אמנם מודל בעלי חיים של זיהום ללימודי אין ויוו עם iav ב העכבר, יש להם מספר מגבלות, אשר צריך להיחשב בעיצוב ניסיוני. למשל, מגבלה עיקרית של שימוש בעכברים ללימודי אין ויוו הוא כי IAVs לא מעבירות בין עכברים. לכן, לצורך שידור מחקרים, מקובל יותר מודלים בעלי חיים (למשל, חמוסים או שרקנים) נמצאים בשימוש16,17,21. בנוסף, ישנם מספר הבדלים בין ביטויים iav בעכברים ובבני אדם. בניגוד לבני אדם, עכברים אינם מפתחים חום על זיהום iav; לעומת זאת הם מציגים עם היפותרמיה16,17. בעכברים, שכפול iav ב מרוכז במערכת הנשימה התחתונה (הריאות) ולא דרכי הנשימה העליונות. לפיכך, התקפה אלימה של iav בעכברים הוא לא תמיד מתואם כי ראיתי אצל בני אדם. כליל, בגלל היתרונות עולים על החסרונות מוגבל, העכבר מייצג את המודל החייתי הראשון המשמשים להערכת פתוגנזה נגיפי שפעת, immunogenicity, מגן יעילות במחקרים חיסון, אנטי-ויראלי. יתר על כן, זה לא יהיה קביל מבחינה מוסרית לבצע מחקרים עם iav ב באמצעות מודלים בעלי חיים גדולים ללא ראיות קודמות במודל בעלי חיים קטנים של זיהום iav. כתב יד זה, אנו נתאר כיצד להדביק עכברים intranasally (i.n.) עם iav ב, כיצד לפקח את חומרת והתקדמות של זיהום ויראלי, כיצד לבצע את הניסויים הנדרשים כדי להעריך את תגובות מערכת החיסון ההורמונאלית והיעילות הגנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) את המוסדיים אבטחה הוועדה (IBC) באוניברסיטת רוצ'סטר לרפואה ורפואת שיניים, ועומדים עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של 22 מועצת המחקר הלאומית. המתקנים ואת התוכניות של ביבר חלוקה של מעבדה חיה לרפואה של בית הספר לרפואה, רפואת שיניים הן מוסמכות על ידי הבינלאומי AAALAC ו לציית לחוק המדינה, חוק פדרלי ומדיניות הלאומית המכונים לבריאות (NIH). דרישות דומות צריך להיות מיושם בכל מוסד לדבוק הפרוטוקולים בעלי חיים המתואר בכתב היד.

1-שימוש של חוליות חיות קטנות

הערה: נאות אישי הגנה ציוד ולהצביע נדרש לעבודה עם עכברים. דרישות המינימום כוללים הסרבל חד פעמיות, ערדליים, מצנפת הראש, המסכה וכפפות.

  1. לפי פרוטוקול IACUC, מקום מקסימלית של עכברים 5 בכל כלוב. הפרוטוקול IACUC, המתת חסד עכברים עם שתי שיטות של המתת חסד (השני חייב להיות שיטה פיזית) על מנת להבטיח כי החיה מתים.
    הערה: בניסויים ב אילו iav ב יוערכו התחלואה והתמותה, שאיבדו 20% ממשקל גופם הראשונית נחשבו הגיעו הקצה ניסיוני, ועכברים היו מורדמים עם CO 2, נקע בצוואר הרחם כמו שיטת משני הפיזי. אחוז זה של משקל הגוף עשוי להיות שונה במוסדות אחרים. בפרוצדורות בו נאספים עכברים בריאות, רירית האף לאחר ההדבקה iav ב, עכברים מורדמים עם מנה קטלנית של 2,2,2-tribromoethanol (TBE), על ידי חיתוך ולשננו את הווריד כשיטת משני הפיזי. עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה היו נרכש ומתוחזק במתקן טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר לרפואה ורפואת שיניים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.

2. אבטחה

הערה: בדו ח זה, IAVs נעשה שימוש כדי להדביק עכברים הם נפוצים הותאם עכבר מעבדה מזן שפעת H1N1 ריקו/8/34 A/Puerto (PR8 WT) 22 , 23, טמפרטורה רגיש LAIV variant, PR8 LAIV 8. ביצוע כל ההליכים המערבות iav ב זיהומים (במבחנה או vivo) תרביות תאים, דגימות ביולוגיות, בבטיחות הביולוגי הקבינט תחת רמת אבטחה (BSL)-2 תנאים. לנצל BSL חליפות או בלימה תנאים אחרים אם נעשה שימוש מאוד מידבק זנים iav ב.

