MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

תקציר

RNA מחייב חלבונים (RBPs) לקבוע את גורלם של RNAs. הם משתתפים בכל המסלולים ביוגנזה רנ"א ובמיוחד לתרום שלאחר תקנת גנים תקנה (PTGR) של RNAs השליח (mRNAs). בשנים האחרונות, מספר mRNA-proteomes כבול מן השמרים שורות תאים יונקים היו מבודדים בהצלחה באמצעות שיטה חדשנית בשם "mRNA אינטראקציה ללכוד", המאפשר זיהוי של mRNA מחייב חלבונים (mRBPs) ישירות מתוך סביבה פיזיולוגית. השיטה מורכבת מ - vivo אולטרה סגול (UV) crosslinking, משוך מטה וטיהור של מסנג 'ר ribonucleoprotein קומפלקסים (mRNPs) על ידי חרוזים אוליגו (DT), ואת זיהוי שלאחר מכן של חלבונים crosslinked על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). לאחרונה, על ידי יישום שיטה זהה, כמה צמחים mRNA כבול חלבונים דווחו בו זמנית ממקורות רקמה שונים ארבידופסיס : שתילים etiolated, רקמת עלה,עלה prooplasts mesophyll, ותאי שורש תרבותי. כאן, אנו מציגים את אופטימיזציה mRNA אינטראקציה ללכוד שיטת ארבידופסיס thaliana protoplasts mesophyll עלה, סוג התא המשמש כלי רב תכליתי עבור ניסויים הכוללים מבחני הסלולר השונים. התנאים התשואה חלבון אופטימלי כוללים את כמות הרקמות החל ואת משך קרינה UV. ב- mRNA-proteome שהתקבל בניסוי בקנה מידה בינוני (10 ⁷ תאים), RBPs ציינו כי קיבולת ה- RNA מחייב נמצאו לייצג יתר על המידה, ורבים RBPs מזוהים זוהו. הניסוי יכול להיות scaled up (10 ⁹ תאים), ואת השיטה אופטימיזציה ניתן להחיל על סוגי תאים צמחיים אחרים מינים כדי לבודד באופן רחב, קטלוג, ולהשוות proteomes mRNA- קשורה בצמחים.

מבוא

Eukaryotes להשתמש RNA מספר ביוגנזה מסלולים רגולטוריים כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים תאיים. בין סוגים ידועים של רנ"א, mRNA הוא מגוון מאוד ונושא קיבולת קידוד של חלבונים ואת האיזופורמים שלהם ^1. מסלול PTGR מכוון את גורלם של pre-mRNAs ^{2 , 3} . RBPs ממשפחות גנים שונים לשלוט על הרגולציה של RNA, ב PTGR, mRNAs ספציפיים mRNAs מדריך דרך אינטראקציות פיזיות ישירות, יצירת mRNPs תפקודית. לכן, זיהוי ואפיון mRBPs ו mRNPs שלהם הוא קריטי להבנת הרגולציה של חילוף החומרים mRNA נייד ^2. מעל שלושת העשורים האחרונים, שונים בשיטות חוץ גופית - כולל מבחני ניידות RNASA ניידות (REMSA) מבחנים, אבולוציה שיטתית של ligands ידי מבחני העשרה מעריכי (SELEX) מבוסס על ספריות הנגזרות בונה, RNA Bind-N-Seq (RBNS), radiolabeled או כמותיפלואורסצנטי RNA מחייב מבחני, קריסטלוגרפיה רנטגן, ו ספקטרוסקופיה תמ"ג ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} - יושמו באופן נרחב על מחקרים של RBPs, בעיקר תאים יונקים. התוצאות של מחקרים אלה של RBPs יונקים ניתן לחפש באמצעות RNA מחייב DataBase חלבון (RBPDB), אשר אוספת את התצפיות שפורסמו ¹⁰ .

למרות אלה בגישות חוץ גופית הם כלים רבי עוצמה, הם קובעים את מוטיבים RNA קשורות מתוך מאגר RNA נתון רצפים ולכן מוגבלים ביכולתם לגלות RNAs היעד החדש. הדבר נכון גם לגבי אסטרטגיות חישוביות לחזות RBPs גנום רחב, אשר מבוססים על שימור רצף מבנה חלבון ¹⁵ . כדי להתגבר על זה, שיטה ניסיונית חדשה חהS שהוקם המאפשר זיהוי של מוטיבים RNA כי RBP של עניין אינטראקציה עם, כמו גם על קביעת המיקום המדויק של מחייב. שיטה זו, המכונה "crosslinking ו immunoprecipitation" (CLIP), מורכב ב crosslinking UV vivo ואחריו immunoprecipitation ¹¹ . מחקרים מוקדמים הראו כי photactivation של DNA ו RNA נוקליאוטידים יכול להתרחש אורכי גל UV גדול מ 245 ננומטר. התגובה באמצעות thymidine נראה מועדף (דרגה של photoreactivity ירד: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) ¹² . באמצעות אור UV עם אורך גל של 254 ננומטר (UV-C), נצפתה כי קשרים קוולנטיים בין נוקליאוטידים RNA ו שאריות חלבון נוצרות כאשר בטווח של רק כמה אנגסטרומים (Å). התופעה נקראת אפוא "crosslinking" באורך אפס של RNA ו- RBP. זה יכול להיות ואחריו פרוטה טיהור מחמירים Dure עם רקע קטן ^{13 , 14} .

אסטרטגיה משלימה CLIP היא לשלב ב vivo UV crosslinking עם זיהוי חלבון כדי לתאר את הנוף של RBPs. מספר פרוטוקולים כאלה של גנום- mRNA, היו מבודדים מתאי שמרים, תאי גזע עובריים (ESCs) וקווים של תאים אנושיים ( כלומר, HEK293 ו- HeLa) תוך שימוש בגישה הניסויית החדשה, הנקראת "mRNA אינטראקציה ללכוד" ^{18 , 19 , 20 , 21} . השיטה מורכבת של vivo UV crosslinking ואחריו טיהור mRNP ו- MS מבוסס proteomics. על ידי יישום אסטרטגיה זו, רבים חדשים "moonlighting" RBPs המכילים RBDs שאינם קנוניים התגלו, וזה הפך ברור כי יותר חלבונים יש RNA מחייב קיבולת מאשר בעבר היה אמור להיות"15 ^{, 16 , 17.} השימוש בשיטה זו מאפשר ליישומים חדשים וליכולת לענות על שאלות ביולוגיות חדשות בעת חקר RBPs לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה בחן את שימור של פרוטאומה ה- mRNA קשור (הליבה RBP פרוטאומה) בין שמרים לתאים אנושיים ²² .

