מאמר שיטה

אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה

DOI:

10.3791/56025

⸱

31 ביולי 2017

 , 
1Biomedical Engineering, University of Virginia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם העניין הגובר של microenvironment הגידול, יצאנו לפתח שיטה כדי לקבוע במיוחד את רכיבי microenvironment בתוך דגימות החולה של glioblastoma, סרטן המוח הקטלני הפולשני ביותר. לא רק שיטות כמותיות מועילות לתיאור מדויק של רקמות חולים, הם יכולים גם לתרום פרוגנוזה מדויקת יותר, אבחון, ופיתוח של מערכות הנדסה רקמות תחליפים. ב glioblastoma, תאים גליה, כגון microglia ו astrocytes, היו מתואמים באופן בלתי תלוי עם פרוגנוזה גרועה על פי דירוג הפתולוג. עם זאת, מצבם של תאים אלה ורכיבי תא גליה אחרים לא תוארו באופן כמותי. זה יכול להיות קשה בשל תהליכים גדולים לסמן תאים אלה גליה. יתר על כן, רוב הניתוחים היסטולוגית להתמקד מדגם הרקמה הכוללת או רק בתוך חלק הארי של הגידול, בניגוד כימות שרטוט מבוסס על שנינות אזוריםהין הרקמה ההטרוגנית ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לזיהוי כמותי וניתוח של אוכלוסיות של תאים גליה בתוך בתפזורת הגידול באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולים glioblastoma. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה בגידולים הגידול המטופל ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. בעזרת טכניקות אלה אנו מסוגלים לתאר טוב יותר את התאים גליה ברחבי אזורים של microivironment הגידול glioma.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glioblastoma (GBM), סרטן השד הנפוץ ביותר וממאיר, מאופיין פלישה מפוזר מאוד מן הגידול העיקרי הראש לתוך parenchyma המוח בריא 1 , 2 . הפלישה המפוזרת הזו גורמת לגידול קשה במיוחד להתרחש באופן מלא, ותאי הסרטן הפולשים שנותרו לאחר הטיפול הם הסיבה השכיחה ביותר להישנות בלתי נמנעת 2 , 3 , 4 . בעבר, מצאנו מעכב את הפלישה לתאי גליומה מפוזר להיות מועיל מבחינה טיפולית 5 , אולם מעט ידוע על מנגנונים מורכבים התורמים פלישה GBM. הגידול microenvironment, או רקמות המקיפות את הסרטן, כבר מעורב בהתקדמות של גידולים במספר סוגי סרטן 6 , 7 . הגידול microivironment הגידול glioblastoma, בעמ 'ארטיקולרי, הוא יחסית מאופיין והוא מורכב במיוחד, חיבור של תאים גליה מרובים, כגון אסטרוציטים, microglia, ו oligodendrocytes, כמו גם מטריקס תאיים, גורמים מסיסים, גורמים ביו-פיזי. ניסיוני, astrocytes ו microglia הוצגו כדי להגביר את התקדמות glioma ו פלישה 8 , 9 , 10 , אבל את ההרכב של כל תאי גליה של microenvironment המוח האנושי אינו ידוע.

הראינו בעבר רכיבים microenvironmental יכול לחזות הישרדות המטופל על ידי כמותית ניתוח מרכיבי הסלולר של microivironment glioblastoma ושילוב הניתוחים שלנו לתוך מודל סיכונים יחסיים 11 . כאן, אנו מתארים את שיטת ניתוח כמותי לזיהוי אוכלוסיות של תאים גליה בתוך הגידול בתפזורת באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולה glioblastomaS. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה chromogenic כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. הערכת אחוז כיסוי יוצר מדידה פשוטה לקביעת הבדלים מורפולוגיים של תאים, במיוחד אלה מושפעים אינטראקציות עם תאים סרטניים. מחקרים קודמים לכימות מכתים היסטופאתולוגיים משתמשים בכתמים סטנדרטיים כגון hematoxylin ו- eosin 12 או Trichrome 13 של Masson, אשר אינם מנצלים את הספציפיות של מכתים אימונוהיסטוכימיים המבוססים על נוגדנים. השיטה שלנו פותחה כדי לכמת ישירות את אוכלוסיות גלייה בתוך resioblastoma החולה גידולים הגידול, אשר אנו שואפים להשתמש כדי להבהיר את microivironment glioblastoma מורכבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מזהה רכיבים סלולריים דגימות פרפין קבוע מוטבע (FFPE) מוטבע (FFPE), כפי אופייני לדגימות המטופלים קליניים. הטבעה פרפין מאפשר תחזוקה הטובה ביותר של מורפולוגיה הסלולר והרקמות, כמו גם יש אריכות ימים טובה יותר של חלקים. הדגימות המשמשות ניתוח זה היו לגשת דרך אוניברסיטת וירג 'יניה Biorepository ו מחקר רקמות מתקן. דגימות החולה נבחרו על ידי נוירופתולוג המבוסס על אבחנה סופית של גלובלסטומה (אסטרוציטומה, WHO דרגה IV), אשר סיימה את תהליך החזרת הגידול באוניברסיטה של ​​וירג'יניה בין השנים 2010 ו -2013, וזוהו לפני ניתוח זה 11 .