  1. נקיים בארון עם חומר חיטוי כלור דיאוקסיד לפני ואחרי ביצוע כל ההליכים ניסיוני המתוארים בכתב היד אבטחה. לעקר כל החומר חיתוך (מספריים, אזמל, לנתח מלקחיים), את מהמגן דאונס לפני ואחרי השימוש שלהם בעקבות המלצות IBC נאותה. ביטול כל החומר מיוצר במהלך ההליכים תחת הנחיות IBC IACUC נאותה.

3. זיהום תוך-אפי

  1. מקום 6 ל- 8-בת נקבה C57BL/6 עכברים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. לארגן ויסמנו את העכבר כלובים עם וירוס ואת המינון בשימוש. לזהות העכברים בכלוב כל באמצעות קוד ניקוב האוזן או בשיטה שאושרו אחר כגון ציור של הזנבות. מקום מקסימלית של עכברים 5 לכל כלוב.
  2. להכין את הדילול של iav ב (פלורסנט ויוצרים יחידות (ffu ב) / עכבר) בתנאים aseptic ב הנפח הכולל של µL 30/עכבר עקר 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS). לשמור את inoculum וירוס על קרח. לחשב את כמות iav ב להוסיף דילול ויראלי עם הנוסחה: ((ffu ב X לכל עכבר/30 µL) x נפח סופי) / מלאי כייל ויראלי.
  3. שוקל העכברים עם מידה ולהקליט את המשקל של כל עכבר (יום 0). החזק את העכבר בעמדה הגבי להרים אותו יתלה בצוואר בין האגודל והאצבע. שתחזיק את הזנב נגד ביד עם אצבע הזרת.
  4. עזים ומתנגד העכבר intraperitoneally (i.p.) עם 240-250 מ"ג/ק"ג של TBE על ידי החדרת המחט סימטרית 2/3 של הצד הימני של הבטן. עצור בקצרה לפני פורש את המחט. להחזיר את העכבר על הכלוב ולהמתין 5 דק
  5. להחיל משחה אופטלמולוגיות סטרילי לעיניים למניעת יובש, בעוד העכבר הוא מורדם. בדוק אם העכבר הוא ומורדמת באמצעות חוסר רפלקס הנסיגה פדלים (קרי, קמצוץ הבוהן). אם עכברים לא מורדם לחלוטין הם תוציא את הוירוס.
  6. כאשר העכבר הוא מורדם לחלוטין, מקם את העכבר recumbency הגבי. הטיפ pipet המכיל 30 µL של inoculum וירוס הנחיר, לאט אך כל הזמן להוציא את הפתרון. להיות בטוח העכבר הוא שאיפת ההכנה על ידי התבוננות על inoculum טיפה נעלמים.
  7. בדוק כי העכבר הוא נושם כמו TBE יכול לדכא את הטמפרטורה וקצב הנשימה. להחזיר את החיה לכלוב למקם אותה ב- recumbency הגבי. לפקח על העכברים עבור סימנים של מצוקה נשימתית, אם ציין, לעזור בעכבר כדי לנשום על ידי החזקת בעלי חיים אנכית, זירוז השפעה מונעת נשימה 24. לפקח על העכבר עד זה להכרה (30-45 דקות אחרי זה היה מורדם).

4. אפיון נגיפי פתוגנזה ( איור 1)

