הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ג 'ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ"א קומפלקסים

11.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56031

⸱

28 ביולי 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

במאמר זה

סיכום

יליד polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי לניתוח אינטראקציות רנ"א חלבון. באופן מסורתי רוב הניסויים השתמשו בג'לים אנכיים. עם זאת, ג 'לים אופקית לספק מספר יתרונות, כגון הזדמנות לפקח מתחמי במהלך אלקטרופורזה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקי גלוקל אלקטרופורזה הילידים.

תקציר

יליד polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי של ביולוגיה מולקולרית אשר שימש בהרחבה לניתוח ביוכימי של אינטראקציות רנ"א חלבון. אינטראקציות אלה ניתחו באופן מסורתי עם ג'ל polyacrylamide שנוצר בין שתי צלחות זכוכית דגימות electrophoresed אנכית. עם זאת, ג 'ל polyacrylamide יצוק מגשים electrophoresed אופקית מציעה מספר יתרונות. לדוגמה, ג 'לים אופקי המשמש כדי לנתח מתחמי בין מצעים RNA פלואורסצנטי חלבונים ספציפיים ניתן הדמיה מספר פעמים כמו אלקטרופורזה מתקדמת. זה מספק הזדמנות ייחודית לפקח על מתחמי RNA חלבונים בכמה נקודות במהלך הניסוי. בנוסף, אלקטרופורזה ג'ל אופקית מאפשרת לנתח דוגמאות רבות במקביל. זה יכול מאוד להקל על הניסויים כמובן כמובן, כמו גם ניתוח של מספר רב של תגובות בו זמנית להשוות רכיבים שונים ותנאים. הנה אנחנו יחסי ציבורOvide פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקית אלקטרופורזה הילידים אופקי לניתוח אינטראקציות RNA-Protein.

מבוא

מבחני מעבר ניידות אלקטרופורטית (EMSAs) הוכיחו להיות כלי ביוכימי שלא יסולא בפז לנתח אינטראקציות ספציפיות לחלבון-חומצה גרעינית 1 , 2 , 3 . מבחני אלה יכולים לספק מידע חשוב לגבי זיקה מחייב של חלבונים ל- RNA או DNA 3 , stoichiometry מרכיב של מתחמי חומצה גרעין 1 ולספק תובנות חדשות חשובות על הייחודיות מחייב של חלבונים RNA מחייב באמצעות ניסויים בתחרות המצע 1 .

ההגדרה הניסויית המסורתית עבור מבחני אלה מורכב ערבוב חלבון מטוהרים עם המצע RNA radiolabeled. מתחמי שהתקבלו לאחר מכן מנותחים עם הלא denaturing (יליד) ג 'ל polyacrylamide שפכו בין שתי צלחות זכוכית ואחריו electrophoresis מדגם במנגנון אנכי 3. בעוד גישה זו שימשה באופן ממצה כדי לספק תובנות חשובות במנגנונים הביוכימיים שבבסיס מחייב של חלבונים לחומצות גרעין, יש לה גם מספר מגבלות. לדוגמה, לאסטרטגיה בסיסית זו יש תפוקה נמוכה יחסית והיא אינה ניתנת להתאמה בקלות עבור יישומים הדורשים ניתוח של תגובות מחייבות רבות במקביל. בנוסף, עם המנגנון האנכי המסורתי זה מאתגר פוטנציאלי לפקח מתחמים במספר פעמים במהלך אלקטרופורזה 3 , 4 .

כאן אנו מציגים הסתגלות של assay EMSA המשתמשת ג 'ל polyacrylamide יליד יצוק מכשיר שטוח, אלקטרופורזה אופקית ו fluorescently שכותרתו RNA מצעים 4 , 5 , 6 , 7 . שילובם של שינויים פשוטים יחסית אלהTegy מספק כמה יתרונות חזקים. בפרט, פורמט שטוח אופקי בקלות משאיל את עצמו לנתח עשרות דגימות בו זמנית 4 . כמו כן, עבור כמה מתחמי RNA חלבונים, כגון אלה שנוצרו בין החלבון Bicaudal-C ו אלקטרופורזה המצע RNA שלה בג'ל אופקי מספק יכולת מוגברת כדי לפתור שונים RNA חלבונים מתחמי להפלות אלה ממצע רנ"א מאוגד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ג 'ל אופקי הילידים Polyacrylamide ג'ל 4 .

