הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56023

⸱

30 במרץ 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva, 2Hematology Service, University Hospital, Geneva

במאמר זה

סיכום

לימפומה cell מנטל (MCL) היא קשה לטפל הפרעת תא B ולכן לא פחות קשה להקים מודל העכבר xenograft של ראשי MCL ללמוד ולפתח את הרפוי. כאן, אנו מתארים את הקמת MCL xenografts בעכברים כדי לעזור להבין את הביולוגיה כבסיס מוצלחת.

תקציר

B לימפוציטים הם שחקני המפתח מחזור תא החיסון והם בעיקר ביתם, שוכנים באזור איברי הלימפה. בעוד תאי B נורמלי להתרבות רק כשאתה מגורה על ידי לימפוציטים מסוג T, תאי B oncogenic לשרוד ו להרחיב באופן עצמאי בתוך נישות איברים לא מוגדר. לימפומה cell מנטל (MCL) הוא אחד כזה הפרעת תא B, שבו שיעור חציון ההישרדות של חולים היא 4-5 שנים. זה דורש את הצורך של מנגנונים יעילים באמצעותו יונת ואת engraftment של תאים אלה נחסמות על מנת להגביר את הישרדות, תוחלת החיים של המטופלים. לכן, המאמץ לפתח מודל העכבר xenograft לחקור את היעילות של הרפוי MCL על ידי חסימת ה ביות מנגנון ויוו הוא בעל חשיבות עליונה. התפתחות בעלי חיים הנמענים התא האנושי השתלת איברים מבעלי חיים לבדוק תרופות בשלב מוקדם של זמן כנראה תפס, כמו דגמים הרלוונטיים העכבר פרה יש חשיבות מכרעת מסך סוכני טיפולית חדשה. מודל זה בעל חיים מפותחת כדי למנוע דחיית שתל האנושי ולהקים מודל עבור מחלות אנושיות, והוא עשוי להיות כלי שימושי ביותר ללמוד את התקדמות המחלה סוגי לימפומה שונים, לבצע בדיקה פרה של תרופות עבור ממאירויות המטולוגיות, כמו MCL. הקמנו דגם העכבר xenograft אשר ישמש משאב מצוין ללמוד ולפתח את רומן גישות טיפוליות עבור MCL.

מבוא

לימפוציטים על ידי הטבע לשחק תפקיד מרכזי מעקב המערכת החיסונית, לימפוציט סחר היא שלב קריטי הרכבה אנטיגן ספציפי חסינות1,2. תהליך זה כולל העברה של לימפוציטים נאיביים T של בלוטת התימוס כדי להזרים את הדם, ומשם לאיברים הלימפה המשני, כולל בלוטות הלימפה, התיקונים של פייה או הטחול, הם נפגשים אנטיגנים cognate. לימפוציטים B להבדיל במח העצם, נודדים כתאי תמים אל זקיקים של איברי הלימפה משני3. חלק תאים B אלה לאגד אנטיגן עם קולטן שלהם, מופעלים על ידי תאי T ספציפי. התפשטות ובידול של תאים אלה B דוחף את התאים תמים B שאינו מופעל ע י לאזור מנטל של הזקיק. תאים מופעל יכול להבדיל ואז לזיכרון B תאים, אשר מסיירים הגוף, או לידי בנוגדנים הפרשת תאי פלזמה להגר מח העצם4.

MCL מתרחשת כאשר לימפוציטים נאיביים B באזור מנטל להפוך גידול. אלו תאים לימפומה לשכון microenvironment של איברים הלימפה, להתרבות ללא תלות שליטה לימפוציט T ספציפי. עם זאת, בשלב מסוים של צפיפות לברוח מן הנישה הזאת והם recirculate במחזור הדם לחפש נישות באיברים אחרים. בהתחשב במורכבות של מולקולות אדהזיה והפקרות של נוגדנים, קולטנים שלהם, המנגנון של הסלולר סחר זה ויוו ממעטים להבין, לכן הסלים טיפול. שיטות רומן נחוצים כדי לחסום ביעילות תהליך הגירה זה כדי למנוע את התאים לימפומה B מלהגיע microenvironments חדש.

