מאמר שיטה

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

DOI:

10.3791/55982

⸱

4 באוקטובר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של microcryogels אלסטית macroporous תלת-ממד על-ידי שילוב מיקרו-מלאכותית עם טכנולוגיית cryogelation. בעת טעינת עם תאים, נוצרים 3D microtissues, אשר יכול להיות מוזרק בקלות בתוך vivo כדי להקל על הטיפול משובי או לצרפן מערכים להקרנה תפוקה גבוהה סמים ' במבחנה .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לשדרג תרבית תאים דו-ממדית מסורתית תרבית תאים תלת-ממד, לנו יש משולב מיקרו-מלאכותית עם cryogelation טכנולוגיה כדי לייצר cryogels microscale macroporous (microcryogels), אשר ניתן לטעון עם מגוון רחב של סוגי תאים כדי ליצור microtissues תלת-ממד. במסמך זה, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לפברק microtissues תלת-ממד תכליתי ושימושיהם לטיפול רגנרטיבית ו והתרופות הקרנה. הגודל של צורה-הקמת microcryogels יכול להיות מפוברק על שבב מערך, אשר יכול להיות שנקטפו את שבב כמו ספקים יחידים שנטענו תא לטיפול משובי להזרקה או להיות בהמשך שהורכבו על שבב לתוך מערכי microtissue תלת-ממד עבור תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה. בשל אופיו אלסטי גבוהה של אלה cryogels microscale, microtissues 3D התערוכה injectability נהדר לטיפול פולשנית תא על-ידי הגנה על תאים מכוח מכני הטיה במהלך ההזרקה. פעולה זו מבטיחה הישרדות cell משופרת, האפקט הטיפולי במודל איסכמיה איבר העכבר. בינתיים, הרכבה של מערכים 3D microtissue בתבנית תקנית 384-multi-ובכן מקלה את השימוש נפוץ למתקני המעבדה וציוד, הפיכת סמים תפוקה גבוהה הקרנת בפלטפורמה זו תרבות תא תלת-ממד תכליתי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית תאים מסורתי על משטחים (2D) דו מימדי שעברו שיטוח, כגון לצלחת תרבות או צלחות רב טוב, בקושי יכול להפיק תא התנהגויות קרוב מדינות מקורי שלהם. החוק הביוגנטי מדויק של יליד microenvironments הסלולר, המהווים תא מסוגים שונים, מטריצה חוץ-תאית וכן גורמים מסיסים ביואקטיביות ארכיטקטורות תלת מימדי (3D)1,2,3 ,4, חיוני לבניית biomimicking רקמות במבחנה עבור יישומים ב רפואה הנדסי, רגנרטיבית רקמות, ביולוגיה היסוד למחקר, סמים גילוי5,6,7 8, ,9.

במקום תרבית תאים 2D, תרבית תאים 3D נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את המיקרו-ארכיטקטוני ביונים ותרבותית פונקציונלי תכונות של תאים במבחנה. שיטה תרבות פופולרית תא 3D הוא התאים צבירה spheroids7,8,9,10. Spheroids הסלולר יכול להיות מוזרק לרקמות פצוע עם שימור הסלולר משופרת של הישרדות לעומת הזרקה של התאים התפזרו. עם זאת, לא אחידה ספרואיד וגדלים נמנע פגיעה מכנית המוטלות על תאים בכוח גזירה נוזלים במהלך ההזרקה להוביל תא המסכן השפעות טיפוליות11,12,13. באופן דומה, הלא-ריינולדס במהלך צבירה של spheroids הפך שלהם תרגום 3D מבוססת תא תפוקה גבוהה סמים הקרנת מאתגר10.