  1. הערכה של תחלואה ותמותה ( איור 1 ואיור 2)
    1. להדביק i.n. 3-4 קבוצות של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה (לפחות 5 עכברים לכל קבוצה, n = 5) עם מינונים 10-fold (10, 10 2, 10 3 ו- 10 4 ffu ב/עכבר) של WT PR8 כמתואר בסעיף 3.
    2. צג ולשקול העכברים עם מידה בימים 14 בערך באותו זמן כדי למזער את משקל וריאציות בשל בליעה מזון. המתת חסד עכברים להפסיד 20% ממשקל גופם הראשונית כמתואר בסעיף 1-
    3. אחרי 14 יום, המתת חסד העכברים לשרוד זיהום ויראלי כמתואר בסעיף 1-
    4. לחשב ויראלי 50% העכבר מנה קטלנית (MLD 50) בהתבסס על הנתונים הישרדות שהושג באמצעות השיטה של ריד, Muench 25. ראשית, לחשב את המרחק פרופורציה (PD):
      figure-protocol-1
      1. הבא, לחשב MLD 50 לפי הנוסחה הבאה:
        figure-protocol-2
  2. הערכה של titers ויראלי בתוך הריאות ורירית האף ( איור 1, באיור 2. )
    1. השחזור של הריאות ורירית האף
      1. להדביק עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה i.n. (n = 6) עם המינון ויראלית כדי לבדוק 10-10 4 ffu של PR8 WT כמתואר בסעיף 3.
      2. לאסוף את הריאות העכבר ואת רירית האף ימים 2 (n = 3) ו-4 (n = 3).
        1. המתת חסד העכברים עם מנה קטלנית (i.p.) של TBE (500 מ ג/ק ג). למקם את החיה recumbency הגבי ולחטא את הפרווה מעל בית החזה עם 70% אתנול. לחתוך את העור עם אזמל של עצם החזה לבסיס של הבטן. לבצע קיצוצים 1 ס מ מבסיס של החתך לאזורים לרוחב של העכברים עם המספריים.
        2. לחתוך את וריד הכבד עם מספריים לדמם את העכבר כשיטת משני המתת חסד. למקם את החיה במיקום הגחון והמתן 2 דקות כדי לאפשר את הדם לנקז. השלב זה חשוב להפחית דם בריאות.
        3. להסיר את העור החלק העליון כל של העכבר (כולל הראש) לבסיס של הבטן איפה החתך הראשון בוצע בעזרת לנתח מלקחיים ומספריים. לחתוך את הראש עם המספריים ולמקם אותו בצלוחית יבשה סטרילית.
        4. לחתוך את צמתי בין הלסת העליונה את הלסת התחתונה עם המספריים ולמחוק את הלסת התחתונה. עם המספריים, להפוך את שני חתכים בקצות הקשתות העול ולהסיר אותם. להסיר את העיניים בעזרת המלקחיים ויבתר.
        5. להחזיק את הגולגולת עם המלקחיים ויבתר וחותכים את הגולגולת לאורך התפר המשונן עם אזמל. הרם את שני החצאים של הגולגולת למוח כדי לראות את רירית האף. Mucosas האף מוקפים עצמות הקדמי של הגולגולת, כולל את אפי, הלסת העליונה, גבעת הפלטין, העול, ועצמות הכברה.
        6. משתמש את האזמל, לחתוך את החלק של הגולגולת למוח ולמחוק. המקום החלק השני של הגולגולת עם רירית האף בשפופרת סטרילי. לאחסן את הצינורית על קרח (4 ° C) אם הדגימות מעובדים באותו היום, או על קרח יבש להקפיא אותם במהירות אם הדגימות יעובדו מאוחר יותר.
        7. למניעת זיהום של דגימות, לנקות ולחטא את הכלים ויבתר בין כל רקמות התאושש ובין כל דיסקציה בעלי חיים עם כלור דיאוקסיד חיטוי.
        8. כדי לאסוף את הריאות, למקם את החיה recumbency הגבי וחותכים את קרום הריאות עם המספריים. פתח את כלוב הצלעות על ידי חיתוך הצלעות-1 ס מ משני צידי החזה. להפוך את הקיצוצים מבסיס של כלוב הצלעות לחלק עליון עם המספריים.
        9. לעשות חתך עם המספריים בין שני חתכים בחלק עליון של כלוב הצלעות, הסר את לוחית החזה. להחזיק את הריאות עם המלקחיים, לחתוך בסוף קנה הנשימה (רק לפני הריאות) עם המספריים ולשים את הריאות לתוך צינור סטרילי. לאחסן את הצינורית על קרח (4 ° C) אם הדגימות מעובדים באותו היום, או על קרח יבש להקפיא אותם במהירות אם הדגימות יעובדו מאוחר יותר.
          הערה: Homogenize את דגימות רקמה באותו היום שבו הם נאספו, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לנתח titers ויראלי מאוחר יותר. חשוב כי דגימות לא לעבור הקפאת חוזרות ונשנות-הפשרה מחזורים לפני titers וירוס נקבעות. לחלופין, לאחסן את דגימות רקמה ב-80 מעלות צלזיוס עד שהם יעובדו.
    2. המגון הריאות ורירית האף
      1. למקם את הריאות או רירית האף מהמגן דאונס סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של זיהום קר מדיה. Homogenize המדגם על-ידי הזזת איחדו את מעלה ומטה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עד הריאות הן משובשות לחלוטין. שים המדגם homogenized צינור סטרילי, חנות 4 ° ג שימוש מהמגן דאונס חדש עבור כל דגימה.
