מאמר שיטה

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

DOI:

10.3791/56011

⸱

28 ביולי 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, KU Leuven

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA מחייב חלבונים (RBPs) לקבוע את גורלם של RNAs. הם משתתפים בכל המסלולים ביוגנזה רנ"א ובמיוחד לתרום שלאחר תקנת גנים תקנה (PTGR) של RNAs השליח (mRNAs). בשנים האחרונות, מספר mRNA-proteomes כבול מן השמרים שורות תאים יונקים היו מבודדים בהצלחה באמצעות שיטה חדשנית בשם "mRNA אינטראקציה ללכוד", המאפשר זיהוי של mRNA מחייב חלבונים (mRBPs) ישירות מתוך סביבה פיזיולוגית. השיטה מורכבת מ - vivo אולטרה סגול (UV) crosslinking, משוך מטה וטיהור של מסנג 'ר ribonucleoprotein קומפלקסים (mRNPs) על ידי חרוזים אוליגו (DT), ואת זיהוי שלאחר מכן של חלבונים crosslinked על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). לאחרונה, על ידי יישום שיטה זהה, כמה צמחים mRNA כבול חלבונים דווחו בו זמנית ממקורות רקמה שונים ארבידופסיס : שתילים etiolated, רקמת עלה,עלה prooplasts mesophyll, ותאי שורש תרבותי. כאן, אנו מציגים את אופטימיזציה mRNA אינטראקציה ללכוד שיטת ארבידופסיס thaliana protoplasts mesophyll עלה, סוג התא המשמש כלי רב תכליתי עבור ניסויים הכוללים מבחני הסלולר השונים. התנאים התשואה חלבון אופטימלי כוללים את כמות הרקמות החל ואת משך קרינה UV. ב- mRNA-proteome שהתקבל בניסוי בקנה מידה בינוני (10 7 תאים), RBPs ציינו כי קיבולת ה- RNA מחייב נמצאו לייצג יתר על המידה, ורבים RBPs מזוהים זוהו. הניסוי יכול להיות scaled up (10 9 תאים), ואת השיטה אופטימיזציה ניתן להחיל על סוגי תאים צמחיים אחרים מינים כדי לבודד באופן רחב, קטלוג, ולהשוות proteomes mRNA- קשורה בצמחים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryotes להשתמש RNA מספר ביוגנזה מסלולים רגולטוריים כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים תאיים. בין סוגים ידועים של רנ"א, mRNA הוא מגוון מאוד ונושא קיבולת קידוד של חלבונים ואת האיזופורמים שלהם 1. מסלול PTGR מכוון את גורלם של pre-mRNAs 2 , 3 . RBPs ממשפחות גנים שונים לשלוט על הרגולציה של RNA, ב PTGR, mRNAs ספציפיים mRNAs מדריך דרך אינטראקציות פיזיות ישירות, יצירת mRNPs תפקודית. לכן, זיהוי ואפיון mRBPs ו mRNPs שלהם הוא קריטי להבנת הרגולציה של חילוף החומרים mRNA נייד 2. מעל שלושת העשורים האחרונים, שונים בשיטות חוץ גופית ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ארבידופסיס עלה Mesophyll Protoplast בידוד

הערה: ארבידופסיס prooplasts mesophyll עלה מבודדים למעשה כפי שתואר על ידי Yoo et al ., 2007, עם מספר שינויים 40 .