שיטה נוספת עבור תרבית תאים תלת-ממד מושגת בסיוע biomaterials, המכנסת בדרך כלל התאים hydrogels מימית או פיגומים נקבובי. היא מאפשרת וגמישויות גדול לבניית ארכיטקטורות תלת-ממד. לטיפול, תאים במארז בצובר פיגומים מועברות בדרך כלל הגוף החי באמצעות השרשה כירורגי, אשר פולשנית וטראומטית, ומכאן הגבלת שלה תרגום רחב אל מיטתה. מצד שני, hydrogels מימית מאפשרים טיפול פולשנית באמצעות הזרקת תאים מושעה בפתרון קודמן הידרוג לתוך גופים בעלי חיים, ומאפשר בחיי עיר gelation ויה תרמו-כימיים או אנזימטי crosslinking11. אולם, כמו תאים מועברים בזמן סימנים מקדימים הידרוג נמצאים עדיין במצב מימית, הם גם חשופים מכניים הטיה במהלך ההזרקה. לא רק אז, crosslinking כימי או אנזימטי במהלך בחיי עיר gelation של הידרוג גם עלול לגרום נזק לתאי בתוך. להקרנה סמים, תרביות תאים בסיוע biomaterial מול בעיות עם אחידות, בקירות וצפיות והתפוקה. שימוש hydrogels, תאים בדרך כלל מעורבים במהלך gelation, שבו התהליך עשוי להשפיע על הכדאיות תא ותפקוד. Gelation במהלך תא זריעה גם מקשה שימוש על ידי רוב הציוד תפוקה גבוהה, כיוון הידרוג ייתכן שיהיה עליך לשמור על הקרח כדי למנוע gelation לפני תא זריעה, הידרוג עלול לשבש שחולק עצות, אשר הם בדרך כלל מאוד רזה כדי להבטיח דיוק עבור הקרנת תפוקה גבוהה. פיגומים הקבועים מראש יכול באופן פוטנציאלי להפריד הליכי ייצור biomaterial תרבית תאים, עם זאת רוב מוצרים מבוססי לגרדום זמינים כמו חומרי תפזורת עם תפוקה נמוכה יותר יחסית14.

כדי להתגבר על חלק החסרונות של שיטות התרבות תלת-ממד, פיתחנו טכנולוגיה מיקרו-מלאכותית-cryogelation משולב להמציא שבב של מערך מדף וידידותית microcryogel15. פרוטוקול זה, ג'לטין מסומנת לצורך המחשה טכניקת ייצור microcryogel כפי זה מסתיימים, מתכלה, חסכונית, ללא כל שינוי נוסף נדרש עבור התא מצורף. פולימרים אחרים של מקורות טבעיים או סינתטיים יכול לשמש גם עבור פבריקציה נוספת, בהתאם ליישום. באמצעות טכנולוגיה זו, אנו יכולים לפברק microcryogels קימור קטן וגמיש מאוד לשליטה בגודל, צורה, פריסה. בעת טעינת עם מגוון רחב של סוגי תאים, 3D microtissues יכול להיווצר ליישומים שונים. תכונות ייחודיות אלה מאפשרות injectability הרצויה, הגנה על תאים ושמירה האתר מכוון לאחר הזרקת ויוו לאפקטים טיפולית משופרת. לא רק אז, microcryogels יכולה להיות מעובד יותר כדי ליצור מערכים 3D microtissue התואמים נפוצות מעבדתי וציוד כלים להבין תרבית תאים תפוקה גבוהה רב-תכליתי והתרופות הקרנה, מבחני סלולר אחרות. במסמך זה, שיפורט תהליך ייצור של microcryogels והטיפול שלאחר כמו microtissues 3D בודדים או מערכים microtissue תלת-ממד עבור שני יישומים חשובים, טיפול בתאי והתרופות הקרנה, בהתאמה10,15 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים עקב פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה חיה על מרכז של אנליזה ביו-רפואית, באוניברסיטת צינג. תחת אישור של ועדת האתיקה, רקמת שומן אנושי ממנו הושג המחלקה של ניתוחים פלסטיים של פקין האיחוד חולים עם הסכמה מדעת של החולים-