      2. Centrifuge הדגימות ב g x 300 למשך 5-10 דקות ב RT. לאסוף תגובת שיקוע בשפופרת סטרילית חדשה. לאחסן את תגובת שיקוע ב 4 ° C אם טיטור ויראלי מתבצע באותו יום וזורקים בגדר. לחלופין, הקפאת דגימות (-80 מעלות צלזיוס) תגובת שיקוע של homogenized כדי להעריך את נגיפי titers מאוחר יותר.
    3. וירוס טיטור מאת עקיף immunofluorescence
      1. יום לפני טיטור, זרע 96-ובכן צלחות עם תאים אפיתל מדין טומי הכלבי הכליה (MDCK) (4 x 10 4 תאים/טוב) כדי להגיע למפגש ~ 80-90% בתקשורת תרביות רקמה. מקם את התאים 37 ° C חממה עם 5% CO 2. היום של נגיפי טיטור, לבדוק את התאים במיקרוסקופ כדי לאשר חד שכבתי לפני שמתחילים זיהום נגיפי.
      2. להכין 1:10 דילולים של תגובת שיקוע של הדגימות homogenized (ריאות או רירית האף) בתקשורת זיהום בצלחת 96-ובכן. לבצע טיטרציה ויראלי על ידי triplicates כדי לקבוע במדויק titers ויראלי.
        1. µL להוסיף 90 של זיהום מדיה לכל אחד מן הבארות בצלחת 96-ובכן. להוסיף 10 µL של אחד תגובת שיקוע של הדגימות homogenized בארות A1, A2, A3 כדי להעריך את כייל ויראלי של כל מדגם דולר. להוסיף 10 µL של עוד תגובת שיקוע של הדגימות homogenized בארות A4, A5, A6. לבצע הדילול באותו ברציפות עם שאר הדגימות.
        2. לאחר הוספת הדגימה supernatant row A, השתמש pipet רב-ערוצי לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה. להעביר 10 µL row A שורה בי שינוי את הטיפים בין דילולים ומערבבים היטב. חזור על פעולה זו עד השורה האחרונה (H).
      3. להסיר את המדיום תרביות רקמה (שלב 4.2.3.1) באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום מתאי MDCK צלחות 96-ובכן, לשטוף פעמיים עם µL 100/טוב של PBS 1 x.
        4. תאים
      4. להעביר 50 µL/טוב של תגובת שיקוע מדולל באופן סדרתי של הדגימות homogenized לצלחת 96-ובכן עם MDCK. להתחיל העברת את דילולים גבוה יותר (שורה H) דילולים נמוכים (row A). במקרה זה, אין צורך לשנות את הטיפים בין שורות שונות.
      5. לשים את הצלחות 96-ובכן על פלטפורמה נדנדה עבור h 1 RT כדי לאפשר ספיחה ויראלי. לאחר ספיחה ויראלי, להסיר את inoculum באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולהוסיף µL 100/טוב של מדיה לאחר הפגיעה. דגירה תאים נגועים במשך 8 שעות בחממה 33 מעלות או 37 ° C עם 5% CO 2. המשך תיקון, מכתים, הדמיה של חישוב כייל ויראלי כמתואר בצעדים 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. להסיר המדיום תרביות רקמה של הלוחות 96-ובכן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לתקן, permeabilize את התאים עם µL 100/טוב של קיבעון/permeabilization פתרון עבור 20 דקות ב- RT.
        התראה: שימוש הפתרון פיקסציה/permeabilization בשכונה fume כדי למנוע חשיפה פורמלדהיד.
      7. הסר את הפתרון פיקסציה/permeabilization באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום, לשטוף עם 1 x PBS, דגירה התאים קבוע עם חסימת פתרון עבור h 1 בחנות RT. התאים חסימת פתרון ב 4 ° C או להמשיך לשלב הבא.
      8. להסיר הפתרון חסימה. להוסיף µL 50/טוב של µg/mL 1 נוגדנים חד שבטיים (mAb) אנטי-NP HB-65 מדולל בפתרון דילול נוגדן. תקופת דגירה של h 1 37 ° ג. שונה mAb או polyclonניתן להשתמש באל נוגדנים (pAb) אנטי-PR8.
      9. לדלל בינתיים, 1:200 isothiocyanate fluorescein (FITC)-מצומדת נוגדן אנטי-העכבר המשני בפתרון דילול נוגדן. Centrifuge הפתרון ב g x 1,700 למשך 5-10 דקות ב- RT. נוגדנים משניים אחרים מצומדת עם אחרים fluorophores ניתן להשתמש.
      10. להסיר את הנוגדן העיקרי ולשטוף 3 פעמים עם µL 100/טוב של PBS 1 x. הוסף µL 50/טוב של דילול נוגדנים משניים, תקופת דגירה של 30-45 דקות ב 37 ° C. הסר הנוגדן משני ושטוף 3 פעמים עם µL 100/טוב של PBS 1 x. להשאיר את השטיפה האחרונה בצלחת.
      11. לבחון את התאים במיקרוסקופ זריחה כדי לקבוע את מספר התאים (ירוק) המוכתם חיובי. לחשב את נגיפי כייל נוגדנים על ידי ספירת ffu ב/mL. לחשב את כייל ויראלי לידי ffu ב/mL של הדילול עם 30-50 תאים מוכתם חיובית תוך שימוש בנוסחה: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/דילול.