RBPs צמחים כבר נמצא להיות מעורב בצמיחה ופיתוח ( למשל , בתקנה שלאחר תעתיק של זמן הפריחה, השעון היממה, ביטוי גנים במיטוכונדריה ו chloroplasts) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29} . יתר על כן, הם חשבו לבצע פונקציות בתהליכים הסלולר להגיב על מדגיש abiotic ( למשל, קר, בצורת, saLines, וחומצה אבסיסית (ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34} . ישנם יותר מ 200 גנים RBP החזוי בגנום ארבידופסיס thaliana , המבוססת על מוטיב הכרה RNA (RRM) ו K הומולוגיה (KH) מוטיבים רצף מושלם; באורז, כ -250 כבר ציינו ^{35 , 36} . יש לציין כי רבים חזו כי RBPs נראים ייחודיים לצמחים ( למשל, לא מטאזואנים אורתולוגים לכ 50% של ארבידופסיס RBPs החזוי המכיל תחום RRM) ³⁵ , מה שמרמז כי רבים עשויים לשרת פונקציות חדשות. הפונקציות של רוב RBPs החזוי להישאר uncharacterized ²³ .

בידוד של proteomes mRNA קשורה מן שתילים ארבידופסיס etiolated, רקמת עלה, תאים שורש תרבותי, ו protoplasts mesophyll עלה באמצעות שימושלכידת mRNA אינטראקציה לאחרונה דווח ^{38 , 39} . מחקרים אלה מדגימים את הפוטנציאל החזק של קיטלוג שיטתי של RBPs פונקציונליים בצמחים בעתיד הקרוב. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכידת mRNA אינטראקציה מן protoplasts צמח ( כלומר, תאים ללא קירות התא). ארבידופסיס thaliana עלה prooplasts mesophyll הם הסוג העיקרי של תא עלה. Protoplasts מבודד לאפשר גישה אופטימלית של אור UV לתאים. סוג תא זה יכול לשמש מבחני כי transiently להביע חלבונים אפיון פונקציונלי ^{40 , 41} . יתר על כן, Protoplasting הוחל על סוגים אחרים של תאים צמחיים ומינים ^{42 , 43 , 44} ( למשל, Petersson et al ., 2009; Bargmann and Birnbaum, 2010, ו- Hong et al , 2012).

השיטה כוללת סך של 11 צעדים ( איור 1 א ). ארבידופסיס protoplasts mesophyll עלה מבודדים הראשון (שלב 1) והם לאחר מכן UV מוקרן ליצירת mRNPs crosslinked (שלב 2). כאשר protoplasts lysed תחת תנאי denaturing (שלב 3), mRNPs crosslinked משתחררים במאגר תמוגה / מחייב ומשוך למטה על ידי אוליגו d (T) ₂₅ חרוזים (שלב 4). לאחר מספר סיבובים של שוטף מחמירים, mRNPs הם מטוהרים עוד ניתח. פפטידים denatured של mRBPs מתעכלים על ידי K proteinase לפני mRNAs crosslinked הם מטוהרים ואת איכות ה- RNA מאומת על ידי qRT-PCR (שלבים 5 ו -6). לאחר טיפול RNase וריכוז חלבון (שלב 7), איכות החלבון נשלטת על ידי SDS polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ואת מכתים כסף (שלב 8). ההבדל בין דפוסי הלהקה חלבון יכול בקלות להיות דמיינו בין מדגם crosslinked (CL) ומדגם לא crosslinked (לא CL;מדגם השליטה השלילי מ protoplasts כי אינו חשוף קרינה UV). זיהוי החלבונים מושגת באמצעות proteomics MS מבוססי. החלבונים מן המדגם CL מופרדים על ידי חד מימדי polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (1D-PAGE) כדי להסיר זיהום רקע אפשרי, הם "בתוך ג 'ל מתעכל" לתוך פפטידים קצרים באמצעות טריפסין, והם מטוהרים (שלב 9). ננו בשלב ההפוך כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים ספקטרומטריית מסה (ננו LC-MS) מאפשר קביעת כמות של חלבונים סופי של פרוטאומה כבול mRNA (שלב 10). לבסוף, mRBPs מזוהים מאופיינים וקטלג באמצעות ניתוח ביואינפורמאטי (שלב 11).

פרוטוקול

1. ארבידופסיס עלה Mesophyll Protoplast בידוד

הערה: ארבידופסיס prooplasts mesophyll עלה מבודדים למעשה כפי שתואר על ידי Yoo et al ., 2007, עם מספר שינויים ⁴⁰ .

