מאמר שיטה

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55919

⸱

28 במאי 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המיפוי גנום רחב של אתרי אינטגרציה של מולוני Murine לוקמיה וירוס מבוססי וקטורים רטרוביראל בתאים אנושיים.

תקציר

Mukoney Murine לוקמיה (MLV) וירוס מבוססי וקטורים retroviral להשתלב בעיקר משפרי acetylated ויזמים. מסיבה זו, אתרי אינטגרציה mLV יכולים לשמש כסמנים פונקציונליים של רכיבים רגולטוריים פעילים. כאן, אנו מציגים כלי סריקה retroviral, אשר מאפשר זיהוי גנום רחב של משפרי תא ספציפי ומקדמים. בקצרה, האוכלוסייה היעד היעד transduced עם וקטור נגזר mLV ו DNA גנומי מתעכל עם אנזים הגבלת חיתוך לעתים קרובות. לאחר קשירת שברי הגנום עם מקשר DNA תואם, linker בתיווך פולימראז התגובה שרשרת (LM-PCR) מאפשר הגברה של צומת הגנום וירוסים המארח. רצף מסיבי של amplicons משמש כדי להגדיר את פרופיל האינטגרציה mLV גנום רחב. לבסוף, אשכולות של אינטגרציות חוזרות מוגדרים לזיהוי אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא, האחראים להפעלת תוכניות תמלול ספציפיות מסוג תא.

= "Jove_content"> כלי הסריקה retroviral מאפשר זיהוי גנום רחב של היזמים ספציפיים ספציפיות תא ב אוכלוסיות תאים היעד פרוספקטיבי. יש לציין, כי סריקה רטרו-ויראלית מייצגת טכניקה אינסטרומנטלית לזיהוי רטרוספקטיבי של אוכלוסיות נדירות ( כגון תאי גזע סומטיים) שאין להן סמנים חזקים לבידוד פוטנציאלי.

מבוא

זהות התא נקבעת על ידי ביטוי של קבוצות ספציפיות של גנים. תפקידם של אלמנטים רגולטוריים של CIS, כגון יזמים ומשפרים, הוא קריטי להפעלת תוכניות תמליל ספציפיות מסוג תאים. אזורים רגולטוריים אלה מאופיינים בתכונות כרומטיות ספציפיות, כגון שינויים היסטוניים מוזרים, גורמי תעתיק ושיתוף גורמי שיתוף, וגישה לכרומטין, אשר שימשו באופן נרחב להגדרת הגנום שלהם במספר סוגי תאים 1 , 2 , 3 . בפרט, פרופיל הגנום רחב של אצטילציה של היסטון H3 ליזין 27 (H3K27ac) משמש בדרך כלל להגדיר היזמים פעיל, משפרי ומשפר סופר 4 , 5 , 6 .

Moloney Murine וירוס לוקמיה (MLV) הוא גמא רטרווירוס כי הוא בשימוש נרחב עבור הגןהעברה בתאי יונקים. לאחר הדבקה של תא מטרה, הגנום רטרובייראלי RNA הוא retro- transcribed במולקולה דנ"א כפול תקועים המחייבת חלבונים ויראליים וסלולריים להרכיב את מורכבות מראש אינטגרציה (PIC). PIC נכנס הגרעין וקושרת את הכרומטין התא המארח. כאן, אינטגרז ויראלי, מרכיב PIC מפתח, מתווך את האינטגרציה של ה- DNA פרובייר לתוך הגנום תא המארח. אינטגרציה של mLV בדנ"א הגנומי אינה אקראית, אלא מתרחשת במרכיבים פעילים של cis-regulation, כגון מקדמי ומשפר, בתא ספציפי 7 , 8 , 9 , 10 . פרופיל אינטגרציה מוזר זה מתווכת על ידי אינטראקציה ישירה בין אינטגרז mLV לבין חלבונים Bromodomain הסלולר ו extrerminal תחום (BET) חלבונים 11 , 12 , 13 . חלבונים BET (BRD2, BRD3, וBRD4) לשמש גשר בין הכרומטין המארח ל mLV PIC: דרך bromodomains שלהם הם מכירים מאוד cety- רגולציה אזורים, ואילו תחום extrerminal אינטראקציה עם אינטגרציה mLV 11 , 12 , 13 .