1. FFPE דוגמה Deparaffinization ו התייבשות

הערה: חלק זה של הפרוטוקול הוא ספציפי דגימות FFPE. בעוד דגימות paraffin- מוטבע יכול להיות שימושי יותר עבור ניתוח זה בגלל שימור של תאים סלולריים ו- Tנושא מורפולוגיה, ניתוח זה יכול להיעשות גם עם חלקים קפואים. אם באמצעות מקטעים קפואים, חלק זה יכול להיות מושמט ולהמשיך ישירות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית.

  1. בצע את שוטף הבא 5 דקות כל: Xylene, קסילן, אתנול 100%, אתנול 100%, אתנול 95%, אתנול 95%, אתנול 70%, מים deionized, מים deionized

2. אחזור אנטיגן

הערה: חלק זה של הפרוטוקול יש צורך לשבור גשרים מתילן נוצר במהלך קיבעון פורמלין של דגימות FFPE ולחשוף אתרי אנטיגן עבור נוגדנים לאגד.

  1. לדלל טריס מבוסס גבוה pH אנטיגן מסיר פתרון על המלצה היצרן במים מזוקקים.
  2. בצע אחזור אנטיגן בחום באמצעות מיקרוגל. צורות אחרות של אחזור בתיווך חום (כגון סיר לחץ, סיר אדים או מים רותחים) יספיקו גם הם.
    1. מוסיפים את פתרון מסיר מדולל לתוך מיקרוגל לא חתוםכְּלִי שַׁיִט. המקום שקופיות לתוך כלי. המקום שקופיות לתוך מיקרוגל.
    2. מרתיחים במשך 20 דקות בעוצמה גבוהה. לפקח על רמות נוזלים על אידוי, וכן לחדש עם מים מזוקקים לפי הצורך.
  3. אפשר דגימות להתקרר פתרון עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.

3. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית

  1. מדגם רקמות מתאר עם עט הידרופובי כדי למזער נפח של ריאגנטים הדרושים כדי לכסות מדגם.
    הערה: הקפד לשמור על דגימות רקמות hydrated ולא נותנים להם להתייבש כמו זה ישפיע על יעילות מכתים.
  2. פתרון pipet מספיק permeabilization (טריס שנאגרו מלוחים (TBS) + 0.01% Triton-X) כדי לכסות מדגם רקמות (בדרך כלל על 100-200 μL).
  3. הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.2.
  4. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת (פתרון הסרום 2.5% + פתרון permeabilization).
  5. דגירה דגימות לילה 4 מעלות צלסיוס עם נוגדנים ראשוניים בדילולב חסימת פתרון.
    הערה: כל נוגדנים ראשוניים המשמשים כאן הם מדולל ב 1: 200, אבל דילולים אופטימלי ניתן לקבוע באמצעות דילולים סדרתי החל עם המלצה היצרן. מידע מפורט על נוגדנים בשימוש בפרוטוקול זה פורסם בעבר 11 .
  6. זיהוי נוגדנים ראשוניים באמצעות חזרת peroxidase פולימדיאז מגיב המקביל עם החיה המארח העיקרי נוגדן, בעקבות פרוטוקול היצרנים.
  7. פיפטה פתרון permeabilization מספיק כדי לכסות מדגם הרקמה ו דגירה במשך 5 דקות.
  8. הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.7.
  9. דגירה שקופיות 0.3% H 2 O 2 ב 1x TBS במשך 15 דקות.
  10. לפתח דגימות עם dixinobenzidine peroxidase (DAB) המצע עבור 2 - 10 דקות עד עוצמת הכתם הרצוי מושגת.
  11. דגימות Counterstain לזהות גרעיני תאים, כגון עם hematoxylin, בעקבות פרוטוקול היצרן.
  12. מייבשים דגימות עם 100%אתנול וקסילן.
  13. הר דגימות לצמיתות עם התקשורת הרכבה.

4. אזורים של זיהוי אינטרסים

  1. שקופיות תמונה תחת מיקרוסקופ brightfield מסוגל תמונות ברזולוציה גבוהה.
    הערה: השתמש ברכיבים סלולריים להדמיה ברזולוציה של 20x לפחות.
  2. העבר מצלמה לאזורים ספציפיים של עניין בכל דגימות הרקמה.
  3. שמור תמונות כקובצי TIFF לכימות.

5. ניתוח תמונה

  1. פתח תמונות ב- ImageJ לכימות של כיסוי אחוזים.
  2. השתמש תוסף צבע הסף כדי להסיר צבע סגול מן הגרעיני hematoxylin מוכתם.
  3. המרת תמונה ל -8 סיביות.
  4. הוסף סף ללא רקע כהה.
  5. תהליך התמונה באמצעות אחד 17 טעון מראש מסננים סף ImageJ ( כלומר MaxEntropy) כך רק DAB מנות מוכתמות כלולים בסף.
    הערה: בחר את מסנן הסף האופטימלי מראש ש - minimizהכללה של מכתים רקע. זה יכול לסמוך על איכות מכתים וספציפיות של נוגדנים. השתמש באותו סף עבור כל משכפל טכני בתוך כל מדגם המטופל.
  6. החלת סף.
  7. מדוד את אזור האחוזים של התמונה הסופית.
  8. ממוצע אזור כיסוי כיסוי עבור אזורים מרובים בתוך כל מדגם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לצורך ניתוח זה, זוהו שני אזורים של אינטרסים בגידולים שלנו - הגידול העיקרי של הגידול והאזורים הסמוכים, המורכבים בעיקר מרקמות בריאות עם תאים סרטניים פולשים פולשים ( איור 1 א ' , 1 ב' ) - זוהו על ידי נוירופתולוגים משתפי פעולה על hematoxylin ו- eosin דגימות. בתוך כל מדגם המטופל, מכתים חיובי עבור האסטרוציטים ( איור 1C ), microglia (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצעת כאן היא גישה כמותית לניתוח דגימות היסטולוגית מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית המסורתית. המתודולוגיה הנוכחית עבור סוג זה של ניתוח כולל פרוטוקולים מכתים דומים ואחריו לדירוג על ידי פתולוגים עצמאיים. שיטה זו היתה מהימנה, אולם עבור מספר יישומים, נדרשת הבנה מדויקת יותר של האיפור הסלולרי, כגון הבנה טובה יותר של ההטרוגניות הקשורה בגידולים וסיכום מדויק של גידולים למחקרים חוץ גופית.

פרוטוקול זה מדגים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר. פאהד באפאקיה וג'ים מנדל על רכישת וזיהוי דגימות החולה, גארט פ'ביילי לעזרה עם אימונוהיסטוכימיה, וכן מאגר ביאורוספטורי ומחקר מחקר רקמות, המרכז לחקר הלב וכלי הדם במרכז ההיסטולוגיה ומכון המחקר ביומולקולרי באוניברסיטה של ​​וירג'יניה. רכישת מדגם, אימונוהיסטוכימיה, והדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קסילןפישר כימיקלX3P
אתנול
תמיסת חשיפת אנטיגן עם pH גבוהVector LabsH-3301
TBS
Triton-XAmresco9002-93-1
סרום
סוסים נגד ALDH1L1 abcam ab56777
אנטי-IBA1 abcam ab5076
חלבון ספציפי אנטי-אוליגודנדרוציטים1 abcam ab53041
ImmPRESS מעבדותוקטור נגד עיזיםMP-7405
ImmPRESS אוניברסלי (נגד עכבר/ארנב)מעבדות וקטורMP-7500
מי חמצןסיגמא אולדריץ'216763
ImmPACT DAB מצעוקטור מעבדותSK-4105
המטוקסילין נגד כתמיםThermoScientific72404
Histochoice הרכבה מדיהאמרסקוH157-475
Aperio ScanscopeLeica Biosystems
Image ScanscopeLeica Biosystems
Super HT PAPPen מחקר מוצרים בינלאומיים195506

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
  4. Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
  5. Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).
  6. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
  7. Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
  8. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
  9. Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
  10. Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
  11. Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
  12. Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
  13. Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
  14. Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
  15. Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
  16. Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
  17. Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
  18. Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
  19. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
  20. Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
  21. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
  22. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
  23. Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
  24. Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Glioblastoma Tumor MicroenvironmentChromogenic ImmunohistochemistryImageJ AnalysisGlial Cell QuantificationPatient Tumor ResectionsAntigen RetrievalPermeabilization SolutionPrimary AntibodiesDAB SubstrateHematoxylin Counterstain

מאמרים קשורים