1. גידול של צמחים
   1. משרים כ 200 ארבידופסיס thaliana Col-0 זרעים ecotype במים מעוקרים במשך 2 ימים ב 4 ° C בחושך לריבוד.
      הערה: מספר זה של זרעים הוא מספיק עבור מדגם אחד לא CL ודגימה אחת CL (ראה שלב 1.3).
   2. מכינים סירים עם תערובת 50% ( V / V ) של אדמה vermiculite ו להשרות את הסירים עם מים מזוקקים במגש כדי להרטיב את הקרקע.
   3. לזרוע ולהפיץ את הזרעים מרובדת על אדמה רטובה. אין לכסות את הזרעים עם קרקע נוספת כי זרעים Arabidopsis צריך אור נביטה.
      הערה: תנאי הגידול של הצמח הם 12 ° h / 12-h כהה מחזור ב 23 ° C,עם עוצמת האור של 100 μmol מ ^-2 s ^-1 , בחדר צמיחה במשך 5 שבועות לפני הפריחה. צמחים בני 4 שבועות יכולים לשמש גם ⁴⁰ .
      הערה: כל החומרים המתוארים והריאגנטים משלב 1.2.1 עד שלב 3.2.3 הם עבור שני דגימות ( כלומר, מדגם שאינו CL) מדגם הבקרה שאינו נתון לקרינה UV-C (ומדגם CL אחד) המחקר מדגם זה נתון לקרינה UV-C)).
2. הכנת תמיסת אנזים איזוטונית
   1. הפוך 80 מ"ל של פתרון איזוטוני איזוטוני ראשוני (400 mNitol מ"מ, 20 מ"מ KCl, ו 20 mM חיץ MES (pH 5.7)) ומיד לחמם את הפתרון של חממה 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. הוסף 1.2 גרם של Cellulase R10 ( w / v 1.5%) ו 0.32 גרם של Macrozyme R10 ( w / v 0.4%) אבקת כדי פתרון איזוטוני ראשוני חם חם.
   3. בזהירות להביא את אבקת האנזים לתוך פתרון על ידי יישום ערבוב עדין. ראפלחמם את הפתרון בחום 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עד כי הפתרון האנזים הוא בהיר בהיר בהיר.
   4. מגניב הפתרון על הקרח במשך 3 דקות ולהוסיף 800 μL של 1 M CaCl ₂ ו 800 μL של 10% ( w / V ) BSA לפתרון.
   5. Homogenize את הפתרון על ידי pipetting וסינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. Aliquot זה סופי פתרון איזוטוני איזוטוני לתוך שתי מנות פטרי בקנה מידה גדול (150 מ"מ x 20 מ"מ).
3. הכנת רצועות עלים של ארבידופסיס
   הערה: 150 עלים לכל צלחת פטרי מומלץ עבור מדגם אחד לא CL או מדגם CL אחד.
   1. בחר וחותכים סכים של 300 במלואה הרחיב 2 ^nd - או 3 ^rd -pair עלים אמיתיים (ממוצעים: 3 - 4 לכל שושנה) לתוך 0.5- עד 1 מ"מ רצועות עלים באמצעות גילוח חדש וחד.
   2. העברה לצלול את רצועות מיד לפתרון האנזים איזוטוניים.
      הערה: כדי למנוע מגע עם האור, כסה תמיד אתהוא צלחות פטרי עם רדיד אלומיניום. לא לרסק את העלים. ודא שכל הרצועות שקועות בתמיסה ואינן צפות על פני השטח.
4. בידוד של ארבידופסיס עלה mesophyll protoplasts
   1. מניחים את רדיד אלומיניום מכוסה צלחות פטרי לתוך desiccators ואקום לחדור את רצועות עלה תחת ואקום במשך 30 דקות. לאחר מכן, דגירה צלחות פטרי בחושך ללא רועד בטמפרטורת החדר למשך 2.5 שעות.
   2. בעדינות ובקצרה לנער את הכלים אופקית ביד, מנסה לשחרר את protoplasts לחלוטין לתוך פתרון האנזים.
5. קצירת וספירת הפרוטופלסטים
   1. מסנן את ההשעיה protoplast דרך 35 עד 75 מיקרומטר רשת ניילון. Aliquot תסנין של כל מדגם לתוך שתי צינורות 50 מ"ל התחתונה התחתונה (כ 20 מ"ל של תסנין בצינור זה).
   2. שוטפים כל צלחת פטרי עם 10 מ"ל של חיץ W5 (154 מ"מ NaCl, 125 מ"מ CaCl _{2, 5 KM מ"מ, ו 2 mM חיץ MES (pH 5.7)) להעביר את שאר protoplasts לפתרון האנזים. הוסף את זה 10 מ"ל סינון של כל מדגם צינורות. מכסים את צינורות עם רדיד אלומיניום ולשמור אותם על הקרח.}
   3. ספין כל ארבע צינורות 5 דקות ב 100 xg כדי גלולה protoplasts. מחק supernatant בעדינות resuspend את כדורי protoplast בצינור כל עם 10 מ"ל של חיץ W5.
      הערה: כאשר resuspending את כדורי protoplast, בעדינות להפוך את הצינור במהופך בעדינות לסובב את הצינור ביד עד כדורי נעלמו. לא פיפטה גלולה ישירות, כדי למנוע נזק לתאים.
   4. חזור על שלב 1.5.3 פעם אחת ולשלב ההשעיה protoplast משני צינורות של כל מדגם לתוך צינור אחד 50 מ"ל התחתונה התחתונה. שמור את הצינורות על הקרח.
   5. ספירת protoplasts באמצעות hemocytometer.
      הערה: כל 20 תאים בתוך 25 קוביות שווה 2 x 10 ⁵ protoplasts / מ"ל. 150 עלים צריך להניב כ 1 x 10 ⁷ תאים.Modulate יש מספר שווה של protoplasts בדגימות CL ו- CL.
   6. שמור על protoplasts על הקרח במשך 30 דקות. לאחר מכן, לסובב את צינורות 5 דקות ב 100 x גרם. מחק supernatant ו resuspend protoplasts בכל צינור עם 20 מ"ל של פתרון MMg (400 mnitol mM, 15 מ"מ MgCl ₂ , ו 4 mM חיץ MES (pH 5.7)).

2. ב vivo mRNA חלבון Crosslinking על ידי קרינה UV

הערה: שמור על הצינור הלא מדגם CL על הקרח. המדגם CL חייב להיות מיד קרינה UV.

1. מעבירים את ההשעיה protoplast המכיל 1 x 10 ⁷ תאים מן צינור מדגם CL לצלחת פטרי בקנה מידה גדול חדש (150 מ"מ x 20 מ"מ) ולהוסיף 30 מ"ל של פתרון MMG קר כקרח כדי לכסות את משטח הצלחת. מורחים את התאים במאגר MMG כולו על ידי pipetting עדין. מיד מקום צלחת פטרי ללא כיסוי העליון במנגנון crosslinking UV.
   הערה: הגובה בין מנורת UVואת צלחת פטרי הוא 8 ס"מ.
2. מסננים את המדגם עם אור UV 254 ננומטר UV ו 0.00875 W / ס"מ ² עוצמת UV במשך 1 דקות, 3 דקות, או 5 דקות. לאחר הקרנה, במהירות aliquot ההשעיה protoplast לשני צינורות חדשים 50 מ"ל התחתונה התחתונה. שטפו את החלק התחתון של המנה עם תוספת 5 מ"ל של פתרון MMG קר כקרח לאסוף את שארית protoplasts ולהוסיף ההשעיה תא אלה שתי צינורות.
   הערה: דקה אחת נבחרה כתנאי אופטימלי. ההסבר ניתן למצוא תוצאות נציג .