כאן, אנו מתארים את הסריקה רטרו-ויראלי, כלי חדש למפות אזורים פעילים cis- רגולציה מבוסס על תכונות שילוב של mLV. בקצרה, תאים transduced עם וקטור mLV הנגזר retroviral להביע את חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP) גן הכתב. לאחר החילוץ הדנ"א הגנומי, הצמתים בין ה - LTR של ה - LTR של ה - LTR של וקטור ה - mLV לבין הדנ"א הגנומי מתוגברים על ידי PCR בתיווך מקושר (LM-PCR) ו רצף מאסיבי. אתרי אינטגרציה של mLV ממופים לגנום האנושי ולאזורים הגנומיים הממוקדים על ידי mLV מוגדרים כאשכולות של אתרי אינטגרציה mLV.

סריקת רטרו - ויראליNing שימש כדי להגדיר תא ספציפי אלמנטים רגולטוריים פעילים כמה תאים ראשוניים האנושי 14 , 15 . מקבצים mLV במשותף עם יזמים מוגדרים epigenetically ו משפרי, אשר רובם טמון סימני היסטון פעיל, כגון H3K27ac, היו ספציפיים תא. סריקה רטרו-ויראלית מאפשרת זיהוי גנום רחב של אלמנטים רגולטוריים של דנ"א באוכלוסיות תאים מטופלות פרוספקטיבית , 7 , 14 , כמו גם באוכלוסיות תאים מוגדרות רטרוספקטיבית, כגון תאי גזע קרטינוציטים, חסרים סמנים יעילים לבידוד פוטנציאלי 15 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. MLV התמרה של תאים אנושיים

  1. לבודד תאים היעד transduce אותם עם וקטור mLV הנגזר retroviral מחסה את הגן הכתב eGFP ו pseudotyped עם Vesicular Stomatitis Virus (VSV-G) או המעטפה גליקופרוטין amphotropic 16 .
    1. שמור על תאים מעושה transduced כבקרה שלילית עבור הניתוחים הבאים. מאז וקטורים rVroviral מבוסס mLV יכול transduce יעיל חלוקת תאים, תרבות האוכלוסייה היעד האוכלוסייה בתנאים הממריצים חלוקת התא. תנאי התמרה צריך להיות מותאם במיוחד עבור כל סוג התא תחת מחקר. גידול תאים ותנאי התמרה של אבות hematopoietic האדם, תאי T ותאי האפידרמיס מתוארים הפניות 7, 14, 15, ו - 17.
  2. 48 שעות לאחר התמרה, resuspend 100,000 תאים μL 300 של מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) המכיל 2% בסרום שור עוברית ולמדוד ביטוי eGFP ידי Fניתוח cytometric נמוך (488 ננומטר עירור לייזר). השתמש בתאים מדומים מדומים כביקורת שלילית. עבור אחזור אתר אינטגרציה אופטימלית, לטהר תאים GFP + על ידי מיון הקרינה מופעלת תא (FACS).
  3. איסוף 0.5-5 מיליון תאים להכנת DNA גנומי. תקופת תרבות ארוכה יותר (7 ימים) מעדיפה לדלל את provirus הלא משולב ואת הצורך בעת ניתוח הצאצאים לטווח ארוך של בתאי גזע בתום לב (ראה סעיף דיון התייחסות 15 ). כדורי התא יכול להיות הצמד קפוא מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. הגברה של אתרי אינטגרציה mLV על ידי קישור-מתווך-PCR (LM-PCR)