5. הערכה של ההורמונאלית תגובות מערכת החיסון ( איור 3)

  1. להדביק i.n. 3 קבוצות של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה (n = 5) במינונים שונים (10 2, 10 3 ו- 10 4 ffu ב / עכבר) של PR8 LAIV, ובהן מוק-קבוצה אחת (n = 5) עם 1 x PBS סטרילי כפקד שלילי. לבצע דלקות העכבר i.n כמתואר בסעיף 3.
    1. עכבר דימום על ידי ניקוב נקראות
      1. 14 ימים לאחר חיסון, לאסוף את הדם עכברים באמצעות submandibular דימום נולד 4 מ מ 26, או שימוש אחר IACUC אושרה בשיטה.
        1. להחזיק העכבר על-ידי הרמת אותו יתלה בצוואר בין האגודל והאצבע. שתחזיק את הזנב נגד ביד עם אצבע זרת בחולייה העכבר.
        2. לשים את העכבר במצב לרוחב כדי לראות את הלחי. להפוך הניקוב ואחריותה של הורידים רטרו-מסלולית, submandibular עם ומוחלף. כיור lancet (4 מ מ) ולשחזר את הדם בצינור סטרילי (כ 0.2 - 0.4 מ ל/עכבר התאוששו). הפעילו לחץ על הניקוב עם מפית סטרילי לכמה שניות. הנח את העכבר בחזרה לתוך הכלוב.
      2. לשים את הצינורות עבור 1-2 h ב 37 מעלות צלזיוס, ואז centrifuge אותם ב 700 g x במשך 30 דקות ב- RT להפריד את הנסיוב הדם. להעביר את השכבה העליונה המורכבת הסרום עם pipet על צינור סטרילי. להתעלם בגדר של כדוריות דם אדומות (RBCs). לאחסן את הנסיוב ב-20 מעלות צלזיוס
  2. ניתוח הכולל נוגדנים נגד חלבונים ויראלי
    1. הכנת תמציות נגוע של תא MDCK
      1. יום לפני זיהום, זרע צלחת אחת 100-מ מ עם 4-5 x 10 6 תאים MDCK (כדי להגיע ~ 80-90 הנהרות % למחרת) בתקשורת תרביות רקמה. מקם את התאים 37 ° C חממה עם 5% CO 2. היום של זיהום ויראלי, לבדוק את התאים במיקרוסקופ כדי לאשר חד שכבתי לפני שמתחילים זיהום נגיפי.
      2. להכין לדילול ויראלי עם ריבוי (0.001) נמוך של זיהום (MOI) של PR8 WT בתקשורת זיהום בהנפח הסופי הכולל 4 מ"ל. לחשב את כמות PR8 WT עם הנוסחה ((X MOI x n ° תאים) x נפח סופי) / מלאי כייל ויראלי.
      3. תשאף המדיום תרביות רקמה מהצלחת תא MDCK, לשטוף פעמיים עם 4 מ ל 1 x PBS. להוסיף את inoculum ויראלי (4 מ ל), לשים את הצלחת על פלטפורמה נדנדה עבור h 1 RT כדי לאפשר ספיחה ויראלי. להסיר את inoculum ויראלי עם ואקום ולהוסיף 8-10 מ"ל של המדיה לאחר הפגיעה המכילה 1 µg/mL של טריפסין שטופלו TPCK. דגירה תאים נגועים במשך 48-72 h בחממה 33 מעלות או 37 ° C עם 5% CO 2.
      4. לנתק את התאים בעזרת מגרד תא ולאסוף את התאים ואת תרביות רקמה בינוני עם pipet בשפופרת 15-mL. Centrifuge את הצינור ב 400 g x 5-10 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר ריפה, מכניסים את התערובת צינור 1.5-mL סטרילי. דגירה על קרח במשך 20-30 דק...
      5. צנטריפוגה הצינור ב g 1,300 x למשך 20-30 דקות ב-4 ° C. בזהירות, לשחזר את תגובת שיקוע. חנות התא לחלץ מתוך 100 aliquots µL ב-20 מעלות צלזיוס
      6. Titrate תא תמציות כמתואר המקושר-אנזים immunosorbent assay (אליסה) לפני הערכת אותם נוכחות של נוגדנים 9 , 10 , 11 , 27. כלול תא מחלצת MDCK תאים הנגועים מעושה (להכין כמצוין לעיל) כפקד שלילי.
    2. אליסה ( איור 4)
      1. מעיל פוליסטירן 96-ובכן צלחות עם דילול המתאים של תאים נגועים-MDCK לחלץ ב- PBS 1 x (בדרך כלל בין 1:200 - 1:1, 000). המעיל עוד צלחת עם הדילול באותו נגוע ואימץ MDCK תא תמצית כפקד שלילי. דגירה לילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס
      2. להסיר את תגובת שיקוע באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום, לשטוף פעם עם µL 100/טוב של PBS 1 x עם pipet רב-ערוצי. לחסום מחייב שאינם ספציפיים על-ידי הוספת µL 100/טוב של חסימת פתרון עבור 1 h RT.
      3. בינתיים, להפוך 2-fold דילולים טורי (החל דילול 1:50) של sera כל עכבר נגוע בשלב 5.1 בפתרון דילול נוגדן בצלחת 96-ובכן.
      4. להסיר הפתרון החוסמים הצלחות 96-ובכן פוליסטירן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. מוסיפים 50 µL של כל עכבר בסרום הבאר המתאים, דגירה h 1-37 מעלות צלזיוס.
      5. להסיר את סרה עכברים עם מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים מזוקקים באמצעות של pipet רב-ערוצי. הוסף µL 50/טוב של נוגדן אנטי עכבר משני מצומדת עם חזרת Peroxidase (HRP) מדולל 1:2,000 בתמיסה דילול נוגדן. דגירה h 1 ב 37 º C
      6. להסיר את הנוגדן משני עם מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים מזוקקים באמצעות של pipet רב-ערוצי. להכין את הפתרון המצע tetramethylbenzidine (שוייץ) על ידי ערבוב פתרון 1:1 A ו- B. להוסיף 100 µL/טוב של סובסטרט, תקופת דגירה של 5-10 דקות ב RT בחושך.
      7. לעצור את התגובה על-ידי הוספת µL 100/טוב של N H 0.2 2 אז 4. לקרוא את הצלחות ב- 450 ננומטר על צלחת חלבונים-
      8. להחסיר את הערך שהתקבל בכל דילול של MDCK נגועה ואימץ 96-ובכן צלחת מהערך שהושג בצלחת 96-ובכן נגועה MDCK. חישוב ממוצע הערכים עבור כל דילול עם sera שונים ולייצג אותם ב גרף המציג סטיות תקן (SD).
  3. ניתוח של נטרול נוגדנים
    1. Hemagglutination עיכוב (חי) assay ( איור 5)