  1. הכנת החומרים הדרושים.
    1. עבור מכשיר ג'ל אופקי, השתמש בתיבת ג'ל (37 ס"מ x 24 ס"מ) עם מגש 27 ס"מ x 21 ס"מ ויכולת עבור שתי מסרקים 24 היטב. התקנה זו מספקת סך של 48 דגימות שניתן לנתח בו זמנית.
    2. הכן את ריאגנטים הבאים: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED, ו 10% APS (persulfate אמוניום).
  2. דור של 10% יליד אקרילמיד היל.
    1. בתוך בקבוק 500 מ"ל, מוסיפים 80 מ"ל של TBE 5x, 100 מ"ל של 40% acrylamide, ו מים נפח סופי של 400 מ"ל.
    2. הוסף 4 מ"ל של APS 10% ו 400 μL של TEMED. לערבב היטב.
    3. יוצקים את התערובת לתוך מגש הליהוק האופקי ומאפשרים את הג'ל לפלמור במשך 30 דקות. הג'ל יהיה בערך 2 ס"מ עובי.
      הערה: ג 'לים יכול להטיל על מכסה המנוע קטר כדי להאיץ- פילמור. לאחר פילמור, שכבה דקה של נוזל יישאר על גבי הג'ל.
    4. יוצקים את הנוזל ואת לשטוף עם חיץ פועל. הסר את המסרק (ים) בזהירות ולשטוף את הבארות עם חיץ פועל באמצעות מזרק.
  3. הכנת מאגר חיץ.
    1. הכן 2 L של 1x TBE פועל מאגר עבור תיבת ג'ל. מדולל 400 מ"ל של 5XTBE עם 1600 מ"ל ומערבבים. מקום 1x TBE חיץ בחדר קר להתקרר.
  4. טרום הפעלת ג'ל
    1. הוסף 2 L למאגר ריצה קר לתיבת ג'ל ולהכניס את הג'ל.
    2. טרום להפעיל את הג'ל ב 120 V במשך שעה 1 ב 4 ° C בחדר קר. במהלך תקופה זו, להכין את התגובה מחייב.

2. תגובה מחייב 8

  1. 2.1.הכנה את רכיבי התגובה הבאים.
    20 מ"מ DTT
    10 מ"מ BSA
    10 mM שמרים tRNAs
    חיץ 5X מחייב (50 מ"מ HEPES pH 8.0, 5 מ"מ EDTA, 250 מ"מ KCl, 0.2% Tween-20)
    100 פלואורסצין ננומטר שכותרתו RNA מסחרית
    חלבון Bicudal C מרוכז
    50% גליצרול ב DEPC שטופלו H 2 O
    DEPC שטופלו H 2 O
  2. להרכיב את רכיבי התגובה מחייב צינור RNase חופשי microcentrifuge.
    1. כדי הצינור, להוסיף 5 μL של 10 מ"מ BSA, 5 μL של 20 מ"מ DTT, 5 μL של 10 mM שמרים tRNAs, 10 μL של הצפת 5x מחייב.
  3. הוסף חלבון לריכוז סופי של 250 ננומטר ב 50 μL. הוסף מים לנפח סופי של 45 μL.
  4. הוסף 5 μL של המצע RNA שכותרתו fluorescently. השתמש מסחרי שנרכש 3 'פלואורסצין שכותרתו 32 מצע נוקליאוטידים.
  5. מערבבים ו דגירה בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

3. ניתוח של דוגמאות על הילידים אופקית Polyacrylamide ג'ל

  1. לכל תגובה, להוסיף 15 μL של גליצרול 50% ומערבבים בעדינות.
  2. CarefuLly להוסיף 30 μL של כל תגובה לג'ל. כמות המדגם שניתן לטעון לתוך באר אחת משתנה בהתאם לעובי של ג 'ל ואת גודל הבארות. יש לנו כרכים טעון כמו μL 15 ו עד 45 μL לתוך באר אחת של ג'לים שנוצרו עם מסרק 24 גם שפכו לעובי של 2 ס"מ.
  3. לאחר חיבור ספק הכוח למתג הג 'ל על הכוח ולהתאים את המתח. הפעל את הג'ל ב 4 ° C ב 120 V.
    הערה: עבור מכשיר ג'ל אופקית, זה בסופו של דבר להיות כ 5 V / cm. עבור מכשיר ג'ל אנכי, זה 16 V / cm.
    1. כדי למנוע נזק או הלבנה של RNA שכותרתו fluorescently, לנהל אלקטרופורזה בחושך.
    2. פעמים אלקטרופורזה משתנה בהתאם הפרטים של קומפלקס חלבון רנ"א להיות מנותח.
      הערה: יתרון גדול של ניתוח אופקי EMSA הוא אלקטרופורזה ניתן לעצור, הג'ל צילמו ולאחר מכן את geאני יכול להיות ממוקם בחזרה לתוך מנגנון אלקטרופורזה ניתן להמשיך עוד פעמים.

4. הדמיה ג'ל

  1. בצע ניתוח עם כל מכשיר המיועד לזיהוי וצילום פלואורסצנטי הדמיה.
  2. מניחים את הג'ל על imager.
  3. התאם הגדרות imager. עבור ligands RNA fluorescein שכותרתו, השתמש בהגדרות הבאות: FAM (אורך גל 473 ננומטר), 750 מתח מכפיל (PMT), 100 פיקסלים פיקסל גודל.
  4. סרוק את הג'ל כדי ללכוד תמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים את הכוח ואת צדדיות של אופקי הילידים ג 'ל אלקטרופורזה ניתחנו את הכריכה של Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) חלבון ל RNA שכותרתו fluorescently המכיל אתר מחייב Bicc1. חלבונים Bicc1 לתפקד כמו mRNA ספציפיים מדכאים translational לשלוט בתאי הגורל החלטות במהלך השלבים האימהיים של התפתחות בעלי חיים 9 , 10 , 11 , 12...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ג 'ל polyacrylamide הילידים הם כלי רב ערך לחקר אינטראקציות חלבון- RNA ו באופן מסורתי ג'לים אלה electrophoresed אנכית 2 , 3 . השתמשנו שינוי של פרוטוקול מחליף ג 'ל polyacrylamide יליד נוצר electrophoresed אופקית 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . שינויים אלה משמשים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לורה Vanderploeg להכנת דמויות. עבודה במעבדה Sheets נתמך על ידי מענק NSF 1050395 ומענק NIH (R21HD076828). עבודה במעבדה ריידר נתמכת על ידי מענקים NIH R01GM117237 ו R01GM117008. מייגן Dowdle נתמכת על ידי מלגת GRS SciMed הזדמנות מתקדמת באמצעות אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון בוגר בית הספר ותוכנית ביוטכנולוגיה הדרכה באמצעות המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM008349).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קופסת ג'ל אופקיתינשוףN/Aהמוצר כבר לא מיוצר. קופסאות ג'ל דומות ניתן למצוא ב-Thermo Scientific, קופסאות ג'ל מסדרת A. מספר קטלוגי: A2-BP
24 בארות גדולות מסרקות אלקטרופורזה אופקית גדולה של ג'לינשוףN/Aהמוצר כבר לא מיוצר. קופסאות ג'ל דומות ניתן למצוא ב-Thermo Scientific, מסרקי קופסאות ג'ל מסדרת A. מספר קטלוגי: A2-24C
Powerpac 300Bio-Rad1655050
Mini-Protean II Electrophoresis CellBio-Rad165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 אקרילאמיד/ביסIBIIB70015
TEMEDIBIIB70120
APSIBIIB70080
שמרים tRNAsאמביוןAM7119
פלואורסצאין שכותרתו RNAIDTN /A ניתן לבצע הזמנה בהתאמה אישית לאורך ולרצף הרצוי
EDTA טטרסודיום מלח הידרטסיגמא-אולדריץ'E5391-1KG
HEPESסיגמא-אולדריץ'H4034-500G
טריס בסיס אולטרה-טהורארה"ב ביולוגיT8600
חומצה בוריתפישר מדעיBP168-500
אשלגן כלוריפישר סיינטיפיקBP366-1
טווין-20פישר סיינטיפיקBP337-500
DEPCסיגמא-אולדריץ'1609-47-8
דיתיותרייטול (DTT)סיגמא-אולדריץ'3483 12 3
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אולדריץ'9048-46-8

מקורות

  1. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  2. Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
  5. Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
  6. Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
  7. Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
  8. Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
  9. Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386(2012).
  10. Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  11. Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  12. Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  13. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  14. Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  15. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
  16. Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Native PAGERNAEMSARNATBE
ג 'ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ"א קומפלקסים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.