  1. הכנת DNA גנומי (gDNA)
    1. חלץ gDNA באמצעות ערכת מבוססי דנ"א חילוץ עקוב אחר פרוטוקול תאים בתרבית, על פי הוראות היצרן.
  2. הגבלת אנזים digestiעַל
    1. הגדרת 4 עיכול אנזים עיכוב לכל מדגם צינורות 1.5 מ"ל. לעכל 0.1-1 ggNA מיקרוגרם בכל צינור על ידי הוספת 1 μL של Tru9I (10U) ו 1 μL של המאגר M בנפח סופי של 10 μL. דגירה את התגובות על 65 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות או לילה.
    2. הוסף כל תגובה 1 μL של PSTI (10U), 1 μL של חיץ H ו 8 μL של מים. דגירה את התגובות על 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות או לילה. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  3. לינקר קשירת
    1. הכן 100 מיקרומטר Tru9I פתרון המניה מקשר בצינור 1.5 מ"ל על ידי ערבוב מקשר בתוספת גדיל ומקשר מינוס oligonucleotides גדיל בריכוז 100 מיקרומטר. שים את הצינור בתוך סט מים על 100 מעלות צלזיוס ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר. Tru9I פתרון המניה מקשר ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    2. הגדר 8 קשירת קשירת תגובות 1.5 צינורות מ"ל. עבור כל תגובה, הוסף את הרכיב הבאS ל 10 μL של עיכול אנזים הגבלה: 1.4 μL של 10X T4 DNA Ligase התגובה חיץ, 1 μL של 10 מיקרומטר Tru9I מקשר, 1 μL (2,000U) של ליגז T4 DNA ו 0.6 μL של מים. לדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 3 עד 6 שעות. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  4. PCR הראשון
    1. הגדר 48 תגובות PCR (6 תגובות מכל צינור קשירת) ב 0.2 צינורות מ"ל. עבור כל PCR, להוסיף את ריאגנטים הבאים μL 2 של תגובה קשירת: 5 μL של חיץ 10X PCR, 2 μL של 50 מ"מ מגנזיום סולפט, 1 μL של 10 mox deoxynucleotide (dNTP) מערבבים, 1 μL של 10 תחל מקשר מיקרומטר, 1 ΜL של 10 מיקרומטר mLV-3 'LTR תחל, 0.3 μL (1.5U) של פולימרז דנ"א Taq ו 37.7 μL של מים. טבלאות פריימר מסופקות בטבלה 1.
    2. בצע תגובה PCR ב cycler תרמית עם מכסה מחומם, כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 72 °; C למשך 5 דקות; להחזיק ב 4 ° C. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  5. PCR השני
    1. הגדרת 48 תגובות PCR (1 מכל "PCR הראשון" צינור) ב 0.2 צינורות מ"ל. עבור כל PCR, להוסיף את הרכיבים הבאים μL 2 של התגובה הראשונה PCR: 5 μL של חיץ PCR 10X, 2 μL של 50 מ"מ מגנזיום סולפט, 1 μL של 10 mM dNTP מיקס, 1 μL של 10 מיקרומטר מקשר מקוננות פריימר, 1 ΜL של 10 מיקרומטר mLV-3 'LTR מקוננות תחל, 0.3 μL של פולימרז דנ"א Taq (1.5 U) ו 37.7 μL של מים. השתמש primers מקוננות המיועד ספציפית אסטרטגיית רצף מסיבי נבחר: (i) מקושר מקושר פריימר ו mLV-3 'LTR מקוננות תחל תואם פלטפורמה Illumina; (Ii) מקשר מקושר מקושר ו mLV-3 'LTR מקוננות תחל תואם פלטפורמת Roche. רצפים פריימר מופיעים בטבלה 1 .