MCL הוא אחד הקשים ביותר לטיפול תא B ממאירות. הפיתוח של הפנוטיפ אמצעים של MCL היא התוצאה של מפל רב-שלבי, המאופיינת על ידי רכישת מאפיינים ביולוגיים ייחודיים. בזמן האבחנה, רוב המטופלים (70%) שכבר קיים עם מחלה המופץ, עם רוב המקרים מפגין extranodal מעורבות הטחול, מוח עצם, ו/או מערכת העיכול5,6. בחולים שטופלו, נסיגה על ידי גידולים עמידים בתוך כמה שנים הוא נפוץ, למרות כימותרפיה קונבנציונלית מעניקה שיעורי הפוגה גבוהה לטווח קצר7,8. כאן אנו מציגים מודל המחלה חדש יכול לעזור להבין MCL הפצתו וביולוגיה הבסיסית שלה: הקמנו האנושי MCL xenograft העכבר מודל שמקורם בתאי הגידול העיקרי של חולים. אנו מקווים כי מודל זה יעזור לפתח אסטרטגיות טיפוליות נגד הפצת MCL, לספק במרכיבי קליניים אופטימלית אבחון וטיפול בחולים הישנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות דם אנושי שימשו על פי הנהלים אושרה על ידי האתיקה המקומית ניסויים ועדות של בית החולים של אוניברסיטת ז'נבה.

ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המוסדיים אתית הוועדה של חיה טיפול ב ז'נבה ומשרד וטרינרי הקנטונים (מספר אישור: ג ' נרל אלקטריק/26/15).

1. הכנת תאי תאי דם היקפיים הראשי (PBMCs) על-ידי הפרדת צבע צפיפות

הערה: 3-5 מ של דם היקפיים הושג מחולים עם MCL הצגת בשלב לוקמיה. האבחנה הייתה נקבע על פי קריטריונים אבחון סטנדרטי עבור cytometry זרימה (CD5 +, CD23−, CD200 +, האוכלוסייה monoclonal B cell), לאחר מכן אושר על ידי נוכחות של t(11;14) טרנסלוקציה כרומוזומלית, ביטוי של cyclin D1. בכל המקרים, היוו monoclonal תאי B כדי > 90% מן האוכלוסייה הכוללת B cell. התאים הנותרים היו בעיקר ומונוציטים ו כמה תאים T.

  1. לדלל (1:1) 5 מ של דגימת דם MCL עם 5 מ של רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני 1640 (RPMI) (איור 1 א').
  2. היפוך התקשורת הדרגתיות צפיפות (טבלה של חומרים) מספר פעמים לפני השימוש כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  3. הוסף 5 מ של מדיה הדרגתיות צפיפות לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל באמצעות של העצמות פיפטה.
  4. שכבת בעדינות את דגימת הדם מדולל על התקשורת הדרגתיות צפיפות בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל באמצעות של העצמות (הדם צפיפות מדיה הדרגתיות יחס צריך להיות 2:1, למשל, 10 מ של דם עד 5 מ"ל של צפיפות הדרגתיות מדיה). צריך לקחת כדי לא לערבב שתי השכבות (איור 1B, ג).
  5. Centrifuge הדגימה ב 400 g x 40 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלמים צנטריפוגה כבוי.
  6. בעדינות בעזרת פיפטה סטרילי של פסטר, תשאף השכבה האמצעית (לבנבן, דק טבעת המסומן בחץ (איור 1D, E)) המכילות את התאים תאי ולהעביר אותם לתוך צינור נקי.
  7. כביסה של תאי תאי
    1. להעריך את עוצמת הקול של התליה תא שהועברו ולהוסיף אליו שלושה כרכים של עקר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 1% אלבומין שור (BSA).
    2. מערבבים את המתלים על-ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים.
    3. Centrifuge את המתלים ב 400-500 g x למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. למחוק את תגובת שיקוע להשיג בגדר תא, חזור על השלב לשטוף שוב.
    5. הסר את תגובת שיקוע, resuspend תאי האחסון הרצוי, למשל, 1 או 2 מ"ל ל- PBS.
    6. לספור את מספר התאים מונה הניתן תא אוטומטית או ידנית באמצעות של hemocytometer (נויבאואר קאמרית).