3. Protoplast תמוגה בתנאים דנטורינג

1. הכנת כדורי פרוטופלאסט עבור תמוגה
   1. ספין את הצינור הלא CL המדגם יחד עם שני צינורות מדגם CL משלב 2 ב 100 xg במשך 5 דקות וזורקים את supernatant. מניחים את הצינור של non-CL מדגם protoplast גלולה בחזרה על הקרח.
   2. הוסף 10 מ"ל של פתרון MMG קר כקרח כל צינור מדגם CL, genTly resuspend את כדורי, ולשלב אותם בחזרה לתוך צינור 50 מ"ל התחתונה התחתונה. ספין את הצינור ב XG 100 במשך 5 דקות. לאחר הסרת supernatant, לשמור על הדגימה CL גלולה protoplast גלולה על הקרח.
2. פרוטופלאסט תמוגה ו lysate protogenlast homogenizing
   1. הוסף 9 מ"ל של חיץ קר כקרח / חיץ מחייב (500 מ"מ LiCl, 0.5% ( w / V ) ליתיום Dodecyl סולפט (LiDS), 5 מ"מ Dithiothreitol (DTT), 20 מ"מ טריס HCl (pH 7.5), ו 1 מ"מ EDTA (pH 8.0)) לתא גלולה של כל מדגם. בערך lyse הפרוטופלסטים ידי pipetting למעלה ולמטה כ 20 פעמים עד ההשעיה הוא אור ירוק homogenously.
   2. לעבור lysate protoplast פעמיים דרך מזרק 50 מ"ל זכוכית עם מחט צרה (0.9 x 25 מ"מ ² ) עבור homogenization. דגירה lysate על קרח במשך 10 דקות. להקפיא lysates בחנקן נוזלי בחנות ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.

4. mRNP משוך מטה טיהורעל ידי אוליגו ד (T) ₂₅ חרוזים

הערה: כל החומרים ריאגנטים המתואר להלן, משלב 4.1 לשלב 4.4, הם רק מדגם אחד (כלומר, מדגם שאינו CL אחד או אחת מדגם CL). את lysate protoplast יש להוסיף מיד צינורות המכילים חרוזים לאחר חיץ supernatant חרוז / מחייב מחייב מושלך.

1. הכנה של אוליגו d (T) ₂₅ חרוזים מגנטיים עבור אוליגו (dT) ללכוד
   1. להפשיר את lysate protoplast קפוא בטמפרטורת החדר. כאשר lysate הוא מופשר לחלוטין, לשמור על הצינור של lysate על הקרח.
   2. Aliquot 1.8 מ"ל של אוליגו ד (T) ₂₅ חרוזים מגנטיים (5 מ"ג / מ"ל) לתוך 6 חדש 2 מ"ל עגול צינורות microcentrifuge התחתונה על הקרח. בכל צינור, לשטוף את החרוז השעיה homogenously עם μL 600 של חיץ תמוגה / מחייב ידי pipetting לזמן קצר למעלה ולמטה בעדינות מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. שמור את החרוזים על הקרח.
2. כריכה
   1. מקוםכל 6 צינורות המכילים את החרוזים לתוך מדף מגנטי ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, אשר יביא לכידת מגנטי של החרוזים ואת ניקוי של ההשעיה.
      הערה: כאשר הצינורות ממוקמים במעמד מגנטי, לחכות עד החרוזים הם שנתפסו לחלוטין, לפחות 3 דקות.
   2. מחק supernatant ו מיד aliquot 9 מ"ל של lysate protoplast אלה 6 צינורות. מערבבים היטב על ידי pipetting עד ההשעיה חום הומוגני מופיע דגירה החרוזים lysate protoplast ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות על ידי החלת סיבוב עדין.
      הערה: מומלץ זמן הדגירה מ 30 דקות עד 1 שעות.
3. כְּבָסִים
   1. מניחים את הצינורות בחזרה המדף מגנטי ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. כאשר כל חרוזים נלכדים בצד של צינורות, לאסוף את lysate protoplast לתוך 6 חדש 2-mL עגול צינורות microcentrifuge התחתונה באופן זמני לאחסן אותם 4 מעלות צלזיוס. אין להשליך את lysate protoplast מיד; לשמור על lysateב 4 ° C.
   2. הוסף 1.5 מ"ל של חיץ כביסה קר כקרח 1 (500 מ"מ LiCl, 0.1% ( w / V ) LiDS, 5 מ"מ DTT, 20 מ"מ טריס HCl (pH 7.5), ו 1 מ"מ EDTA (pH 8.0)) כדי חרוזים בכל צינור. Resuspend את החרוזים ולהחיל סיבוב עדין במשך 1 דקות. מניחים את הצינורות בחזרה לתוך המדף מגנטי ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות וזורקים את supernatant. חזור על צעד זה לשטוף עם חיץ לשטוף פעם אחת.
   3. חזור על אותו הליך של שלב שטיפה זה פעמיים באמצעות 1.5 מ"ל של חיץ לשטוף קרח קר 2 (500 מ"מ LiCl, 5 מ"מ DTT, 20 מ"מ טריס HCl (pH 7.5), ו 1 מ"מ EDTA (pH 8.0)) ופעם באמצעות 1.5 מ"ל של חיץ קר נמוך מלח מלח (200 מ"מ LiCl, 20 מ"מ טריס HCl (pH 7.5), ו 1 מ"מ EDTA (pH 8.0)).
      הערה: אם mRNPs היו מבודדים ביעילות מן lysate protoplast, לא צריך להיות "הילה" גלוי סביב גלולה חרוז במדגם CL במהלך שלב לשטוף עם חיץ לשטוף 2 ( איור 1 ב ).
4. אלוטי
   1. הוסף 500 μLשל חיץ elution (20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.5) ו 1 מ"מ EDTA (pH 8.0)) כדי חרוזים בכל צינור. בעדינות resuspend חרוזים לדגור על 50 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לשחרר את RNAs (A) זנב פולי. בעדינות resuspend את החרוזים פעם אחת על ידי pipetting. מניחים את הצינורות בחזרה המדף מגנטי ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. מעבירים לשלב את כל eluents (כ 3 מ"ל בסך הכל) כדי נקי, סטרילי RNase חינם, 15 מ"ל חרוט התחתית התחתית על הקרח.
      הערה: איכות וכמות של RNA ניתן לקבוע באופן מיידי באמצעות מכשיר ספקטרופוטומטר.
      הערה: ריכוז RNA של כל דגימה היא כ 10 ng / μL, שזכה לציון ₂₆₀ / A ₂₈₀ יחס של 1.9. A ₂₆₀ / A ₂₈₀ יחס צריך להיות בין 1.6 ו 2.0, כי מבודדים פולי (א) RNAs מוזל הם בדרך כלל יותר מ 70% טהור. אם ריכוז ה- RNA נמוך מדי, להגדיל את מספר protoplasts החל עד למקסימום של 10 ⁹ . דגימותיכול להיות קפוא בחנקן נוזלי נשמר על 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
   3. חזור על שלב 4.2 כדי צעד 4.4 עבור שני סיבובים נוספים ולהשתמש מחדש את oligo-d (T) ₂₅ חרוזים כדי לרוקן את רנ"א (R) E-polyed מ lysate protoplast.
      הערה: לאחר שלושה סיבובים של הליך הנפתח, לא אמור להיות סך של 9 מ"ל של eluent עבור כל דגימה CL או CL. בצע את כל העבודה ב 4 ° C כדי למנוע השפלה של רנ"א. בצע את שלב 4.5 או שלב 4.6 כדי להשתמש מחדש או לחדש את החרוזים.
5. הכנת מחדש בשימוש oligo-d (T) ₂₅ חרוזים
   1. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ elution קר קר פעם אחת עם 1 מ"ל של תמוגה קר כקרח / חיץ מחייב כדי להתאים את ריכוז LiCl מלח בחזרה 500 מ"מ.
   2. בצע את שלב 4.1, להשליך supernatant, להעביר את lysate protoplast מאוחסנים בכל צינור, וחזור על התהליך כולו משלב 4.2 לשלב 4.4 עבור שני סיבובים נוספים.
6. התחדשות של אוליגו d (T) ₂₅ חרוזים
   הערה: ניתן לאחסן חרוזים ולהשתמש בהם לניסוי נוסף (שימוש חוזר מקסימלי הוא שלוש פעמים).
   1. בצע את שלב 4.4, להוסיף 1 מ"ל של 0.1 M NaOH כדי חרוזים, ו דגירה על ידי סיבוב בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. עבור כל צינור, לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף 1 ו שלוש פעמים עם 1x PBS (pH 7.4) המכיל 0.1% Tween-20 עבור איזון. שמור את החרוזים מכל צינור μL 300 של סטרילי RNase חינם 1x PBS (pH 7.4) המכיל 0.1% Tween-20 ב 4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
      הערה: חרוזים המשמשים דגימות CL Arabidopsis בניסוי זה יכול לשמש רק עבור דגימות צמח אותו בפעם הבאה.