    2. בצע תגובה PCR ב cycler תרמית עם מכסה מחומם, כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 25מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; להחזיק ב 4 ° C. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
    3. בריכת 48 תגובות מקוננות PCR בצינור 15 מ"ל (נפח סופי של ~ 2.4 מ"ל). דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  6. לקבוע את הנוכחות ואת הגודל של מוצרים LM-PCR ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל.
    1. הוסף 4 μL של חיץ טוען ל 20 μL של מוצרים LM-PCR לטעון את המדגם על ג'ל agarose 1%, יחד עם סולם DNA 100 BP. הפעל את הג'ל ב 5 V / cm במשך 30 עד 60 דקות לדמיין את מוצרי ה- PCR על ידי מכתים ethidium bromide.
    2. הפעל תגובה LM-PCR מן המדומה מדומה transduced כמו שליטה שלילית.
  7. לזרז את amplicons על ידי הוספת 0.1 כרכים של תמיסת אצטט נתרן (3 M, pH 5.2) ו 2.5 כרכים של אתנול 100%. מערבבים להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    1. ספין ב פוLl מהירות microcentrifuge רגיל ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מחק supernatant ולשטוף את גלולה עם אתנול 70%. ספין במלוא המהירות microcentrifuge סטנדרטי ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    2. מחק supernatant ויבש את האוויר גלולה. הוסף 200 μL של מים PCR כיתה resuspend את ה- DNA. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  8. הוסף 20 μL של חיץ טוען 100 μL של מוצרים LM-PCR לטעון את המדגם על גבי ג'ל agarose 1%, יחד עם סולם DNA 100 BP.
    1. הפעל את הג'ל ב 5 V / ס"מ במשך 30 עד 60 דקות לחתוך את החלק של ג'ל המכיל 150 עד 500 amplicons bp.
    2. לטהר את המוצרים LM-PCR עם ג 'ל מבוססי עמודה החילוץ ערכת למדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר UV.
  9. השתמש 1 μL של הספרייה כדי להעריך את אורך LM-PCR מוצרים באמצעות מכשיר bioanalyzer, על פי הוראות היצרן.
  10. שיבוט רובה של amplicons
    1. השתמש 20 ng של מוצרים מטוהרים LM-PCR לשכפל אותם וקטור pCR2.1-TOPO, על פי הוראות היצרן.
    2. ביצוע תגובות רצף באמצעות M13 יוניברסל פריימר, ואחריו מיפוי גנומי של רצפים שהתקבלו, כדי לחשוף את נוכחותם של צמתים ויראליים גנום (כולל mLV-3 'LTR מקוננות פריימר) ב> 50% של שיבוטים כדי לזהות דגימות מתאים עבור רצף מסיבי. דוגמה לצומת ויראלי-גנומי:
      figure-protocol-1
      MLV-3 'LTR מקוננות תחל 454 ו מקשר מקוננות פריימר 454 ( טבלה 1 ) מסומנים מודגש ואת הקצה 3' של LTR ויראלי נטוי. רצף הגנום האנושי מודגש בטקסט אדום (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. מסיבי רצף של אתרי אינטגרציה mLV