  1. גידול של צמחים
    1. משרים כ 200 ארבידופסיס thaliana Col-0 זרעים ecotype במים מעוקרים במשך 2 ימים ב 4 ° C בחושך לריבוד.
      הערה: מספר זה של זרעים הוא מספ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראינו הילה אופיינית, המקיפה את גלולה חרוז במדגם CL, לשטוף שלב 4.3 עם חיץ לשטוף 2 ( איור 1 ב ). למרות שזה לא נחקר, התופעה הזאת כנראה ניתן להסביר על ידי הפרעה של מתחמי mRNP crosslinked עם צבירה חרוז במהלך לכידת מגנטי, גרימת צבירה מפוזר יותר להיווצר. זה מציין כי אוליגו d (T) 25 חרוז ללכוד היה יעיל 14 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו בהצלחה להחיל mRNA אינטראקציה ללכוד, שפותח עבור שמרים ותאי אדם, לשתול protoplasts mesophyll עלה. תאים עלה mesophyll הם הסוג העיקרי של רקמת הקרקע עלים צמח. היתרון העיקרי של שיטה זו היא כי היא משתמשת vivo crosslinking לגלות את החלבונים מסביבה פיזיולוגית.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים בעיקר מספר תנאים ניסיוניים אופטימיזציה ( למשל, מספר protoplasts להשתמש כחומר המוצא ומשך קרינה UV) 5.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים במעבדה של פרופ 'יוריס וינדריקס, שסיפק את המנגנון crosslinking UV מצויד מנורת UV קונבנציונאלי. KG נתמך על ידי קרן מחקר KU Leuven ומכיר תמיכה של FWO להעניק G065713N.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
0.8 M מניטולסיגמאM1902-500Gתמיסת אנזים איזוטונית ראשונית & תמיסת
MMg
2 M KClMERCKArt. 4935תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)		Sigma-aldrichM2933תמיסת אנזים איזוטונית ראשונית,
W5 buffer &
MMg תמיסה,
עיקור סינון
צלולאז R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.צלולאז
" אונוזוקה"
R-10, 10 גרם		תמיסת אנזים איזוטונית סופית
Macerozyme R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.MACEROZYME R-10, 10 גרםתמיסת אנזים איזוטונית סופית
10% (w/v) BSA
(אלבומין סרום בקר)		Sigma-aldrichA7906-100Gתמיסת אנזים איזוטונית סופית &
עיקור סינון
1 M CaCl2Chem-Lab NVCL00.0317.1000תמיסת אנזים איזוטונית סופית,
W5 buffer &
מאגר עיכול
1 M NaClFisher ChemicalS/3160/60W5 buffer
2 M MgCl2SigmaM8266-100Gתמיסת MMg
1 M LiCl
(ליתיום כלוריד)		Acros199885000מאגר ליזה/מחייב,
מאגר כביסה 1,
מאגר כביסה 2 &
מאגר מלח נמוך
5% (w/v) LiDS
(ליתיום דודציל סולפט)		Sigma-aldrichL4632-25Gמאגר ליזה/מחייב,
מאגר כביסה 1 &
עיקור סינון
1 M DTT
(Dithiothreitol)		Thermo Fisher Scientific
מאגר כביסה 1 &
מאגר כביסה 2		307866מאגר ליזה/קשירה,
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, חומצה הידרוכלורית S.G. (HCl)))אקרוס &
פישר כימיקלים		167620010 &
H/1200/PB15		מאגר ליזה/כריכה,
מאגר כביסה 1,
מאגר כביסה 2,
מאגר מלח נמוך &
מאגר אלוטיון
0.5 מ' EDTA (pH 8.0) (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)מאגרליזה/מחייב
מאגר כביסה 1,
מאגר כביסה 2,
מאגר מלח נמוך &
מאגר אלוטיון
Tween 20MERCK8.22184.0500התחדשות של oligo-d(T)25 חרוזים
0.1 M NaOHVWR PROLABO CHEMICALS28244.295התחדשות חרוזי oligo-d(T)25
1x PBS (pH 7.4)
(מי מלח חוצץ פוספט)
המכילים
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		התחדשות של חרוזי oligo-d(T)25
תמיסת Proteinase K (2 μ g/μ L)Thermo Fisher Scientific11789020עיכול חלבון
טעינת צבעInvitrogenLC5925SDS-PAGE
qPCR מאסטר מיקסPromegaA6001qRT-PCR מבחן
RNase קוקטיילתרמו פישר סיינטיפיקAM2286RNA עיכול
מתנולסיגמא-אולדריץ'322415קיבוע ג'ל ומניעת ג'ל
חומצה אצטיתSigma-aldrich537020קיבוע ג'ל ומניעת ג'ל
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Fisher Scientific20278צביעת ג'ל
1 M NH4HCO3
(אמוניום ביקרבונט)
 		Sigma-aldrich09830-500Gג'ל לחות &
בופר עיכול
CH3CN
(אצטוניטריל)		Sigma-aldrich34851-100MLג'ל התייבשות &
תמיסת פפטיד
IAA
(חומצה יודואצטית)		סיגמא-אולדריךI4386-10Gחומר אלקילציה
TFA
(חומצה טריפלואורואצטית)		Sigma-aldrich302031-10X1MLתמיסת פפטיד
FA
(חומצה פורמית)		Sigma-aldrich06554-5Gמיצוי פפטיד
תמיסת טריפסין (6 ng/μ L)PromegaV5280מאגר עיכול
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
<חזק>ציוד
אדמהפלטרקוםLP2Dגידול צמחים
ורמיקוליט 3סיבלי AS05VERMICULIETפטרי לצמיחת צמחים
(150 x 20 מ"מ)Sarstedt82.1184.500מנשא לתרחיף פרוטופלסט
0.22 μ m filterMilliporeSE2M229104הומוגניזציה של תמיסת אנזים איזוטונית סופית
RazorbladeAgar ScientificT585רצועות עלי רוזטה
35-75 μ m רשת ניילוןSEFAR NITEX74010סינון מתלה פרוטופלסט
50 מ"ל צינורות תחתונים עגוליםSigma-aldrichT1918-10EAמנשא למתלה פרוטופלסט
Hemocytometer
(Bü 		MARIENFELD650030מנגנון הצלבת UV לספירת תאים פרוטופלסט