2. העשרה של תאים B לפי בחירה שלילי תא B

  1. לדלל את התאים ב- PBS כדי ריכוז סופי של 50 x 106 תאים/מ ל....
  2. העבר את התאים מ ל סביב צינור פוליסטירן התחתון. להוסיף 100 µL של נוגדן קוקטייל מתוך ערכת העשרה תא B 2 מ של השעיה תא ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה (איור 2-1).
  3. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  4. בקצרה מערבולת החלקיקים המגנטיים המסופק בערכה תא B העשרה עבור 30 s (איור 2-2). להוסיף 150 µL של החלקיקים המגנטיים 2 מ"ל של המדגם.
  5. דגירה המדגם על עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. להביא את אמצעי האחסון מדגם 2.5 מ עם PBS x 1 המכיל 2% עגל עוברית סרום (FCS) וחומצה ethylenediaminetetraacetic 1 מ מ (EDTA). הכנס את הצינור המגנט, דגירה הצינור עוד 3-5 דקות (איור 2-3).
  7. לאסוף את המגנט עם הצינור במקום, בתנועה רציפה אחת, decant את הצינור כך התליה תא מועשר נאסף בשפופרת טריים (איור 2-4). לספור את התאים על ידי מונה הניתן תא אוטומטית או ידנית באמצעות hemocytometer כדי לקבל את התשואה הכוללת תאי B.
    הערה: בדרך כלל, התשואה היא ~ 105 B תאים למ"ל נורמלי בתאי B ו 5-50 x 106 תאים/mL עבור MCL.
  8. המאשרת את טוהר העשרת תא B
    1. קח ~ 50,000 תאים דגירה התאים עם נוגדנים anti-CD19/CD20 (1:20 דילול) ובנוסף נוגדן anti-CD45 כדי fluorochromes שונים (1:10 דילול) בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
    2. לשטוף עם 1 מ"ל של 1 x PBS + 1% BSA, centrifuge את התאים ב- 400-500 g x עבור 5 דקות, resuspend תאי µL ~ 200 ל- PBS.
    3. לרכוש את דגימות תאים על ידי cytometry זרימה ולנתח טוהר של תאי B. טוהר הוא ברובו > 90% בשיטה זו (איור 3).

3. פיתוח של המודל העכבר Xenograft

  1. להשעות ~ 40-60 x 106 תאים ב- 150-200 µL ל- 1 x PBS (נפח תידרש להזריק לכל העכבר).
  2. להזריק 150 µL של התליה תא לווריד (עירוי) לתוך כל וריד הזנב של שבוע 6-7 scid הנד immunodeficient גמא (NSG) עכברים בלי קשר למין (איור 4A).
  3. לאפשר העכברים לפתח לימפומה האנושית ~ 10 שבועות.
    הערה: תאים לימפומה אנושית ראשונית יקח עוד הרבה זמן לפתח גידול לעומת שורות תאים לימפומה אנושי (~ 3 שבועות).
  4. כאשר בעלי החיים מתחילים להראות סימפטומים של מחלות קטלניות כמו ירידה במשקל, שערה הסתור, ירידה בפעילות, שיתוק גפיים הינד, וכדומה, להקריב העכברים בעזרת2 CO ואחריו לב לב לנקב להשיג דם.
  5. לאסוף איברים שונים כמו מח העצם, הטחול, הכבד על ידי לנתח את העכברים, לאסוף דם היקפיים על ידי ציור דם מהלב בזמנו של הקרבה לניתוח engraftment הגידול (איור 4B -F).