הערה: LM-PCR prodUcts ניתן רצף באמצעות פלטפורמות מסחריות (בחירת זוג מקוננות נאות מקוננות התגובה השנייה PCR, ראה סעיף 2.5.1). עבור רצף על ידי Roche GS-FLX pyrosequencing פלטפורמה, עיין מאמרים קודמים 7 , 14 , 15 . בסעיף זה, פרוטוקול מותאם במיוחד עבור פלטפורמת רצף Illumina מתואר.

  1. הכנת ספריה
    1. הגדרת 1 אינדקס התגובה PCR לכל מדגם צינורות 0.2 מ"ל. עבור כל PCR, להוסיף את ריאגנטים הבאים ל 5 μL (150-170 ng) של המוצר מטוהרים LM-PCR: 5 μL של פריימר אינדקס 1, 5 μL של פריימר אינדקס 2, 25 μL של מיקס מאסטר 2X ו 10 μL של PCR- מים כיתה. השתמש בצירוף אינדקס שונה עבור כל מדגם.
    2. בצע תגובות PCR ב cycler תרמית עם מכסה מחומם, כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 8 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס במשך 5 מ 'In להחזיק ב 4 ° C.
    3. לטהר את המוצרים PCR באמצעות מוצק בשלב הפיכת immobilization (SPRI) פרוטוקול בידוד חרוז: ב צינורות 1.5 מ"ל חדש, להוסיף 56 μL של חרוזים למדגם כל ולהמשיך בהתאם להוראות היצרן. Elute μL 25 של Tris-HCl 10 מ"מ. ספריות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש.
  2. בדיקת ספריה
    1. השתמש 1 μL של המדגם להעריך את גודל הספרייה באמצעות מכשיר bioanalyzer.
    2. השתמש 1 μL של מדגם לכמת מולריות הספרייה באמצעות assay מבוסס הקרינה בזמן אמת PCR, על פי הוראות היצרן.
  3. דילול בספריה ורצף
    1. מדולל ספריות ל -10 ננומטר באמצעות Tris-HCl 10 מ"מ. עבור ספריות איגום, להעביר 5 μL של הספרייה כל מדולל לצינור 1.5 מ"ל חדש ולאחר מכן לדלל את הבריכה עד 4 ננומטר ב- Tris-HCl 10 מ"מ.
    2. מערבבים 5 μL של הבריכה בדילול עם 5 μL של 0.2 N NaOH ב 1.5 מ 'חדשL צינור, מערבולת בקצרה, ספין למטה דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכחיש את הספריות.
    3. שים צינורות על הקרח ולהוסיף 990 μL של חיץ הכלאה מראש צונן (HT1). Aliquot 300 μL של בריכה מפוגל בצינור חדש 1.5 מ"ל ולהוסיף 300 μL של HT1 טרום צונן להשיג 10 הספרייה הסופי הספרייה.
    4. במקביל, לערבב 2 μL של ספריית הבקרה PhiX (10 ננומטר) עם 3 μL של Tris-HCl 10 מ"מ בצינור 1.5 מ"ל. הוסף 5 μL של NaOH 0.2 N, מערבולת בקצרה, ספין למטה דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכשיר את PhiX מדולל. שים צינור על הקרח ולהוסיף 990 μL של HT1 טרום צונן.
    5. Aliquot 300 μL של PhiX מפוגל בצינור חדש 1.5 מ"ל ולהוסיף 300 μL של HT1 טרום צונן להשיג PhiX 10 pM הסופי.
    6. בצינור 1.5 מ"ל חדש, לערבב 510 μL של מאגר ספריה denatured עם 90 μL של ספריית PhiX מפוגל, ובכך להשיג בריכה 10 pM הסופי עם 15% של שליטה PhiX.
    7. פיפטה אלה 600 μL של המדגםנפח לתוך המאגר לטעון מדגם של מחסנית מופשר רצף ריצף ולהמשיך מיד לבצע ריצה אחת לקרוא מחזור 150.
      הערה: ריאגנטים קריטיים רצפים תחל נדרש בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זרימת עבודה של הליך הסריקה רטרו-ויראלי

זרימת העבודה של הליך הסריקה retroviral הוא schematized באיור 1 . אוכלוסיית תאים היעד מטוהרים transduced עם וקטור retroiral mLV הנגזר להביע גן הכתב eGFP. הטרנסגן מוקף בשני חזרות טרמינל ארוכות (5 'ו -3' LTR), המבטיחות סינתזה, שעתוק לאחור ואינטגרציה של הגנום הנגיפי לדנ"א המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, תיארנו פרוטוקול מיפוי רחב הגנום של אתרי אינטגרציה של mLV, רטרווירוס כי מטרות אזורי הכרומטין, מסומנים epigenetically כמו יזמים פעיל ומשפר. צעדים קריטיים ו / או מגבלות של הפרוטוקול כוללים: (i) התמרה mLV של אוכלוסיית תאים היעד; (Ii) הגברה של צומת המארח וירוס על ידי LM-PCR; (Iii) אחזור של חלק גבוה של אתרי אינטגרציה. MLV מבוססי וקטורים retroviral ביעילות transduce חלוקת תאים. יעילות נמוכה של התמרה של תאים שאינם מחלקים (למשל שלאחר תאים מיטוטיים עצביים) היא מגבלה פוטנציאלית של טכניק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המועצה האירופית למחקר (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), משרד החינוך האיטלקי, אוניברסיטאות ומחקרים (FIRB-Futuro ב- Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro ב- Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), משרד הבריאות האיטלקי (חוקרים צעירים קוראים 2011 GR-2011-02352026) ואת קרן מכון Imagine (פריז, צרפת).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PBS, pH 7.4ThermoScientific10010031או שווה ערך
סרום בקר עובריThermoScientific16000044או שווה ערך
0.2 מ"ל ספקמעבדה כללי
צינורות 1.5 מ"לספק מעבדה כללי QIAmp
DNA מיני Kit QIAGEN51306או שווה ערך
T4 DNA ligase ניו אינגלנד BioLabsM0202T
T4 DNA מאגר תגובה ליגאזניו אינגלנד BioLabsM0202T
Linker Plus Strand אוליגונוקלאוטידמעבדה כללית5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'   (דרגת טיהור: SDS-PAGE)
לינקר מינוס גדיל אוליגונוקלאוטידמעבדה כללית5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (דרגת טיהור: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE/Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
פלטינה Taq DNA פולימראז High Fidelity Invitrogen11304011
10 מ"מ dNTP מיקסInvitrogen18427013או שווה ערך
PCR כיתהמים ספק
96 בארות תרמי (עם מכסה מחומם)ספק
מקשר פריימרספק5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (דרגת טיהור: דרגת PCR)
MLV-3' ספקמעבדה כלליתLTR 5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (דרגת טיהור: דרגת PCR)
פריימר מקונן לינקר 454מעבדה כללי5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](דרגת טיהור: SDS-PAGE)
MLV-3' LTR מקונן פריימר 454מעבדה כללי5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](דרגת טיהור: SDS-PAGE)
פריימר מקונן מקשר ספקמעבדה כלליIllumina 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](דרגת טיהור: SDS-PAGE)
MLV-3' פריימר מקונן LTR ספקמעבדה כללי5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC] (דרגת טיהור: SDS-PAGE)
תמיסת נתרן אצטט (3M) pH 5.2ספק
אתנול (מוחלט) לביולוגיה מולקולריתSigma-AldrichE7023או
ערכת שיבוט Topo TA שווה ערך (עם וקטור pCR2.1-TOPO)InvitrogenK4500-01
ערכת מיצוי ג'ל מהירהQIAGEN28704
אגרוזסיגמא-אולדריץ'A9539או שווה ערך
אתידיום ברומיד Sigma-AldrichE1510או שווה ערך
100 bp סולם DNAInvitrogen15628019או שווה ערך
6x מאגר טעינהThermoScientificR0611או שווה ערך
NanoDrop 2000 UV-Vis ספקטרופוטומטרThermoScientificND-2000
Nextera XT ערכת אינדקסIlluminaFC-131-1001 או FC-131-1002
2x מיקס מוכן להתחלה חמה של KAPA HiFi KAPA BiosystemsKK2601
מעמד מגנטי Dynal לשפופרות 2 מ"לInvitrogen12321Dאו שווה ערך
Agencourt AMPure XP 60 מ"ל ערכתBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5ספק
Agilent 2200 TapeStation systemAgilent TechnologiesG2964AAאו שווה ערך
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582או שווה ערך
D1000 ReagentAgilent Technologies5067-5583או שווה ערך
כימות ספריית KAPA עבור פלטפורמות Illumina (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT מערכת PCR מהירה בזמן אמתיישומי ביו-מערכות4329003
NaOH 1.0 N, מולקולרית מעבדה כללית
HT1 (מאגר היברידיזציה)Illumina ריאגנטים של MiSeq
ערכת ריאגנטים MiSeq v3 (150 מחזורים)IlluminaMS-102-3001
מערכת MiSeqIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
ספק ספק מעבדה כלליתמעבדה כללי מעבדה כללית פריימר ספק ספק של Illumina מעבדה כללימעבדה כללי ערכת ספק בדרגה ביולוגיהמסופק בערכת

מקורות

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724(2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688(2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158(2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRDNA

מאמרים קשורים