      1. לפני ביצוע וזמינותו HAI, מתייחסים סרה את העכבר עם קולטן השמדת האנזים (RDE) כדי לחסל את כל המעכבים שאינם ספציפיים נוכח הנסיוב. להוסיף נפח 1 של העכבר סרום 4 כרכים של דילול עבודה RDE (בסרום הוא עכשיו 1:5). דגירה O/N (12- 18 h) בתוך אמבט מים 37 ° C.
      2. לחמם את הדוגמאות סרום ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להשבית את RDE.
      3. לקבוע מראש את הפעילות hemagglutination (טין) של PR8 WT על ידי HA סטנדרטי assay 28. ברגע חואה ויראלי נקבעת, לדלל המניה ויראלי חואה 8 לכל µL 50 ב- PBS 1 x.
      4. להכין דילולים טורי 2-fold (12 דילולים) של sera שטופלו RDE בצלחת התחתונה V 96-ובכן. השתמש שורה אחת עבור כל דגימה סרום (למשל, A1 כדי A12).
        1. µL להוסיף 25 של 1 x PBS מ- A1 ל A12 בארות. לבדוק כל אחד הדוגמאות סרום בשורה אחת. להוסיף 25 µL של סרה שטופלו RDE (1:5) 25 µL של 1 x PBS בהבאר הראשונה של העמודה (A1). הדילול סרום הראשון הוא 1:10-
        2. לאחר כל שטופלו RDE סרה מתווספים העמודה הראשונה, (למשל, A1, B1, C1), להשתמש pipet רב-ערוצי כדי לערבב את סרה, 1 x PBS על ידי pipetting למעלה ולמטה. להעביר 25 µL של סרה מדולל העמודה הראשונה העמודה השניה (למשל, מ- A1 ל- A2). לשנות את הטיפים בין דילולים ומערבבים.
        3. חזור על צעדים 5.3.1.4.2. עד שהגיע העמודה האחרונה (למשל, A12, B12, C12). למחוק את µL 25 של העמודה האחרונה, שמירה על אמצעי האחסון עקבי כל הבארות (25 µL). לכלול שורה אחת של בארות המכיל רק 25 µL של PBS 1 x בלי שום סרה כפקד שלילי.
      5. µL להוסיף 25 של iav ב מדולל כדי 8 µL חואה/50 לכל אחד מן הבארות עם סרה בצלחת התחתונה V 96-ובכן; האחסון הסופי בכל טוב הוא 50 µL, המכיל 4 חואה של וירוס. מערבבים את התוכן על-ידי pipetting חוזרות ונשנות. תקופת דגירה של 1 h RT.
      6. להוסיף 50 µL של 0.5% טורקיה RBCs לכל אחד מן הבארות. מערבבים את התוכן על-ידי pipetting חוזרות ונשנות. דגירה את הצלחת למשך 30-45 דקות על קרח. לקרוא וזמינותו חי מבחינה ויזואלית, כאשר RBCs בבארות שליטה (1 x PBS) יוצרים המשקע האדום (קרי, גלולה) בתחתית הבארות.
        הערה: RBCs ממינים אחרים כגון עוף, חזיר או סוס יכול לשמש גם.
      7. לחשב את titers חי על ידי זיהוי האחרון טוב בו RBCs בצורת גלולה אדום, hemagglutination לא יתרחש.
        הערה: ערך הופכי של דילול זו היא כייל האי. ערך הופכי מוכפל במקדם של 20 לתיקון 1:20 דילול של הסרום בשורה הראשונה.
    2. וירוס microneutralization assay (VNA) ( איור 6)
      1. יום לפני VNA, להכין MDCK תאים בצלחת 96-ובכן להגיע למפגש 80-90% ביום המחרת כפי שמתואר בשלב 5.2.1.1. להכין לדילול PR8 WT בתקשורת זיהום יש 200 ffu ב/25 µL.
      2. Inactivate העכבר sera ב 56 ° C עבור ה 1 להפוך דילולים 2-fold טורי (דילול 12) לכל העכבר סרה triplicate באמצעות צלחת 96-ובכן. µL
        1. µL להוסיף 40 של נסיוב 160 של התקשורת הבאר הראשונה של השורה הראשונה, (למשל, A1) זיהום (סרום דילול 1:5). מערבבים על-ידי pipetting. להוסיף 100 µL של התקשורת זיהום בארות אחרים (A2 כדי H12).
        2. µL העברת 100 מהשורה הראשונה לשורה השנייה כדי להפוך דילולים 1:2 (למשל, מ- A1 ל- A2). לשנות טיפים בין דילולים מיקס על ידי pipetting. חזור על זה עד השורה האחרונה (למשל, A12). התעלם µL 100 מן השורה האחרונה, שמירה על אמצעי האחסון עקבי כל הבארות (100 µL).
      3. µL להוסיף 100 של דילול iav את כל בארות. דגירה h 1-RT. בינתיים, להסיר המדיום תרביות רקמה של תאי MDCK בצלחת 96-ובכן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולשטוף פעמיים עם µL 100/טוב של PBS 1 x.
      4. ב 96-ובכן כל צלחת של תאים MDCK, להשאיר שתי שורות עבור הפקדים. שורה אחת הוא הפקד שלילי (תאים ללא וירוס ולא סרה), השורה אחרים היא שליטה חיובית של זיהום (תאים עם וירוס בהיעדרו של sera או סרה של עכברים נגועים מעושה).
      5. להעביר 50 µL/טוב מהצלחת וירוס-נוגדן אל צלחות 96-ובכן MDCK תאים. ! תחזירו את הצלחות בפלטפורמה נדנדה h 1 RT כדי לאפשר ספיחה ויראלי.
      6. להסיר את inoculum וירוס-נוגדן באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולהוסיף µL 100/טוב של המדיה לאחר הפגיעה המכילה 1 µg/mL של טריפסין שטופלו TPCK.
      7. תקופת דגירה התאים של ~ 3-4 ימים חממה 33 ° C או 37 ° C עם 5% CO 2 עד ציטופתי (CPE) הוא ציין בפקד חיובי (תאים נגועים בהיעדרו של sera או עם פקד סרום).
      8. להסיר את המדיום תרביות רקמה באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום ולהוסיף µL 100/טוב של 0.1% קריסטל ויולט. תקופת דגירה של h 1 הסר RT. הפתרון קריסטל ויולט באמצעות מתאם ליניקת-רב-ערוצי ואקום. לשטוף את בארות 3 פעמים עם מים מזוקקים. יבש את הצלחות ב- RT.
      9. לחשב את titers VNA על ידי זיהוי דילול הגבוהה ביותר השומרת על טפט תא confluent של תאים MDCK.
        הערה: ערך הופכי זה דילול המתאים הוא כייל נוגדנים נטרול. ערך הופכי מוכפל במקדם של 10 כדי לתקן את ה-1:10 דילול של sera הבאר הראשונה של השורה.