(HL-2000 HybriLinker)		UVP, LLCUVP95003101in vivo מנורת UV צולבת
UV
(Sankyo-Denki G8T5)		SANKYO
DENKI		SD G8T5in vivo מזרק זכוכית צולב UV
50 מ"לFORTUNA OptimaZ314560הומוגניזציה של ליזאט פרוטופלסט
מחט צרה (0.9 x 25 מ"מ)מיקרולנס בקטון דיקינסון 32021-04הומוגניזציה של מסובב ליזאט פרוטופלסט
דגם L26Labinco BV26110912דגירה של דגימה על ידי סיבוב
Oligo-d(T)25 חרוזים מגנטיים
(5 מ"ג/מ"ל)		New England BioLabsS1419SmRNPs ו-mRNAs קשירה ו
מתלה מגנטיInvitrogenCS15000mRNPs ו-mRNAs יחידות
סינון צנטריפוגליות מחייבות ונשלפות
(יחידות סינון צנטריפוגליות Amicon Ultra-4)		EMD MilliporeUFC800308ריכוז mRBP
ערכת כתמי כסףThermo Fisher Scientific24612לבדיקת מכתים בכסף

(InviTrap Spin Plant RNA מיני קיט)		STRATEC מולקולרי1064100300 RNA טיהור
מכשיר ספקטרופוטומטר (NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר)Thermo Fisher ScientificND-1000RNA איכות וכמות
אמת PCR מחזור
(StepOne בזמן אמת PCR מחזור)		Thermo Fisher Scientific4376600cDNA כימות
ומיקרו;-C18 עמודות
(Millipore Zip Tip µ-C18 עמודות)		Sigma-aldrich720046-960EAטיהור פפטידים
ספקטרומטר מסה
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)		Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRכרומטוגרפיה נוזלית מבוססת ספקטרומטריית מסה
(מכשיר כרומטוגרפיה נוזלית אולטימטיבי 3000 בעל ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC)Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANOפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה
C18 column
(עמודה קלה של ריסוס Pepmap RSLC C18)		Thermo Fisher ScientificES800פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה
C18 precolumn
(שבחים Pepmap 100 C18 precolumn)Thermo		Fisher Scientific160321פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה
שם CompanyCatalog NumberComments
Primers for qRT-PCR assaySequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		Fw: AACTTTGGTGGTGTGTGTTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
צלחת נפתח ערכת טיהור RNA בזמן מכשיר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

UVOligo dTRNAArabidopsis thaliana

מאמרים קשורים