5. Proteinase K טיפול טיהור mRNA

1. טיפול ב- Proteinase K
   1. הוסף 8 μL של פתרון K Proteinase (2 מיקרוגרם / μL) ל 1 מ"ל של eluent מכל מדגם לעכל את החלבונים UV crosslinked. ברמערבולת iefly.
2. טיהור mRNA
   1. דגירה eluent ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. לטהר את RNA באמצעות ערכת טיהור RNA להסיר מזהמים שיורית.
      הערה: לאחר טיהור, RNAs מוכנים למבחן איכות RNA באמצעות assay qRT-PCR.
      הערה: ערכות אחרות, כגון ערכת מיני RNA ו מגיב TRIzol, ניתן להשתמש גם ¹⁴ .

6. QRT-PCR Assay

1. שעתוק לאחור
   1. להשיג סינתזה יעילה של cDNA גדיל הראשון באמצעות מערכת שעתוק לאחור, עם 1 מיקרוגרם של רנ"א כתבנית. לדלל את המדגם ל 5 ng / μL עם מים nuclease ללא.
2. CDNA כימות באמצעות qRT-PCR
   1. להגביר לכמת את cDNA באמצעות תערובת הורים qPCR ו בזמן אמת cycler PCR, עם 10 ng של cDNA כמו התבנית. השתמש בתוכנית הבאה PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות(שלב 1, מחזור אחד) ו 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך דקה 1 (שלב 2, 40 מחזורים).
      הערה: גן הייחוס המשמש כאן הוא גן בקרה פנימי אנדוגני, UBQ10 (AT4G05320). QRT-PCR primers עבור UBQ10 ו 18S rRNA תוארו Li et al ., 2014 ו Durut ואח ' , 2014, בהתאמה ^{45 , 46} . רצפי פריימר מופיעים בטבלת החומרים .

7. RNase טיפול ריכוז mRBP

1. טיפול RNase
   1. הוסף בערך 100 U של קוקטייל RNase המכיל RNase ו- RNase T1 לתוך 8 מ"ל של eluent. כלול מדגם שלילי שליטה עם קוקטייל RNase שבו eluent מוחלף על ידי מים ללא nuclease. מערבולת בקצרה ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
2. ריכוז mRBP
   1. לאחר עיכול RNase, לרכז את usu eluentG יחידות מסנן צנטריפוגלי. נפח הסיום הוא 75 μL, עם תשואה חלבון הכולל של כ 2 מיקרוגרם של כל מדגם לאחר ריכוז. מניחים את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

8. SDS-PAGE וכסף מכתים

1. SDS-PAGE
   1. מערבבים 25 μL של eluent מרוכז (מדגם CL) או מדגם שליטה (מדגם לא CL) עם μL 15 של צבע 2x טוען. מחממים את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לטעון אותו על ג'ל SDS-PAGE המכיל 5% ג 'ל לערום ו 12% פתרון ג'ל, כולל סמן חלבון.
   2. לעבות את החלבונים ב 60 V במשך 40 דקות נפרד ב 160 V במשך כ 1 שעות עד צבע הטעינה מגיע לסוף של ג'ל לפתרון.
2. מכתים כסף assay
   1. לשטוף את ג'ל SDS-PAGE פעמיים עם מים ultrapure במשך 5 דקות בכל פעם. בצע את הכתם כסף של חלבונים באמצעות ערכת כסף כסף מסחרי.
      הערה: להקות חלבון חייב להיות מוצג בתוך 5 דקות. אם להקות גלויים מעבר 5 דקות עם צבע בהיר מאוד, הוא הציע להגדיל את מספר protoplasts החל עד למקסימום של 10 ⁹ .