4. chimerism ניתוח של תאים סרטניים Engrafted באיברים שונים

  1. לאחר איסוף איברים שונים, לעבד אותם על ידי הפרעה מכנית ליצירת תא בודד המתלים בעקבות פירוק תאי הדם האדומים (RBC) באמצעות µL 200 1 x אמוניום כלוריד האשלגן מאגר דם, מח עצם, µL 500 על הטחול, 2 מ עבור כבד .
  2. לספור, מכתים את התאים באמצעות נוגדנים ספציפיים תא B האנושי, קרי, אנטי-CD19, אנטי-CD20 אנטי-CD45.
    הערה: עכברים NSG חוסר בתאי B, ומכאן לניתוח, תאים מוכתמים עם סמנים תא B אנושי ספציפי.
  3. לנתח את התאים נגזר אורגן על ידי cytometry זרימה על ידי gating בתאי B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
  4. לכמת את תאי הגידול engrafted באיברים שונים שמקורם עכברים MCL מוזרק המבוסס על תאים מגודרת כפי שמצוין בשלב 4.3 (איור 4G).
    הערה: ראה טבלה של חומרים לפרטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כתב היד מתאר פרוטוקול אופטימליים להתפתחות מוצלחת של העכבר xenograft מודל engraftment של תאים MCL. הכנה של אוכלוסיה תא טהור (בתאים הזה במקרה MCL), חיוני מאוד לפתח xenografts MCL מוצלחת. איור 1 מייצג את השלבים מפוח תא תאי בידוד מן הדם של החולה MCL על ידי הפרדת צבע צפיפות. תאי תאי מעובדים נוספים כדי להשיג טהור B תאים באמצעות ערכת העשרה תא B שלילי כדי להשיג אוכלוסיה תא טהור להזרקה xenograft לתוך עכברים. צריך לקחת כדי להשיג טוהר מקסימלית על מנת שיהיה מוצלח MCL eng...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניסויים קליניים אפשריות לתרופות הניתנות בשלב מתקדם של פיתוח אך אינם יכולים לשמש עבור גילוי תרופות. זמן כנראה תפס המאמצים לפתח נמענים בעלי חיים עבור התא האנושי השתלת איברים מבעלי חיים כדי לבדוק תרופות בשלב מוקדם. כאן אנו מציגים במודל חיה מונע דחיית שתל האנושית, יכול להקים מודל עבור מחלות אנושיות, כגון MCL. . זה כרגע דגם xenograft משוכללת כדי לחקור את המנגנונים של גידול אנושי engraftment, הגידול. כאן נשתמש NSG עכברים, אחד המודלים העכבר לקוי ביותר החיסון עד היום על מנת להשיג הצלחה גדולה יותר של לימפומה engraftment. NSG עכבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי le חדר מרווח וחדיש ליגה Genevoise סרטן, ד ר Fondation דובואה Ferriere דינו-ליפאטי, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008, 2914-02-2012, שוויצרי מענק קרן המדע הלאומית 31003A_156760 ו 310030-153456.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ficoll-paque mediaGE Healthcare17-1440-02להפרדת תאים חד-גרעיניים
RPMI Medium 1640Gibco-Life טכנולוגיות61870-010לדילול דגימת דם
פוספט חוצץ מלח (PBS)Sigma-AldrichD8537שטיפת תאים
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA8412להכנת PBS עם 1% BSA המשמש בשטיפת תאים במהלך בידוד
CD19-APC700בקמן קולטרB49212סמן תאי פאן-B אנושי
CD20-APCבקמן קולטרA21693סמן תאי פאן-B אנושי
CD20-ECDבקמן קולטרIM3607סמן תאי פאן-B אנושי
CD5-PC 5.5בקמן קולטרPN A70203סמן
CD23-PEPharmingen555711חלבון פני התא נעדר בדרך כלל ב-MCL
CD45 KOBeckman CoulterB36294סמן פאן-לויקוציטים
CD200-PEPharmingen552475חלבון פני התא נעדר בדרך כלל בעכברי MCL
NOD scid gamma (NSG)מעבדות צ'ארלס ריבר5557שימשו לפיתוח קסנוגרפטים MCL במחקר זה
ערכת העשרת תאי B אנושיים קלהתאי גזע19054המשמשות להעשרת תאי B להשגת תאים טהורים להזרקה לעכברים
FACSבקמן קולטרנאוויוסמשמש לאפיון דגימת MCL ולחקר האיברים להשתלת MCL
1X אמוניום כלוריד מאגר אשלגן מאגרליזה בדם אדום (NH4Cl 8,024 מ"ג לליטר; KHCO3 1,001 מ"ג/ליטר; אדטה. Na2· 2H2O 3.722 מ"ג/ליטר )
תאי T אנושי להעשרת טכנולוגיות

מקורות

  1. Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. Human chemokines: an update. Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).
  2. Baggiolini, M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature. 392, 565-568 (1998).
  3. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th edition, (2001).
  4. De Silva, N. S., Klein, U. Dynamics of B cells in germinal centres. Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).
  5. Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma. Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).
  6. Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems. Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).
  7. Herrmann, A., et al. Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma. J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).
  8. Martin, P., et al. Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies. Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).
  9. Iyengar, S., et al. Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice. Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).
  10. Klco, J. M., et al. Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia. Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).
  11. Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).
  12. Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).
  13. Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts. Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).
  14. Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma. J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

העשרה של תאי Bניתוח בציטומטריה של זרימהתאים מהחולהמחקר השתקת איבריםעכברים עם חסר חיסוניסנטריפוגציה במדרג צמיפותהפרדה באמצעות חרוזי מגנטהזרקה תוורידית
Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.