6. הערכה של הגנה יעילות החיסונים ( איור 3)

  1. Vaccinate i.n. קבוצה של עכברים C57BL/6 6 ל- 8-בת נקבה (n = 11) עם המינון PR8 LAIV לבדוק (ffu ב/עכבר), מוק-לחסן קבוצה נוספת של עכברים (n = 11) עם 1 x PBS סטרילי. לבצע את החיסונים i.n. העכבר תיאר כאמור בסעיף 3.
  2. 14 ימים לאחר החיסון, לדמם העכברים ולאסוף את סרה כמתואר בסעיף 3. לנתח את הנוכחות של סך ונטרול נוגדנים נגד PR8 WT כמתואר בסעיף 5.1.1.
  3. חמישה עשר ימים לאחר החיסון, למדוד ולהקליט את משקל הגוף של העכבר (יום 0). אתגר i.n. עכברים עם מנה קטלנית של WT PR8 (אתגר הומולוגיים) תיאר כאמור בסעיף 3.
  4. מודדים את משקל הגוף ואת הישרדות (n = 5 / קבוצה) במהלך 14 ימים לאחר אתגר כדי להעריך את התחלואה והתמותה המיוצר על ידי האתגר PR8 WT בעכברים שחוסנו (סעיף 4.1).
  5. לשחזר את הריאות העכבר ורירית האף (n = 3/day) ב יום שני ויום 4 פוסט-אתגר עם PR8 WT. Homogenize ולנתח את הריאות, רירית האף כמתואר בסעיף 4.2 כדי ומעריכה את שכפול ויראלי של PR8 WT בעכברים שחוסנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אפיון נגיפי פתוגנזה בעכברים

