עבודה זו מתארת פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד
במאמר זה
סיכום
תקציר
Pericytes הם תאים multipotent perivascular המציגים הטרוגניות באיברים שונים או אפילו בתוך הרקמה זהה. בשרירי השלד, יש לפחות שתי תת-אוכלוסיות (הנקראות סוג I וסוג II), המבטאות סמנים מולקולריים שונים ויש להן יכולות הבחנה שונות. באמצעות NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים פעמיים מהונדס, סוג אני (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) וסוג II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) פריסיטים היו מבודדים בהצלחה. עם זאת, הזמינות של עכברים אלה פעמיים מהונדס מונע את השימוש הנרחב של שיטה זו טיהור. עבודה זו מתארת פרוטוקול חלופי המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד. פרוטוקול זה מנצל את הקרינה המופעל תא מיון (FACS) טכניקה מטרות PDGFRβ, ולא NG2, יחד עם האות Nestin-GFP. לאחר בידוד, הקלד אני ו tyPe II pericytes להראות מורפולוגיות שונות. בנוסף, סוג I ו percytes סוג II מבודדים בשיטה חדשה זו, כמו אלה מבודד מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה. תוצאות אלו מראות כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד subpopulations pericyte של שרירי השלד ואולי מתוך רקמות אחרות.
מבוא
ניוון שרירים הוא הפרעה ניוונית שרירית כי אין טיפולים יעילים עד כה. פיתוח טיפולים המקדמים התחדשות רקמות תמיד היה עניין רב. התחדשות רקמות ותיקון לאחר נזק תלוי בתאי גזע תושב / תאים אב 1 . תאי לוויין מחויבים תאים מבשר myogenic התורמים התחדשות שרירים 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . השימוש הקליני שלהם, לעומת זאת, הוא הקשו על ידי הגירה מוגבלת שלהם שיעור הישרדות נמוך לאחר ההזרקה, כמו גם על ידי יכולת ירידה שלהם בידול לאחר הגב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
Wildtype ו Nestin-GFP מהונדס עכברים היו שוכנו במתקן החיות באוניברסיטת מינסוטה. כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת מינסוטה היו בהתאם NIH מדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה.
1. ניוון שרירים בודד בידוד התא
- להרדים עכברים בוגרים (6-10 שבועות, הן זכר והן נקבה) עם tribromoethanol (250 מ"ג / ק"ג, IP) ו לעקר את עור הבטן שלהם עם אתנול 70%.
הערה: Tribromoethanol שימש כאן במקום קטמין עבור הרדמה / המתת חסד, כמו ketamine ידוע אינטרא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרמטרים של FACS, כולל עוצמת הלייזר ותגמול הערוץ, מתוקנים על סמך תוצאות הבקרה הבלתי מבוקרת ובקרות בצבע יחיד. PDGFRβ-PE-FMO שליטה משמש לקבוע את gating עבור האוכלוסייה PDGFRβ-PE + ( איור 1 א ). בין PDGFRβ-PE תאים, שתי אוכלוסיות המייצג Nestin-GFP + ו Nestin-GFP - תאים מופרדים בבירור ( איור 1 א ). גבולות Gating עבור PDGFRβ-PE + Nestin-GFP +
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Pericytes הם תאים multivotent perivascular 22 , 23 הממוקם על פני השטח abluminal של נימי 21 , 26 . בשרירי השלד, pericytes מסוגלים להבדיל לאורך נתיבים adipogenic ו / או myogenic 19 , 20 , 24 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שתי תת-קבוצות של פרסיטים, עם ביטוי סמן שונה והבדלים ברו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לכל המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי מענק קרן-A-FO של קרן Dystrophy Myotonic (MDF-FF-2014-0013) ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני (16SDG29320001).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סדרן תאים | Sony | SH800 | |
| חרוזי התקנה אוטומטית | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC בסיסי בינוני (עכבר) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| תוסף ממריץ אדיפוגני (עכבר) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 16000 | |
| סרום סוסים | Sigma | H1270 | |
| קולגנאז סוג 2 | וורת'ינגטון | LS004176 | |
| 0.25% טריפסין/EDTA | Gibco | 25200 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE נוגדן | eBioscience | 12-1402 | |
| נוגדן פריליפין | Sigma | P1998 | |
| נוגדן S-מיוזין | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-נוגדן נגד ארנב& נ.ב.פ; | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-נוגדן נגד עכבר | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| מדיום הרכבה עם DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 גרם מחטים | BD | 305196 | |
| 10 מ"ל פיפטה סרולוגית | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
מקורות
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispens....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