1-ייצור של תלת-ממד Microcryogels

  1. עיצוב, ייצור של שבבים microstencil
    1. שימוש תוכנה מסחרית כדי עיצוב מערכים של גיאומטריות ספציפיים, כגון עיגולים, אליפסות, משולשים או תלתן 14, בהתאם ליישום עוקבות.
      הערה: עיין בסעיף 2 הפרוטוקול עבור רפואה רגנרטיבית ו סעיף 3 פרוטוקול להקרנה סמים עבור פרטי העיצוב.
    2. לייבא את העיצוב הלייזר פיתוחי תוכנה המלווה את מכונת חריטה בלייזר. באמצעות הגדרות לייזר על-פי המלצות היצרן למכונת חריטה בלייזר, לייזר-חריטה את העיצוב מיובאים פוליפוני (methymethacrylate) (PMMA) גליונות.
    3. לרחוץ את microstencil שבבים במים יונים כדי לנקות פסולת חריטת לייזר. יבש המערך microstencil שבבי בחנות 60 מעלות צלזיוס בתוך שקית אטומה בטמפרטורת החדר במשך חודשים.
  2. ייצור של שבבים microcryogel
    1. microstencil מקום 4 מערך שבבי על המגש מדגם ולהוסיפה הפלזמה מנקה. . סגור את הדלת של שואב האבק, להפעיל את משאבת ואקום למשך 2 דקות ולאחר מכן להפעיל את הכוח המקסימלי RF (18 W) לטיפול microstencil מערך השבבים הפלזמה מנקה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להגדיל את hydrophilicity.
    2. הוסף 0.06 גרם ג'לטין יונים 1 מ"ל מים טופס 6% (wt/כרך) ג'לטין קודמן פתרון (מספיק כדי להפוך את שבבי 5). חם ב 60 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים כדי להמיס במידה מספקת. דגירה על קרח במשך 5 דק
    3. להוסיף 3 µL של גלוטראלדהיד לתוך הג'לטין קודמן לפתרון הסופי בריכוז 0.3%. לערבב ביסודיות.
    4. פיפטה 200 µL קודמן פתרון עם גלוטראלדהיד על גבי המשטח העליון של השבב מערך microstencil.
      הערה: 200 µL מספיקה עבור שבב 75 מ מ × 25 מ מ ללא קשר לעיצוב. להגדיל את הסכום באופן פרופורציונלי כאשר גדל שטח הפנים של השבב.
    5. ידנית פזר את הפתרון באופן שווה על השבב על ידי גירוד הגב הלוך עם מוט זכוכית כיפוף פי 2 עד פי 3.
      הערה: כל מיקרו-ובכן על השבב microstencil יכול להיות מלא עם פתרון קודמן בשל טבעם הידרופילית לאחר טיפול פלזמה.
    6. מיד למקם את השבב מערך קודמן-פתרון-מלא במקפיא-20 ° C עבור ה 16 עבור cryogelation.
    7. התאם איזה שהוא לופילייזר-40 מעלות במשך 30 דקות למקם את מערך שבבי לאחר cryogelation בתוך איזה שהוא לופילייזר ואת lyophilize של השבבים עבור 2 h בואקום.
      הערה: ג'לטין microcryogels עם macropores מחוברים נוצרות בגלל הקרח יצרו במהלך cryogelation sublimes, איזה שהוא לופילייזר.
    8. להמשיך לסעיף 2 לטיפול של איסכמיה איבר חיוני (CLI) ואת סעיף 3 עבור תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה.

2. קציר Microcryogels בודדים כדי טופס להזרקה Microtissues תלת-ממד עבור טיפול של CLI