בפתוגנזה של iav ב קשורה את התחלואה ואת התמותה הנגרמת על ידי הזיהום שלה. שני פרמטרים אלה ניתן להעריך בעכברים בקלות: iav ב תחלואה קשורה עם ירידה במשקל הגוף אצל עכברים נגועים, האחוז של הישרדות יציין שעור התמותה (איור 1). משקל הגוף של הישרדות ב עכברים נגועים iav ב בדרך כלל מנוטרים מדי יום במשך לפחות שבועיים לאחר זיהום8,9...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

העכבר בדגם iav ב נעשה שימוש נרחב ללימודי אין ויוו של יעילות iav ב פתוגנזה, immunogenicity והגנה. גודל קטן של עכברים גורם להם קל לתמרן ולאחסן לעומת דגמים בעלי חיים אחרים כגון חמוסים או שרקנים. יתר על כן, הקלות במונחים של בעל החיים עולה, דיור ורביה לאפשר את השימוש בהם בבדיקות החיסון קליניים בהם נדרשים מספר רב של בעלי חיים. ראוי לציין, מאז עכברים שימשו מחקר מרובים ממשמעת, מספר מולקולרית, אימונולוגיה ריאגנטים מאתר הינם זמינים להקל על השימוש שלהם ללימודי iav. יתר על כן, ההשתנות מינימלי מארח ואת נוכחותם של מערכת חיסונ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר על וירוס שפעת במעבדה LM-S יסובסד בחלקו על ידי ה ניו יורק שפעת מרכז התמחות (NYICE), חבר של NIAID מרכזי מצוינות עבור שפעת מחקר, מעקב (CEIRS). אנו מודים וונדי בייטס על שאתמוך בה התיקונים של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי אפיתל של Madin-Darby כלבים (MDCK)ATCCCCL-34
נקבה בת שישה עד שמונה שבועות C57BL/6 עכבריםהמכון הלאומי לסרטן (NCI)01XBE
Turckey תאים בלודים אדומיםBiolink Incחנות ב-4 מעלות; סי
דולבקו s שונה Eagle' s בינוני (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVחנות ב 4 מעלות; סרום
בקר עוברי C (FBS)Seradigm1500-050יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין (PSG) 100xCorning30-009-CIחנות ב-20 מעלות; C
פניצילין/סטרפטומיצין (PS) 100xCorning30-00-CIחנות ב-20 מעלות;
תמיסת C Bovin Albumin (BA)חנות Sigma-AldrichA7409ב-4 מעלות;
C Bovin סרום אלבומין (BSA)חנות Sigma-AldrichA9647ב-4 מעלות; C
Sigma-AldrichT8802שטופל ב-Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)ב-20 מעלות;
C Neutral Buffered Formalin 10%EMD65346-85חנות ב-RT
Triton X-100J.T.BakerX198-07חנות ב-RT
נוגדן חד-שבטי אנטי-NP Influenza A Virus HB-65ATTCH16-L10-4R5חנות ב-20 מעלות; C
אימונוגלובולינים נגד עכברים של ארנב פוליקלונלי/FITCDakoF0261חנות ב-4 מעלות; C
ECL Anti-mouse IgG, חזרת פרוקסידאז מקושר נוגדן שלםGE HealthcareLNA931V/AGStore ב-4 מעלות;
סט מצעים C TMBBioLegend421101Store בטמפרטורה של 4 מעלות; קורא
צלחות קינטיות C Vmaxמכשירים
מטחנות רקמות Dounceתומאס סיינטיפיק7722-7
אנזים הורס קולטנים, RDE (II)Denka Seiken Co.370013חנות ב-20 מעלות; C
קריסטל סגולפישר ScienctificC581-100חנות ב-RT
96-well צלחת תרבית תאיםGreiner Bio-one655-180
כלי תרבית תאים 100 מ"מGreiner Bio-one664-160
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo Fisher Scienctific269620
Nunc 96-Well פוליסטירן חרוטי תחתון MicroWell צלחותThermo Fisher Scienctific249570
Puralub משחה וטרינריתDechra9N-76855
מיקרוסקופ פלורסנטאולימפוסאולימפוס IX81
טריפסין מולקולריים

מקורות

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857(2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

החדרה תוך-אפיתפתוגנזה ויראליתתגובה חיסונית הומורליתתיתוּר נגיפייםרקמת ריאהרירית האףחישוב MLD50זיהוי נוגדנים
מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.