9. טריפסין תקציר של חלבון להקות טיהור פפטיד

1. טריפסין לעכל
   הערה: הפעלת ג'ל 1D-PAGE השני על ידי לקיחת עוד 25 μL של פתרון mRBP מרוכזים מכל מדגם עבור זיהוי mRBP; כסף מוכתמים ג'לים לא ניתן להשתמש בהם מאז הם אינם תואמים ניתוח MS.
   1. לאחר הפעלת ג'ל 1D-PAGE, לתקן את הג'ל פתרון קיבעון (50% ( V / V ) מתנול ו 10% ( V / V ) חומצה אצטית) עבור 1 ח '. כתם הג'ל בפתרון הכתם (0.1% ( w / v ) Coomassie מבריק R-250, 50% ( v / v ) מתנול, ו 10% ( v / v ) חומצה אצטית) במשך 20 דקות עם רעד עדין. להשמיד את הג'ל ב תמיסת destain (40% ( v / v ) מתנול ו 10% ( v/ V) חומצה אצטית) עבור 1 h. לאחר destaining, לשמור את הג'ל ב 5% ( v / v ) חומצה אצטית.
      הערה: במהלך destaining, פתרון destain חדש ניתן להחליף עד הרקע לחלוטין destained.
   2. חותכים את הלהקות של עניין מתוך הג'ל. חותכים את להקות נוספת לחתיכות של כ 1 מ"מ ³ עבור עיכול טריפסין אופטימלי מיצוי של פפטידים. הידר את חתיכות ג'ל עם 50 μL של 100 mM אמוניום ביקרבונט (NH ₄ HCO ₃ ) במשך 10 דקות. מכסים את חתיכות ג'ל לחלוטין.
      1. הסר את הפתרון לחות בזהירות להתייבש חתיכות ג'ל עם acetonitrile (CH ₃ CN) במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את הפתרון אצטוניטריל.
      2. חזור על התהליך מ הידרציה כדי התייבשות פעמיים. לבסוף, להסיר את הפתרון אצטוניטריל.
         הערה: זמן ריצה ג'ל תלוי במטרה של הניסוי. ריצה ארוכה פעמים מאפשר הפרדה טובה של חלבונים, ולכן האיסור ג 'ל מוכתמים ספציפייםDs ניתן לחתוך לניתוח נוסף. אם המטרה היא לשמור על חלבונים ולהסיר מזהמים, זמן ריצה קצר מספיק.
   3. הוסף 500 μL של 6.6 מ"מ פתרון DTT ו דגירה חתיכות ג'ל במשך 10 דקות. הסר את הפתרון DTT ולשטוף את חתיכות ג'ל פעמיים עם 500 μL של 95% ( V / V ) פתרון אצטוניטריל.
      1. לאחר הכביסה, להסיר את הפתרון acetonitrile ו דגירה חתיכות ג'ל עם 500 μL של 55 מ"מ חומצה iodoacetic (IAA) פתרון במשך 10 דקות בחושך.
      2. לאחר הדגירה, להסיר את הפתרון לשטוף את חתיכות ג'ל שוב עם 500 μL של 95% ( V / V ) פתרון אצטוניטריל. יבש את חתיכות ג'ל.
   4. הטמע את חתיכות ג'ל לחלוטין עם 25 μL של חיץ העיכול (50 מ"מ NH ₄ HCO ₃ , 5 מ"מ CaCl ₂ , ו 6 ng / μL טריפסין) ולשמור על קרח 45 דקות לתת טריפסין לחדור לתוך הג 'ל. דגירה חתיכות ג'ל לילה ב 37 מעלות צלזיוס עבור en עיכול zymatic.
2. טיהור פפטיד
   1. הוסף 80 μL של 50 מ"מ NH ₄ HCO ₃ לחתיכות ג'ל במאגר העיכול ואת מערבולת שוב ושוב כדי לחלץ את הפפטידים tryptic. אסוף את התמצית. חזור על צעד החילוץ הזה פעמיים עם 80 μL של 50% ( V / V ) CH ₃ CN ו 5% ( V / V ) חומצה פורמית (FA).
      הערה: התמצית הסופי הסופי צריך להיות כ 240 μL.
   2. בריכה לרכז את תמציות לתוך μL כ 10 על ידי ריכוז ואקום או lyophilization ולהוסיף 25 μL של 0.1% ( V / V ) חומצה trifluoroacetic מימית (TFA) פתרון. Desalt דגימות עם μ-C18 עמודות, בעקבות פרוטוקול של היצרן.
   3. Elute הפפטידים עם μL 4-10 של 60% ( w / v ) CH ₃ CN ו 0.1% ( v / v ) FA. Lyophilize (להקפיא יבש) הפפטידים ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס עד הניתוח.