  1. microcryogels בודדים קציר
    1. עיצוב מערכים (75 מ"מ × 25 מ"מ) חוגים 600, כל אחד עם קוטר 400 מיקרומטר, ב תוכנה מסחרית לבנייה להזרקה microtissue תלת-ממד. השתמש PMMA של 300 עובי מיקרומטר להרכבת microstencil מערך השבבים בדברי ההסבר בסעיף 1.1.
    2. לפברק שבבים microcryogel כמו בסעיף 1.2.
    3. לפברק מערך PDMS מפליט Pin עם אותו עיצוב כמו צעד ליתוגרפיה רך תקן 16 , 2.1.1 17.
    4. מכסים את השבב מערך microcryogel על המערך PDMS מפליט Pin, יישור כל microcryogel עם הפין מפליט במערך. הקש את השבב מערך microcryogel לקראת המערך pin מפליט לדחוף את microcryogels החוצה microwells עם הסיכות בולטות על המערך pin מפלט PDMS למסוק microcryogels בודדים.
    5. לקצור את microcryogel לתוך המים ולאסוף אותם בעזרת תא strainers. השתמש מסננת אחת כדי לאסוף microcryogels של שבב אחד (כלומר, 600 microcryogels).
    6. שטיפת microcryogels עם NaBH 0.1 M 4 על קרח במשך 20 דקות להרוות את שאריות אלדהיד uncross-מקושר. השתמש 5 מ של 0.1 M NaBH 4 לכל שבב. התעלם NaBH 4. ולשטוף עם יונים 5 מ"ל מים למשך 3 עד 5 פעמים, 15 דקות בכל פעם.
    7. למחוק את המים מסננת התא, לאסוף את microcryogels לתוך אשכול אחד לכל תא מסננת ומניחים אשכול אחד אחד צלחת פטרי של 35 מ מ, באמצעות פינצטה מעוקל. להוסיף 50-70 µL יונים מים לאשכול בכל ולכסות את מכסה צלחת פטרי. טפח בעדינות על צלחת פטרי על פלטת שולחן לשלב את כל microcryogels, כך microcryogels לא משקרים על גבי microcryogel נוספת כדי ליצור של טפט של microcryogels על פני הפטרי.
    8. להקפיא את microcryogels שנקטפו ב-20 ° C עבור 4 עד 16 שעות לפני lyophilizing אותם עבור 2 h (ראה שלב 1.2.7). לאחסן microcryogels בוואקום בטמפרטורת החדר עד שימוש נוסף.
  2. אפיון של microcryogels
    1. להעריך את נקבוביות microcryogels על-ידי סריקת הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM).
      1. Immobilize microcryogels שנקטפו, lyophilized על גבי בעל מדגם על ידי דבק דו-צדדי והמעיל עם זהב עם coater לרעוד. להוציא עבור 90 s, לפני הדמיה ב SEM 11. להעריך ולנתח את ההפצה של קטרים של הנקבוביות ב microcryogel של שבע תמונות SEM שונות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
    2. שוקל אשכול אחד של 600 lyophilized microcryogels בצלוחית 35 מ מ למשקל של ג'לטין יבשים microcryogels (גרמים). להוסיף מים µL יונים 60 מקבץ של lyophilized microcryogels ולחכות 30 s עבור microcryogels לספוג את המים באופן מלא להתנפח. לשקול את microcryogels נפוחות. יחס נפיחות
      1. לקבוע האיזון ואת נקבוביות microcryogels, כמו היחס בין המשקל של microcryogels נפוחות של ג'לטין יבשים microcryogels, היחס בין משקל של מים שנערך ב microcryogels לזה של microcryogels רטוב, בהתאמה 13.
    3. Injectability מידה של microcryogels באמצעות משאבה מזרק לתכנות משולב עם כוח דיגיטלי מד 14.
      1. כתם 600 חתיכות של microcryogels על ידי Trypan כחול ו להשעות בפתרון 600 µL 15% ג'לטין כדי להשיג תפוצה הומוגנית. לטעון את הבולם microcryogel 1 מ"ל במזרק 1 מ"ל. להזריק את התערובת דרך מחט 27-מד המצורפת את המזרק 1 מ"ל באמצעות משאבה מזרק לתכנות בקצב הזרימה של 1 מ"ל לדקה
      2. הזרקת בזמן אמת צג כוח בכוח דיגיטלי מד בדיקות, התווה את עקומת כוח-זמן. לאחר ההזרקה, לבחון את תקינות microcryogels תחת מיקרוסקופ.
        הערה: סקאוטרים מושעה בפתרון ג'לטין 15% (wt/כרך) יכול להיות בצורה חלקה מוזרק, נשארה לאחר ההזרקה-
    4. לאפיין את degradability של microcryogels.
      1. ראשית, למדוד את המשקל של אשכול אחד של 600 microcryogels lyophilized בצלוחית 35 מ מ כמו משקל יבש. לאחר מכן, לטבול microcryogels lyophilized 600% 0.025 מ ל 2 (vol/כרך) טריפסין/EDTA.
        2. Microcryogels
      2. לאסוף מן הפתרון באמצעות מסננת תא בנקודות זמן שונות (כלומר, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 דקות). הפתיל פתרון עודף משם עם טישו. למדוד את המשקל של microcryogels בנקודות זמן שונות ולחשב למידת השפלה, כמו היחס בין המשקל של microcryogel בנקודת זמן מסוימת לזה של microcryogel בזמן אפס.
  3. Autoloading של תאים לתוך microcryogels כדי microtissues 3D טופס
    1. לחטא microcryogels מ שלב 2.1.8 תגובה על אתילן אוקסיד מערכת עיקור בחשיפה גז 12 שעות ולאחריו 12 שעות degassing תחת vacuum.
    2. לבחור שומן, נגזר mesenchymal סטרומה תאים אנושיים (hMSCs) לטיפול של העכבר איסכמי hindlimb. תאים ולבודד שגרות בעקבות דיווח כאמור 18.
    3. HMSCs תרבות בבית הגידול בינוני המכיל 2% סרום שור עוברית (FBS) 10 ננוגרם למ"ל גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 10 ננוגרם למ"ל נגזר טסית פקטורי גדילה bb (PDGF-bb), 1 X אינסולין transferrin סלניום (ITS), דקסמטסון 10 -8 מ', 10 -4 M חומצה אסקורבית 2-פוספט, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ב- DMEM/F12. המעבר את התאים על היחס של 1:3 כאשר confluent. להשתמש בתאים של המעבר 3 עד 5 הניסויים הבאים.
    4. למסוק hMSCs עם טריפסין, לכמת את מספר הטלפון באמצעות חדר הספירה פוקס-רוזנטל, resuspend על צפיפות של 8 x 10 6 תאים/מ ל מדיום הגידול hMSCs.
    5. פיפטה 60 µL hMSCs השעיה על גבי טפט של 600 microcryogels בקוטר של 400 מיקרומטר בקערה 35 מ מ מ סעיף 2.1. תאים נספגים באופן אוטומטי לתוך נקבוביות המיקרו-מבנים microcryogels.
    6. תחזוקה בתוך תא humidified דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאפשר תאים לצרף. לאחר שעתיים של דגירה, להוסיף 2 מ"ל תרבות בינוני. לשנות את המדיום כל יומיים. תרבות טעונים hMSCs microcryogels 2 ימים ליצור 3D microtissues.
    7. לאחר 2 ימים culturing, פיפטה microcryogels נטען hMSCs 100 לכל טוב על צלחת 96-ובכן, להוסיף µL 120 של הפתרון עובד resazurin המוכנים לפי היצרן ' s ההוראה בכל טוב. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. קרינה פלואורסצנטית
      1. זיהוי של resazurin מטבוליזם על ידי תאים קיימא קורא microplate עם אורך גל האור עירור של 560 nm ו פליטת אור גל של 590 ננומטר. ליצור עיקול רגיל של מספר הטלפון הנייד נגד קרינה פלואורסצנטית שימוש hMSCs כדי לבצע אינטרפולציה מספר הטלפון הנייד של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לניסוי בעתיד על פי פרוטוקול ערכת 13.
    8. להעריך את מספר hMSCs ב microcryogels מיום 0 ליום 4 שימוש resazurin כפי שמתואר צעד 2.3.7 מיום 0 יום 4-
    9. כתם תאים microcryogels עם שבערך דילול של Calcein AM, לדילול 1:250 Propidium יודיד (המכונה חיים/מתים מכתים) בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) ולצפות תחת מיקרוסקופ זריחה או מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית.
  4. הזרקה של תלת-ממד microtissues ויוו לטיפול של CLI במודל עכבר
    1. להקים hindlimb קריטי איסכמיה של עכברים העירום הנשי BALB/c כמו שדווח 11 , 19 כדי לקבוע את האפקט הטיפולי של טיפול מבוסס-microtissue 3D.
    2. להעביר את microtissues צעד 2.3.6 באמצעות פיפטה 5-mL לתוך מסננת תא ולסנן משם המדיום תרבות.
    3. Resuspend microtissues 3D טעונים hMSCs ב- 15% ג'לטין פתרון, צפיפות של microcryogels 100 לכל 100 פתרון µL.
    4. לפני הניתוח, לחטא כלי ניתוח על ידי תא לחץ ולבצע ניתוח בחדר ניתוח בעלי חיים במרכז המתקן חיה.
    5. הנח את העכבר אל החדר אינדוקציה הרדמה המכיל 1-3% איזופלוריין 100% חמצן בספיקה של 1 ליטר לדקה אריתרומיצין החל על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות. דרך חתך בעור 1-ס מארוך, מאתרים ומפסיקים את עורק הירך ואת סניפיה בתפרים משי 5-10, בלו 19.
    6. הכנס indocyanine ירוק (ICG) (0.1 מ"ל של µg 100/mL) דרך הווריד הזנב של זריקה כדי לפקח על זרימת הדם. לבצע הדמיה פלורסצנטיות ICG באמצעות פלורסצנטיות מערכת הדמיה (כאן, מערכת תוצרת בית) הגיאומטריה של השתקפות 11.
    7. Intramuscularly להזריק microtissues לתוך שלושת האתרים של השריר העדין סביב החתך בעורק באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 23-מד-
    8. לאחר הניתוח, לחמם את העכבר עם כרית מחוממת לכלוב. שחזור. מזריקים subcutaneously meloxicam כדי להקל על הכאב ולנטר ברציפות עד ער.
    9. לאחר 28 ימים, לנטר את היעילות הטיפולית של האיבר שטופלו microtissue תלת-ממד על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה 11.
      הערה: להזריק subcutaneously meloxicam כדי להקל על הכאב כאשר העכבר הראה גפה ספונטנית.
    10. Euthanize עכברים עם פחמן דו חמצני לאחר השלמת הניסויים.
      הערה: כאן, המתת חסד עם פחמן דו חמצני בוצעה לפי פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה חיה על מרכז של אנליזה ביו-רפואית, באוניברסיטת צינג.

3. הרכבה של Microtissue מערך השבבים לסינון סמים תפוקה גבוהה

  1. הרכבה של מערך microcryogel לתרבות בשבב תא
    1. שינוי העיצוב בסעיף 1.1 על-פי ממדי הצלחת רב היטב קונבנציונלי, כלומר, עבור תבנית 384-multi-ובכן, עיצוב מערך × 24 16 בארות (שורה לפי עמודה), כל אחד בקוטר 2 מ מ מרכז למרכז ריווח 4.5 מ מ.
    2. לייזר חריטה על גבי גיליון PMMA עבה מיקרומטר 500 כמתואר בסעיף 1.1.
      3. Microcryogels
    3. Fabricate כמתואר בסעיף 1.2 באמצעות שהשבב 384-multi-ובכן מערך המתקבל שלב 3.1.2. זה מערך המכיל microcryogel מיועדת כמו השבב מערך microcryogel.
    4. לרחוץ את השבב מערך microcryogel עם 50 מ ל- 0.1 M-NaBH-4 כדי להרוות את כל אלדהיד שיורית uncross-מקושרים, ואז שוב ושוב לשטוף עם יונים 50 מ"ל מים כבר 3 פעמים, שעתיים בכל פעם.
    5. למחוק את המים, להקפיא את השבב מערך microcryogel ב-20 ° C עבור 4 עד 16 שעות לפני lyophilizing על פי שלב 1.2.7.
    6. עיצוב מערך שינוי 384-multi-הבאר בשלב 3.1.1 להכיל 16 × 24 בארות, כל אחד בקוטר 3 מ מ מרכז למרכז ריווח 4.5 מ מ.
    7. להסיר צד אחד של הגיבוי של גיליון של דקים (10 מיקרומטר) מסתיימים דו-צדדית דבק סלוטייפ ולהדביק אותו לצד אחד של פיסת גיליון PMMA 3-מ מעבה. לייזר חריטה העיצוב משלב 3.1.4 על גבי גיליון PMMA זה 3-מ מעבה לפי סעיף 1.1. מערך זה הוא יועד המערך מאגר.
    8. יישור המערך microcryogel שבב עם השבב מערך מאגר וציות יחד בחוזקה כדי להרכיב את השבב מערך microcryogel תלת-ממד עבור תרבית תאים על שבב. לחטא לקרינה אולטרה סגול עבור ה 1
    9. חנות microcryogel תלת-ממד מערך שבבי בואקום בטמפרטורת החדר לניסויים נוספים-
  2. סמים הקרנת במערכים 3D microtissue
    1. למלא תיבה רטוב עם 25 מ ל מים מיוננים סטרילי כדי לשמש תא לחות על תרבית תאים. קדם הלוהט % 5 humidified חממה 2 CO ל- 37 מעלות צלזיוס.
    2. לקצור תאי סרטן ריאות שאינם קטנים התא (NCI-H460), תאי קרצינומה hepatocellular (HepG2) מן הלוחות תרביות רקמה על פי הנוהל המקובל, להשעות מחדש ב תרבות המדיה צפיפות הסופי של 1.0 x 10 6 תאים למ"ל. לערבב ביסודיות.
      הערה: RPM1640 עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 µg 100/mL סטרפטומיצין משמש NCI-H460. להשתמש DMEM עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 µg 100/mL סטרפטומיצין HepG2.
    3. להסיר תא לחות חממה. השתמש פינצטה בזהירות המקום 3D שהורכב microcryogel מערך שבב מ שלב 3.1.9 בבית הבליעה לחות. קח זהירות לא להרטיב את microcryogels עם מים בתא.
    4. לערבב התליה תא ביסודיות, ואז aliquot µL 3 של השעיה תא ישירות על גבי microcryogel כל טוב.
      הערה: הטיפ פיפטה יגע בקלילות את פני השטח של microcryogel לפני גירוש תא ההשעיה. תאים הם נטען אוטומטית microcryogel על ידי ספיגה. זרע לא התאים הבארות היקפיים.
    5. להוסיף 10 μL של מדיה מכל קידוח לאחר תאים הם נזרע לתוך microcryogel באמצעות פיפטה רב ערוצית, כגון מלווה נוזלי 96-ערוץ. בינוני מתווסף גם בארות היקפיים.
      הערה: שימוש RPM1640 מדיה עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 streptomyci 100 µg/mLn עבור תאים H460. להשתמש במדיה DMEM עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100 µg 100/mL סטרפטומיצין עבור תאים HepaG2.
    6. תרבות המערך microcryogel טעון תא םרות תא לחות במשך 24 שעות ביממה ב- 5% humidified חממה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס למערך 3D microtissue טופס.
    7. התמוססות דוקסורוביצין, IMMLG-8439 9 ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ליצור פתרון מניות של 10 מ מ. לדלל סמים עם תרבות בינוני כדי ליצור מעבר הדרגתי ריכוז דילול 10-fold 2 ננומטר מיקרומטר 200.
    8. µL להוסיף 10 פתרונות סמים לתוך כל טוב. השתמש 0.1% דימתיל סולפוקסיד (מדולל בינוני) של הפקד. דגירה המערך microtissue 3D טעון סמים ב- 5% humidified חממה 2 CO ב 37 ° C עבור ה 24
    9. להוסיף 4 µL resazurin פתרון מלאי כל טוב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למערך ה 2 מקום 3D microtissue בקורא ה-microplate ולגלות זריחה של resazurin מטבוליזם על ידי התאים קיימא-גל אור עירור של 560 nm ו פליטת אור גל של 590 nm.
    10. להחסיר את האות הבסיסית resazurin בארות כל לפני עיבוד נתונים נוספים. חישוב השבר הכדאיות התא של כל טוב על-ידי חלוקת האות פלורסצנטיות ע י האות הממוצע פלורסצנטיות הבארות שליטה.
    11. התווה את עקומת מנה-תגובה ההתוויה תוכנה עם השבר הכדאיות תא ציר ה-y, את הלוגריתם בסיס 10 של ריכוז התרופה כמו ציר ה-x. אינטרפולציה הריכוז עיכוב 50% (IC50)-השבר הכדאיות תא של 0.5-

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור ואפיון של microcryogels עבור microtissue תלת-ממד מערך.

על פי פרוטוקול זה, microcryogels זוייפו. טופס 3D microtissues ו microcryogels בודדים או מערכים microcryogel, הוחלו על טיפול משובי וסמים הקרנה, בהתאמה (איור 1). Microstencil שבבים מפוברק מן PMMA הוחלו כמו micromolds עבור microcryogel שבבים. יכול להיות מוכנים גיאומטריים משתנה השבב מערך microstencil. בחרנו נציג 45 מ מ x 14 מ ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרגנרציה לרפואה במבחנה דגמים להקרנה סמים הם שני יישומים חשובים בשביל לרקמות הנדסה5,6,7,8,9. בעוד שני יישומים לצרכים שונה לחלוטין, מכנה משותף ביניהם טמון בצורך ביונים יותר culturing תנאי כדי לשפר את התא פונקציות19. רק עם פונקציות משופרות תא במחקר אפשר לטפל טוב יותר מחלות20,21<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (מענקים: 81522022, 51461165302). המחברים רוצה להודות לכל חברי המעבדה Du לסיוע כללי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ג'לטיןסיגמאG7041כל שאר הריאגנטים נרכשו מסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) אלא אם כן צוין אחרת.
גלוטראלדהיד J& K902042משמש כמקשר צולב בהכנת חומר.
תלוש כיסוי זכוכית (24 x 50 מ"מ)CITOGLASS, סין10212450Cכדי לגרד תמיסת מבשר על שבבי מערך מיקרוסטנסילים.
נתרן  בורוהידריד, NaBH4Beijing Chemical Works116-8כדי לשטוף את שאריות הגלוטראלדהיד לאחר הג'לציה.
צנצנת ואקוםאספרטס, סיןVC8130לשימור מיקרוג'לים בוואקום.
יריעות פולימתיל-מתאקרילט (PMMA) Sunjin אלקטרוניקה ושות', בע"מ, סיןגיליונות PMMA רגילים.
מערכת לייזר RayjetRayjet, אוסטרליהRayjet 50 C30לחריטת יריעות PMMA ליצירת בארות.
מנקה פלזמהMycro Technologies, ארה"בPDC-32Gכדי להפוך את PMMA להיפופילית.
ליופילייזרבויקאנג, סיןSC21CLלליופיליזציה של חומרים.
תמיסת Trypan Blue (0.4%)Zhongkekeao, סיןDA0065לצביעת מיקרוג'לים.
דוקסורוביצין הידרוכלורידENERGY CHEMICAL, סיןA01E0801360010לבדיקת עמידות לתרופות של תאים במיקרוג'ל דו-ממדי או תלת-ממדי.
מבחן חי/מתDojindo Molecular Technologies (קומאמוטו, יפן)CS01-10להבחנה בין תאים חיים ומתים.
Cell Titer-BluePromega (ויסקונסין, ארה"ב).G8080לבדיקת כדאיות התא.
מסננת תאיםBD Biosciences, ארה"ב352360לאיסוף מיקרוג'לים.
D-LuciferinSYNCHEM (גרמניה)s039כדי להדביק תאים.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקFEI, ארה"בQuanta 200לאפיון מורפולוגיה של מיקרוג'ל.
  מכונת בדיקה מכניתBose, ארה"ב3230למדידת תכונות מכניות.
משאבת מזרק ניתנת לתכנות World Precision Instruments, ארה"בALADINI 1000לבדיקת injactabili.
מד כוח דיגיטליHBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., סיןH-50 כדי לבחון את injactabiliy.
מערכת עיקור תחמוצת אתילןאנפרולן, עיקור אנדרסון, בע"מ, נהר האו, NCAN74iלעיקור מיקרוג'לים עם גז תחמוצת אתילן.
קורא מיקרופלייטמכשירים מולקולריים, ארה"M5למדידת עוצמת הקרינה במיקרו-מערך.
מיקרוסקופ קונפוקליניקון, יפןA1Rsiכדי לצפות בהתפלגות התאים בתלת מימד.
קסנוגן  מערכת הדמיה Lumina IICaliper Life Sciences, USAIVISלמעקב אחר תאים בבעלי חיים.
סטטיון עבודה נוזליתעיצוב משמש, ארה"בS-pipetteלהעמסת מתלה בינוני או תא גבוה.
ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179(2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141(2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581(2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056(2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

3D MicrotissuesMicrocryogel FabricationInjectable Regenerative TherapyHigh throughput Drug ScreeningCryogelation TechnologyGelatin MicrocryogelsCell loaded CarriersOn chip AssemblyMouse Limb IschemiaResazurin Assay

מאמרים קשורים