אנו מדגימים שיטה לתמונה מולקולות מרובות בתוך מבנים ננו הטרוגניים בדייקנות מולקולה בודדת, תוך שימוש בחוזקה מחודשת ובזהירות של נוגדנים שכותרתו fluorescently.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מאוד מרבב, סופר ברזולוציה הדמיה של תאים T באמצעות madSTORM
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה מבנים הסלולר הטרוגנית באמצעות מיקרוסקופית מולקולה אחת מולקולה כבר הפריע על ידי דיוק לוקליזציה מספקת יכולת ריבוב. באמצעות נוי פלורסנט סמנים fiducial ננו, אנו מתארים את תיקון סחיפה הליכי יישור נדרש להשיג דיוק גבוהה מיקרוסקופית לוקליזציה מולקולה אחת. בנוסף, אסטרטגיה חדשה ריבוב, madSTORM, מתואר שבו מולקולות מרובות ממוקדות באותו תא באמצעות מחייב רציף elution של נוגדנים פלורסנט. MDSTORM מודגם על תא T מופעל כדי לדמיין את מיקומם של מרכיבים שונים בתוך מבנה מרובה חלבון, מרובת חלבון הנקרא מיקרו קולסטר קולטן התא. בנוסף, היישום של madSTORM ככלי כללי להדמיה של מבנים רב חלבונים נדון.
מבוא
מגוון רחב של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה טכניקות פותחו כדי להתגבר על גבול עקיפה של מיקרוסקופ אור (~ 200 ננומטר). בין אלה היא קטגוריה של טכניקות הנקראות מולקולה מולקולה לוקליזציה מיקרוסקופית (SMLM) הכוללת צילום לוקליזציה לוקליזציה מיקרוסקופ (PALM) ו סטוכסטי שחזור אופטי מיקרוסקופ (STORM). טכניקות SMLM לשתף את השימוש fluorophores כי ניתן לעבור בין (פלורסנט) ו כבוי (כהה / צילום), המאפשר לוקליזציה רצף של הקרינה מ מולקולות בודדות 1 , 2 , 3 .
בשל תאימותו עם צבעים מסחריים זמי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
זהירות: יש לעיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה רעילים מסרטנים. אנא השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים בעת ביצוע הפרוטוקול, כולל שימוש בבקרת ההנדסה (מכסה המנוע, מכסה הכפפות) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות).
1. Multiplexed הדמיה של תאים T הופעל
- ישירות נוגדנים מצמידים עם Alexa-647 (A647) צבע באמצעות אלקסה 647 ערכת תיוג נוגדנים. עקוב אחר פרוטוקול תיוג המסופק על ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטת elution רציף שיטת מכתים שימש לייצר את התמונה multistlexed madStorM של microclusters ומבנים אחרים בתא T מופעל Jurkat ( איור 1 , לבדוק את היישור דמות). כל תמונה pseudo בצבע מייצג סיבוב אחד של הדמיה madSTORM רכשה צעדים 1.1.1-1.3.13. כפי שתואר לעיל 10 , שדה הראייה צריך להיות פיקוח על אות שיורית של נוגדן הקודם, לא eluted כדי למנוע crosstalk בין מטרות מרובות. יתר על כן, כמו יעילות elution י.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההעתקה הסידורית, תיקון הסחיפה ויישורי היישור ב- madStORM מאפשרים הדמיה מדויקת ומרובת מאוד של מבנים הטרוגניים בתאים. 10 בנוסף, MadSTORM נמנע את המגבלות של צבע רב STORM כגון סטייה כרומטית ותת-אופטימלי photoswitching / תכונות פליטה של צבעי אדום לא 9 , 12 . כמו צעד elution מפחית באופן משמעותי את ההפרעה הסטרית נוגדנים קשורה ברצף, madSTORM ניתן להשתמש כדי לבצע הדמיה חוזרת של דגימות התא מעבר 6-10 סיבובים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה לגלות.
תודות
אנו מודים Xufeng וו עבור גישה למיקרוסקופ STORM. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר הפנימי של המרכז הלאומי לסרטן (NCI) מרכז לחקר הסרטן ואת הלב הלאומי לבריאות דם המכון (NHLBI).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תא כיסוי 8 באר | Lab-tek | 155409 | |
| תמיסת פולי-L-ליזין 0.1% | סיגמא-אולדריץ' | P8920 | |
| NV-100 ננומטר ננו-יהלום פלואורסצנטי | אדמאס | אדום FND | |
| אנטי-CD3&אפסילון; נוגדן | BD Biosciences | 555329 | |
| אלבומין סרום בקר, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | |
| ג'לטין מסרטן מעור דגי מים מתוקים | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 ערכת תיוג נוגדנים | Thermo Fisher | A20186 | |
| מגנזיום כלוריד הקסהידראט | 138924 | סיגמא-אולדריץ' | |
| Sigma-Aldrich | P6757 | ||
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Cysteamine |
| Sigma-Aldrich | 30070 | ||
| Cyclooctatetraene רעיל מאוד 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | רעיל מאוד, רגיש לאוויר |
| 10x PBS | KD רפואי | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD רפואי | RGF-3385 |
מקורות
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