כותרת "> 10. ננו LC-MS

1. ננו בשלב ההפוך כרומטוגרפיה נוזלית
   הערה: בצע את ניתוח LC-MS עם ספקטרומטר מסה כי הוא מחובר יחד עם מכשיר כרומטוגרפיה נוזלית. מכשיר זה צריך להיות מצויד עם טור C18 (2 מיקרומטר חלקיק, 100 גודל הנקבוביות Å, ו 50 מיקרומטר x 15 ס"מ בממד).
   1. Resuspend הפפטידים lyophilized ב 16 μL של פתרון (2% ( v / v ) CH ₃ CN ו 0.1% ( v / v ) FA). להזריק לטעון 5 μL של פתרון פפטיד בקצב זרימה של 5 μL / min על C18 precolumn (גודל מיקרומטר 3 מיקרומטר, 100 גודל הנקבוביות Å, nanoviper, ו 75 מיקרומטר x 2 ס"מ בממד).
   2. 10.1.2. הפרד את הפפטידים באמצעות שיפוע 95 דקות עם קצב הזרימה של 300 nL / min. במהלך שיפוע זה ההפרדה, להגדיל את השלב הנייד B מ 4% ל 10%, 10% עד 25%, ו 25% ל 45% 5 דקות, 50 דקות ו 18 דקות, בהתאמה. לבסוף, עלייה תלולה בשלב B נייד עד 95% ב 1 דקות. לאחרכל שיפוע 95 דקות ההפרדה, להחיל שלב שטיפה הטמון המכיל שיפוע 10 דקות מ 4% ל 95% ב 5 דקות.
      הערה: השלב הנייד A הוא 99.9% H ₂ O ו- 0.1% ( v / v ) FA, והשלב הנייד B הוא 19.92% H ₂ O, 80% ( w / v ) CH ₃ CN ו- 0.08% ( v / v ) FA.
2. המסה ספקטרומטריית המסה
   1. הפעל את ספקטרומטר מסה במצב נתונים תלויי עם טווח המוני בין 400 ל 1,600 מ '/ z.
   2. בחר עד עשרה של יונים אינטנסיבי ביותר MS1 כדי ליצור את ספקטרום פיצול. קבע את הרזולוציה ל -70,000 רוחב מלא בחצי מרבי (FWHM) עבור MS1 ו -17,000 עבור MS2, עם יעד בקרה אוטומטי (AGC) של 3,000,000 ו -1,000,000 יונים וזמן הזרקת יון מרבי (IT) של 256 ו- 64 ms עבור MS1 ו - MS2, בהתאמה.
   3. הגדר את ההדרה הדינמית ל 10 שניות כדי למנוע פיצול חוזר של יונים שופע ביותר.
      הערה: כאן, יונים עם אחד או יותר שישה חיובים הם הXcluded עבור MS2.
3. פרוטאומיקה איכותית: זיהוי פפטיד וחלבון
   1. ניתוח ספקטרום פיצול באמצעות תוכנה כגון פסגות סטודיו תוכנה ^{47 , 48 , 49} .
      הערה: חבילות תוכנה אחרות זמינים גם עבור זיהוי פפטיד, כגון NovoHMM ³⁰ ו PepNovo ³⁷ עבור רצף novo ו SEQUEST ⁵⁴ ו Mascot ⁵⁵ לחיפוש באתר.
   2. שלב את הספקטרה עם אותה מסה (הפרש של <2 ppm) וזמני שימור (<2 דק ') ושמור רק על ספקטרום עם סף איכות גבוה מ -0.65 כדי לחפש את מסד הנתונים Swiss-Prot (גרסה: דצמבר 2013) עבור הטקסונומיה שנקבעה לדגם thaliana ארבידופסיס צמח. השתמש בפרמטרים הבאים של החיפוש: מבשר סובלנות המונית של 10 עמודים לדקה באמצעות השימוש של monהמסה oisotopic; סף המסה של קטע של 20 mmu; טריפסין כמו אנזים העיכול, עם מקסימום של 2 cleavages החמיצו; ציסטאין carbamidomethylation כמו שינוי קבוע; Methionine חמצון כמו שינוי משתנה; ו מקסימום של 3 שינויים לאחר טרנספורמציה משתנה לכל פפטיד. לאחר הזיהוי, להגדיר באופן ידני את סף ניקוד עבור זיהוי פפטיד אמין חלבון, כך שיעור גילוי מזויף (FDR) <5% נרכש.
4. פרוטאומיקס כמותי: ניתוח סטטיסטי של נתונים ספקטרומטריית מסה
   1. השתמש LC-MS ( למשל Progenesis) עבור quantitation ללא תווית של נתונים proteomics.
      הערה: אזורי הפפטיד של MS1 (או העוצמה) מקושרים לפפטידים שזוהו על-ידי תוכנת האולפן לפי המסה שלהם, עם השגיאה הסבירה בכל היותר של 10 עמודים לדקה.
      הערה: תוכנה זו מחשבת את השפע של פפטיד על ידי שילוב אזורי השיא של כל מדינות החיוב בין 2 ^{+ ו + 8. הנתונים הכמותיים מקושרים לזיהוי הפפטידים של PEAKS על ידי התסריט inhouse (התאמת המסה עם השגיאה הסבירה ב -10 ppm).}
   2. חישוב ממוצע log2 קיפול שינויים (CL / לא CL) עבור כל פפטיד. קבוצת לקפל שינויים של פפטידים ייחודיים על ידי חלבון.
      הערה: בכל קבוצה, שינוי הקפל הסופי של חלבון שווה לשינויים הממוצעים בקפל של הפפטידים.
   3. חישוב p- ערך באמצעות t- test של הסטודנט עבור כל קבוצה כדי להעריך את המשמעות סטטיסטית. החלת R חבילת תוכנה (גרסה 3.3.0) לתקן את ערכי p עבור ה- FDR של כל הקבוצות באמצעות שיטת Benjaminamini-Hochberg (BH).
   4. צייר את חלקה הר געש באמצעות חבילת "כיול" פונקציה (גרסה 1.7.2) תואם את חבילת התוכנה R (גרסה 3.3.0).
      הערה: כאן, ערכי ה- p-10 המותאמים ל- loglog (-log10 (adj-p-value) הם פונקציה של שינויי log2-fold של כל החלבונים שזוהו. חלבונים הםמטופלים כניסות חיוביות בפרוטאומה של ה- mRNA, אם השינויים שלהם בקפל 2 גדולים מ -2, עם או בלי משמעות.

11. קטלוג של Proteome מזוהה mRNA מזוהה

1. סיווג את החלבונים מזוהה משלב 10 לשלוש קטגוריות על בסיס פריטים של "פונקציות מולקולריות ותהליכים ביולוגיים" באמצעות מאגר אונטולוגיה (GO) נתונים ו "משפחה ודומיין" באמצעות מסד הנתונים InterPro.
2. כקטגוריה I, או "חלבונים ריבוזומליים", מכילים את כל החלבונים הריבוזומליים המזוהים, מגדירים חלבונים מקטגוריה II, או "RBPs ראשיים", כמכילים תחליפי חלבון מעובדים המפעילים אינטראקציה עם RNA או קישור למחבר RNA עם תפקודים ידועים או לא ידועים בביולוגיה של RNA .
3. כאשר חלבונים עם תפקודים ידועים או לא ידועים בביולוגיה של RNA ללא תחומים מחברים של RNA מחייב ממוקמים בקטגוריה III, או "RBPs מועמדים", מגדירים אנזימים מקטגוריה III המבוססת על הערות מ Iמסד נתונים ntEnz.

תוצאות

ראינו הילה אופיינית, המקיפה את גלולה חרוז במדגם CL, לשטוף שלב 4.3 עם חיץ לשטוף 2 ( איור 1 ב ). למרות שזה לא נחקר, התופעה הזאת כנראה ניתן להסביר על ידי הפרעה של מתחמי mRNP crosslinked עם צבירה חרוז במהלך לכידת מגנטי, גרימת צבירה מפוזר יותר להיווצר. זה מציין כי אוליגו d (T) ₂₅ חרוז ללכוד היה יעיל ¹⁴ .

דיון

אנו בהצלחה להחיל mRNA אינטראקציה ללכוד, שפותח עבור שמרים ותאי אדם, לשתול protoplasts mesophyll עלה. תאים עלה mesophyll הם הסוג העיקרי של רקמת הקרקע עלים צמח. היתרון העיקרי של שיטה זו היא כי היא משתמשת vivo crosslinking לגלות את החלבונים מסביבה פיזיולוגית.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים בעיקר מספר תנאים ניסיוניים אופטימיזציה ( למשל, מספר protoplasts להשתמש כחומר המוצא ומשך קרינה UV) ^5...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים
0.8 M מניטול	סיגמא	M1902-500G	תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית & תמיסת MMg
2 M KCl	MERCK	Art. 4935	תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית & W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7) (4-morpholineethanesulfonic acid)	Sigma-aldrich	M2933	תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית, W5 buffer & MMg תמיסה, עיקור סינון
צלולאז R10	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	צלולאז " אונוזוקה" R-10, 10 גרם	תמיסת אנזים איזוטונית סופית
Macerozyme R10	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	MACEROZYME R-10, 10 גרם	תמיסת אנזים איזוטונית סופית
10% (w/v) BSA (אלבומין סרום בקר)	Sigma-aldrich	A7906-100G	תמיסת אנזים איזוטונית סופית & עיקור סינון
1 M CaCl2	Chem-Lab NV	CL00.0317.1000	תמיסת אנזים איזוטונית סופית, W5 buffer & מאגר עיכול
1 M NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60	W5 buffer
2 M MgCl2	Sigma	M8266-100G	תמיסת MMg
1 M LiCl (ליתיום כלוריד)	Acros	199885000	מאגר ליזה/מחייב, מאגר כביסה 1, מאגר כביסה 2 & מאגר מלח נמוך
5% (w/v) LiDS (ליתיום דודציל סולפט)	Sigma-aldrich	L4632-25G	מאגר ליזה/מחייב, מאגר כביסה 1 & עיקור סינון
1 M DTT (Dithiothreitol)	Thermo Fisher Scientific מאגר כביסה 1 & מאגר כביסה 2	307866	מאגר ליזה/קשירה,
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, חומצה הידרוכלורית S.G. (HCl)))	אקרוס & פישר כימיקלים	167620010 & H/1200/PB15	מאגר ליזה/כריכה, מאגר כביסה 1, מאגר כביסה 2, מאגר מלח נמוך & מאגר אלוטיון
0.5 מ' EDTA (pH 8.0) (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)	מאגר		ליזה/מחייב מאגר כביסה 1, מאגר כביסה 2, מאגר מלח נמוך & מאגר אלוטיון
Tween 20	MERCK	8.22184.0500	התחדשות של oligo-d(T)25 חרוזים
0.1 M NaOH	VWR PROLABO CHEMICALS	28244.295	התחדשות חרוזי oligo-d(T)25
1x PBS (pH 7.4) (מי מלח חוצץ פוספט) המכילים (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)	Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC	S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230	התחדשות של חרוזי oligo-d(T)25
תמיסת Proteinase K (2 μ g/μ L)	Thermo Fisher Scientific	11789020	עיכול חלבון
טעינת צבע	Invitrogen	LC5925	SDS-PAGE
qPCR מאסטר מיקס	Promega	A6001	qRT-PCR מבחן
RNase קוקטייל	תרמו פישר סיינטיפיק	AM2286	RNA עיכול
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	322415	קיבוע ג'ל ומניעת ג'ל
חומצה אצטית	Sigma-aldrich	537020	קיבוע ג'ל ומניעת ג'ל
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Fisher Scientific	20278	צביעת ג'ל
1 M NH4HCO3 (אמוניום ביקרבונט)	Sigma-aldrich	09830-500G	ג'ל לחות & בופר עיכול
CH3CN (אצטוניטריל)	Sigma-aldrich	34851-100ML	ג'ל התייבשות & תמיסת פפטיד
IAA (חומצה יודואצטית)	סיגמא-אולדריך	I4386-10G	חומר אלקילציה
TFA (חומצה טריפלואורואצטית)	Sigma-aldrich	302031-10X1ML	תמיסת פפטיד
FA (חומצה פורמית)	Sigma-aldrich	06554-5G	מיצוי פפטיד
תמיסת טריפסין (6 ng/μ L)	Promega	V5280	מאגר עיכול
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>תגובות
<חזק>ציוד
אדמה	פלטרקום	LP2D	גידול צמחים
ורמיקוליט 3	סיבלי AS	05VERMICULIET	פטרי לצמיחת צמחים
(150 x 20 מ"מ)	Sarstedt	82.1184.500	מנשא לתרחיף פרוטופלסט
0.22 μ m filter	Millipore	SE2M229104	הומוגניזציה של תמיסת אנזים איזוטונית סופית
Razorblade	Agar Scientific	T585	רצועות עלי רוזטה
35-75 μ m רשת ניילון	SEFAR NITEX	74010	סינון מתלה פרוטופלסט
50 מ"ל צינורות תחתונים עגולים	Sigma-aldrich	T1918-10EA	מנשא למתלה פרוטופלסט
Hemocytometer (Bü	MARIENFELD	650030	מנגנון הצלבת UV לספירת תאים פרוטופלסט
(HL-2000 HybriLinker)	UVP, LLC	UVP95003101	in vivo מנורת UV צולבת
UV (Sankyo-Denki G8T5)	SANKYO DENKI	SD G8T5	in vivo מזרק זכוכית צולב UV
50 מ"ל	FORTUNA Optima	Z314560	הומוגניזציה של ליזאט פרוטופלסט
מחט צרה (0.9 x 25 מ"מ)	מיקרולנס בקטון דיקינסון 3	2021-04	הומוגניזציה של מסובב ליזאט פרוטופלסט
דגם L26	Labinco BV	26110912	דגירה של דגימה על ידי סיבוב
Oligo-d(T)25 חרוזים מגנטיים (5 מ"ג/מ"ל)	New England BioLabs	S1419S	mRNPs ו-mRNAs קשירה ו
מתלה מגנטי	Invitrogen	CS15000	mRNPs ו-mRNAs יחידות
סינון צנטריפוגליות מחייבות ונשלפות (יחידות סינון צנטריפוגליות Amicon Ultra-4)	EMD Millipore	UFC800308	ריכוז mRBP
ערכת כתמי כסף	Thermo Fisher Scientific	24612	לבדיקת מכתים בכסף
(InviTrap Spin Plant RNA מיני קיט)	STRATEC מולקולרי		1064100300 RNA טיהור
מכשיר ספקטרופוטומטר (NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר)	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	RNA איכות וכמות
אמת PCR מחזור (StepOne בזמן אמת PCR מחזור)	Thermo Fisher Scientific	4376600	cDNA כימות
ומיקרו;-C18 עמודות (Millipore Zip Tip µ-C18 עמודות)	Sigma-aldrich	720046-960EA	טיהור פפטידים
ספקטרומטר מסה (Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	כרומטוגרפיה נוזלית מבוססת ספקטרומטריית מסה
(מכשיר כרומטוגרפיה נוזלית אולטימטיבי 3000 בעל ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC)	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO	פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה
C18 column (עמודה קלה של ריסוס Pepmap RSLC C18)	Thermo Fisher Scientific	ES800	פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה
C18 precolumn (שבחים Pepmap 100 C18 precolumn)Thermo	Fisher Scientific	160321	פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה
שם	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay	Sequences
UBQ10 mRNA (Li et al., 2014)	Fw: AACTTTGGTGGTGTGTGTTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA (Durut et al., 2014)	Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA