מאמר שיטה

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

DOI:

10.3791/56039

⸱

12 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים ללמוד העורקים מאתר של הלידה באמצעות ויוו ניתוח המשובטים, מיפוי הגורל, אבי העורקים explants שריר חלק מבודד התאים מפורטים כאן. גישות מגוונות אלה לקדם את חקירת מורפוגנזה של אבי העורקים של הלידה בהתפתחות נורמלית, בפתוגנזה של המחלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבי העורקים הוא העורק הגדול ביותר בגוף. הקיר אבי העורקים מורכב של השכבה הפנימית של תאי אנדותל, שכבה אמצעית לסירוגין lamellae אלסטית ותאי שריר חלק (SMCs), השכבה החיצונית של fibroblasts, מטריצה חוץ-תאית. בניגוד המחקר הנרחב של מודלים פתולוגי (למשל, טרשת עורקים) באבי העורקים למבוגרים, הרבה פחות ידוע על הלידה של אבי העורקים. כאן, אנו מתמקדים SMCs ולספק פרוטוקולים עבור הניתוח של מורפוגנזה ו בפתוגנזה של הלידה של אבי העורקים SMCs להתפתחות התקינה, המחלה. באופן ספציפי, הפרוטוקולים ארבע כללה הן: אני) ויוו גורל עובריים מיפוי וניתוח המשובטים; ii) explant העורקים עובריים תרבות; iii) SMC בידוד מן העורקים הלידה; ו- iv) תת עורית משאבת מיני osmotic השמה בעכברים בהריון (או שאינה בהריון). לפיכך, גישות אלה לקדם את החקירה של origin(s), גורל, אדריכלות המשובטים של SMCs אבי העורקים vivo בתוך. הם מאפשרים להתכוונן העורקים עובריים מורפוגנזה בתוך הרחם על ידי חשיפה מתמשכת סוכנים תרופתי. בנוסף, מבודד רקמות אבי העורקים explants או SMCs של אבי העורקים יכול לשמש כדי לקבל תובנות לגבי התפקיד של גנים ספציפיים מטרות במהלך תהליכי יסוד כגון muscularization, הפצה, העברה. ניסויים אלה השערת מניבות SMCs מבודדים, העורקים explanted יכול להידרש ואז בהקשר ויוו דרך גישות תרופתי גנטי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת הדם של אורגניזמים רב תאיים פונקציה כדי לספק חומרים מזינים וחמצן לתאים כי הם לא בקשר עם הסביבה החיצונית כדי להסיר תאים אלה הפסולת, פחמן דו-חמצני. החוליות, מורכבת מערכת הדם העיקריים הלב, אשר שואב דם דרך סדרה של כלי הדם. דפנות כלי דם גדולים, כגון העורקים והוורידים, מורכבת משלוש שכבות: אני) אינטימה או השכבה הפנימית של תאי אנדותל; ii מדיה), או שכבה אמצעית לסירוגין circumferentially מוארך תאי שריר חלק SMCs ואת lamellae אלסטית; ו- iii) adventitia, או השכבה החיצונית של רקמות החיבור ואת fibroblasts. הרוב המכריע של לימודי ביולוגיה וסקולרית מתמקדים תאי אנדותל, חוקר היווצרות חדשים אנדותל מצופה תא צינורות דרך אנגיוגנזה. לשם השוואה, SMCs מקבלים תשומת לב מועטה יחסית. עם זאת, SMCs הם סוג תא קריטי בניית הקיר עורקי נורמלי, פתולוגיות כלי הדם.

אבי העורקים הוא העורק בקוטר הגדול ביותר בגוף, מקבל את תפוקת הלב של החדר השמאלי של הלב. זה הוא נגועים על ידי מחלות אנושיות מגוונות, כולל טרשת עורקים, מפרצת לנתיחה. אורגניזמים למבוגרים, אבי העורקים ואת סניפיה הגדולים נלמדים באופן אינטנסיבי במודלים של מחלת כלי דם. למשל, בשומן האכיל עכברים שאינם null עבור הגן קידוד של קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה או אפוליפופרוטאין E, לפתח טרשת עורקים, מחקרים אחרונים של מיפוי גורל מציינים כי קיימים SMCs להצמיח סוגי תאים מרובים ב- פלאק טרשת עורקים1. מפרצת אבי העורקים, שינויים פתולוגיים לכלול SMC ואפופטוזיס ו מטריצה חוץ-תאית שיפוץ2,3.

באופן משמעותי פחות ידוע לגבי SMC מורפוגנזה ו פתוגנזה בתקופות של הלידה. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים עבור הלומדים הלידה של אבי העורקים SMCs ויוו, explants רקמות, תאים בודדים. למשל, החלק הראשון של הפרוטוקול משרטט גורל מיפוי וניתוח המשובטים בעכברים עובריים. Recombinase Cre הביע תחת השליטה של תאים ספציפיים מקדם מכירות מאפשר הסימון של תאים ספציפיים, שלהם רומא4,5,6; עם זאת, שליטה הטמפורלי של תאים ספציפיים תיוג יכול להיות מאתגר במהלך התפתחות עובריים בעכברים. בהקשר זה, עם עוברי לבטא את CreER מותנה תחת מקדם מכירות פעיל של SMCs (e.g.,Myh11 או Acta2), עיתונאי Cre, אנו מספקים שיטות הזרקת טמוקסיפן או שלה המטבוליט הפעיל 4-OH-טמוקסיפן, סכרים בהריון עבור ניתוח התאים שכותרתו עוברי או צאצא כמחנכת. יתר על כן, בניגוד גורל מיפוי מחקרים, אשר predominately לנצל Cre עיתונאים עם1,fluorophore7כתב יחיד, ניתוח המשובטים באופן משמעותי מוגברת עם צבע רב Cre כתבים.

החלקים השני והשלישי של פרוטוקול מתארים שיטות בידוד, culturing עובריים explants של אבי העורקים, אבי העורקים SMCs מ- neonates, בהתאמה. גישות אלה מאפשרות המניפולציה של איתות המסלולים, בפרט explants של אבי העורקים או SMCs, וכן ניתוח ההשפעות הישירות של סוכנים תרופתי. לפיכך, התפקיד של גנים ספציפיים ברקמות עניין יכולים להיות מוקרן בצורה מהירה הרבה יותר מאשר דרך מסורתית שינויים גנטיים בעכברים. בנוסף, המחקרים SMC מבודד להקל על הניתוח של נדידת תאים, הדבקה, אשר מבחינה טכנית מוגבל בתוך vivo.

בסופו של דבר, החלק הרביעי פרוטוקול מתארת את המיקום של משאבת מיני תת עורית osmotic נטען עם סוכנים תרופתי בהריון (או שאינה בהריון) עכברים. שיטה זו מקלה על הניתוח של ההשפעה על התפתחות הנגרמת על ידי סוכנים הדורשים תקינות בגלל חילוף חומרים מהיר. החלופה של זריקות תכופות אינה מעשית עבור סוכנים רבים, יש להימנע, שכן היא עלולה לגרום אי נוחות משמעותי בסכר בהריון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים העכבר אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת ייל.

1-ב Vivo עובריים גורל מיפוי וניתוח המשובטים

הערה: השתמשנו גישות אלה באופן נרחב כדי להעריך את מקורותיה של תאים ואדריכלות המשובטים שלהם מחלות ופיתוח דגמים 7 , 8 , 9 , 10.

  1. להגדיר את הזיווג בין עכברים עם CreER עכברים עם עיתונאי Cre.
    הערה: CreER משמש SMC סימון; Myh11-CreERT2 או Acta2-CreERT2-עכברים- 11 ,- 12 הוא נפוץ למטרה זו. השתמשנו עכברים ROSA26R-CreERT2 13 לסימון בהרחבה רקמות עובריים.
    1. לניתוח המשובטים, להשתמש צבע רב Cre כתב (למשל, קונפטי או קשת [Rb] עכברים) 8 , 14 , 15 ולהשתמש למיפוי הגורל, צבע יחיד Cre כתב (למשל, ROSA26R-YFP עכברים 16) או הכתב Cre כפול-צבע ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
      הערה: ערכת גידול זו משתמשת עכברים בוגרים 2-6 חודשים (בדרך כלל ~ 30 גר'), יפיק עוברי ועם CreER של עיתונאי Cre.
  2. לבדוק אם מהנרתיק פקקים בבוקר באמצעות מתכת בדיקה ולשקול בצהריים ביום הכנס זיהוי כשמש עובריים (E) 0.5.
  3. להפריד את הנקבה הזכר כאשר פקק מזוהה.
  4. הכנת 4-OH-טמוקסיפן ופתרונות עבודה טמוקסיפן.
    1. עבור 4-OH-טמוקסיפן, יתמוסס 5 מ"ג µL 50 100% אתנול, מערבולת למשך 2 דקות ולאחר מכן להוסיף µL 450 של שמן תירס. על קרח, sonicate ברמה פלט 2 מחזורים 10 s עם נח בין מחזורי עד מדגם יירגע. לאחר דגימה היא התפרקה לחלוטין (בדרך כלל ~ 4-5 מחזורי sonication) µL 200 של פתרון sonicated ו להמיס 1,800 µL של שמן תירס כדי להפוך את הפתרון עובד הסופי (4-OH-טמוקסיפן, 1 מ"ג/מ"ל).
    2. של טמוקסיפן, לדלל עד 50 מ"ג/מ"ל ב 100% אתנול וביו -מערבולת עד זה היא התפרקה. שתדללו בשמן תירס כדי להפוך את הפתרון הסופי עבודה (טמוקסיפן, 10 מ"ג/מ"ל) ומערבבים ב 45 ° C כדי להבטיח כי זה מפורקת לגמרי.
  5. עבור אינדוקציה עובריים מוקדם, להזריק 4-OH-טמוקסיפן intraperitoneally לתוך סכר בהריון.
    1. השתמש זריקות 4-OH-טמוקסיפן (עד 150 ~ µg העכבר בהריון, או בערך 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף)-E5.5 ולאחר מכן כפי הם תשואה סכר קיימא, העוברים ואת הגורים.
    2. טמוקסיפן שימוש במינונים של 0.5 - 1.5 mg (או 17-50 מ"ג/ק"ג) עבור סכרים בהריון עם עוברי-~ E9 לאחר מכן. שימוש במחט 30G לזריקות כל.
      הערה: סינון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 משמשת בדרך כלל כדי לעקר כל תערובות לפני ההזרקה.
  6. לניתוח המשובטים, להשתמש בקרום הבטן זריקות של מינונים גבוהים של 4-OH-טמוקסיפן (למשל, 5 מ"ג/ק"ג) או טמוקסיפן (למשל, 50 מ"ג/ק"ג) לסימון תאים מרובים.
    1. כדי לסמן תאים בודדים, titrate למטה המינון 4-OH-טמוקסיפן או טמוקסיפן כזה בתוך הרקמה עניין (קרי, אב העורקים), כמעט כל העוברים ניתוח (כפי שמתואר להלן בסוף סעיף זה) יש או אין תאים עם תוויות או רק תאים של צבע אחד; . זו המנה הסף.
  7. כדי לסמן את התאים בתקופת אמצע-מאוחר הריונית ולהזריק לעקוב אחר גורלם או clonality העכבר כמחנכת, פרוגסטרון לתוך חלל בקרום הבטן של הסכר בהריון/ת עם טמוקסיפן ב- 1:2 (פרוגסטרון: טמוקסיפן) מינון יחס.
    הערה: טמוקסיפן במינונים נמוכים 17-50 מ"ג/ק"ג, פרוגסטרון במינונים נמוכים 8.5-25 מ"ג/ק"ג (כלומר, חצי המנות טמוקסיפן). הזרקת פרוגסטרון עלולה לעכב את העבודה על ידי ~ 1-2 ימים.
  8. Euthanize סכר בהריון עם עוברי של עידן הרצוי באמצעות שיטה פתוחה טיפה, היכן ימוקם הסכר ככלי קיבול המכיל כותנה או גזה ספוגה איזופלוריין מדולל. לאשר מוות על-ידי פתיחת בחלל החזה לזירוז חזה אוויר, על ידי הסרת לאיברים החיוניים, ו/או על ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם.
  9. לטהר הבטן עם 70% אתנול. להשתמש במספריים כדי לפתוח את הבטן ומנתחים את הרחם. הסר את העוברים הרחם ולאחר הפרד בזהירות את העוברים מן השליה שק החלמון באמצעות מלקחיים.
  10. המתת חסד את העוברים-E15 ומעלה על-ידי ביצוע או נקע בצוואר הרחם או עריפת ראש עם מספריים כירורגיים או סכין חדה.
    הערה: עוברי צעיר יותר E15 למות במהירות בעקבות המתת חסד של האם ו/או ההסרה של העוברים מאמא.
  11. למקם את העוברים ב- PBS קר כקרח, לחתוך חתיכה קטנה של הזנב באמצעות מספריים גנוטיפ עבור הכתבת CreER ו- Cre.
  12. לתקן העוברים ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור 2 ח' לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב- PBS, ואז דגירה העוברים ב 30% סוכרוז ב- PBS ב 15-mL צינורות, המתנה עד הם שוקעים, אשר עשוי להימשך עד יומיים.
  13. מילוי פלסטיק קפוא תבניות עד 2/3 של רמה מקסימלית עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם. מניחים כל העובר אנכית כייר, לגמרי שקועים Incubate אוקטובר 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי למזער את בועות.
  14. הקפאת רקמת בלוקים זקוף, קרח יבש, 70% אתנול אמבט להקפיא את המקום. לאחסן הבלוקים ב-80 מעלות צלזיוס
  15. מוגדר הטמפרטורה cryostat-22 ° C, חותכים כדי ליצור מקטעים רוחבי דרך העורקים כולו, 10-20 מיקרומטר עבה. יבש את השקופיות ב RT למשך 30 דקות לפני אחסונם ב-80 מעלות צלזיוס
  16. להפשיר את השקופיות ב RT, מוגן מפני אור כדי למנוע את הלבנה של fluorophores. לשטוף את השקופיות עם PBS-Tween20 0.1%.
    1. לניתוח המשובטים, מכתים את השקופיות עבור גרעינים (דאפי, 5 מ"ג/מ"ל), ישירות תמונה אחרות fluorophores של הכתב Cre הקשת (Cerulean: 433-nm עירור מקסימום, 475-nm פליטה מקסימום; מורנג: 548 nm, 562 ננומטר; mCherry: 587 nm, 610 nm).
      1. שימוש הבאות מסננים לגילוי fluorophores עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקופה: דאפי (עירור מקס/רוחב פס 350/50 ננומטר, פליטה מקס/הגבלות 460/50 ננומטר), Cerulean (עירור 436/20 ננומטר, פליטה 480/40 ננומטר), טקסס אדום (עירור 560 / 40 ננומטר, פליטה 630/75 ננומטר), מסנן מותאם אישית כדי להפריד בין mCherry לבין מורנג (עירור 577/10 ננומטר, פליטה 630/50 ננומטר).
    2. למיפוי גורל עם הכתב Cre ' mTmG ', לזהות GFP (484 nm, 510 ננומטר), על-ידי הדמיה ישירות או באמצעות immunostaining. עבור הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף להשתמש במסנן ה-GFP (עירור 470/40 ננומטר, פליטה 525/50 ננומטר).
    3. עבור immunostaining, דגירה מקטעים עם נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C, לשטוף עם 0.1% X-100 Triton ב- PBS, ואז דגירה עם נוגדנים משניים עבור ה 1 השתמש אנטי-CD31 (ריכוז סופי 0.0016 מ"ג/מ"ל), אנטי-GFP (0.006 mg/mL), Cy3-נוגדנים ראשי ישירות מצומדת אנטי-SMA (דילול שבערך הסופי), שימוש משני antibodies מצומדת ישירות אל fluorophores (דילול הסופי שבערך) (ראה את הטבלה של חומרים).
  17. תמונות שקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף (הגדלה: 4 X - 20 X) או מיקרוסקופ קונפוקלי (10 X-63 X). בהגדלה, להשתמש 63 הדמיה קונאפוקלית x המטרה שמן עם הפתח המספרי של 1.4-0.6, גודל מסגרת של 1,024 x 1,024 פיקסלים.

2. Explant תרבות העורקים עובריים

הערה: גישה זו שימשה בעבר כדי להעריך את התפקיד של אינטגרין beta3, היצרות של explanted Eln (- / -.) אב העורקים עובריים 9 , 18.

  1. המתת חסד סכר מתוזמן-בהריון בשעה E15.5 על ידי שאיפת עודף איזופלוריין, לפי שלב 1.8, מעל.
  2. קציר, המתת חסד את העוברים, לפי שלבים 1.9-1.10, מעל.
  3. למקם את העובר supinely ולהדק את הגפיים המורחבת ללוח לנתיחה. דמיין את זה יחד סטריאוסקופ לנתיחה, להשתמש במספריים לחתוך חתך אנכי של הבטן דרך עצם החזה לבית החזה העליון. לנתח משם התימוס, קנה הנשימה, הריאות, הוושט, הכבד, המעי.
  4. בעדינות משוך הלב. ventrally באמצעות מלקחיים, להשתמש במספריים לנתח העורקים מן ההיבט הגבי של חללים בית החזה והבטן. לשחרור העורקים, תחתוך אותו בהשורש הפרוקסימלית ואת העמדות בטן דיסטלי.
  5. מקום העורקים PBS קר כקרח סטרילי בשכונה התרבות תאים. להעביר את אבי העורקים צלחת 24-ובכן, תרבות זה ב DMEM עם 0.5% FBS עבור עד 24 שעות-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: המדיום התרבות ניתן להשלים עם נוגדן של חסימה (למשל, אנטי-אינטגרין נוגדן αvβ3 0.02 נקודות מ"ג/מ"ל 9; ראה הטבלה של חומרים) או סוכן תרופתי.
  6. לשטוף את העורקים פעמיים עם PBS ולתקן אותה עם 4% paraformaldehyde עבור 20 דקות לאחר מכן
  7. שטיפת שלוש פעמים עם PBS, העברה אבי העורקים אל צינור 1.5-mL עם 30% סוכרוז ב- PBS. אחרי אבי העורקים כיורים, להפוך גושי רקמה קפוא, מקטעים חתוכים ו- immunostain, כמתואר בצעדים 1.13-1.15, מעל.

3. התקן SMC בידוד מן העורקים הלידה

הערה: גישה זו נמצא בשימוש כעת כדי להשוות בין הביולוגיה של אבי העורקים SMCs מבודד עכברים הלידה Eln (- / -.), wildtype.

  1. Euthanize מאתר כלבלב ביום כמחנכת (P) 0.5, נקע בצוואר הרחם או באמצעות עריפת ראש עם מספריים כירורגיים או סכין חדה, כפי שמתואר בשלב 1.10, מעל.
  2. בצע שלב 2.3, ואז, לאחר פתיחת את החזה והבטן, לנקב השמאלי עם המחט 23 גרם. צינורות פלסטיק לשימוש להתחבר המחט מזרק המכיל PBS סטרילי מוחזק אנכית במיקום מוגבה כך PBS זורם לתוך החדר השמאלי על ידי הכבידה. לאפשר אינפוזיה של PBS סטרילי לתוך החדר השמאלי עד blanches הכבד.
    1. להשתמש מלקחיים כדי להסיר את הרקמה adventitial בצד החיצוני של אבי העורקים ומנתחים העורקים כפי שמתואר בשלב 2.4.
  3. לעכל העורקים ב פתרון יחיד של DMEM (500 µL) בתוספת 225 collagenase U/mL, 2.25 elastase U/mL, ואנטיביוטיקה-antimycotic למשך 45 דקות ב- 37 ° ג ידנית טלטול 1 x הצינור מינימלית בכל 5-10
  4. בשכונה תא סטרילי תרבות, titurate הרקמה מתעכל על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה 200-µL כדי ליצור השעיה תא בודד. התליה תא בודד להעביר צינור 15-mL, להוסיף 2 מ של DMEM ו צנטריפוגה-g 920 x עבור 5 דקות-25 מעלות צלזיוס
  5. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של SMC תרבות בינוני (DMEM המכיל 10% FBS בתוספת 1 µg/mL rhFGF, rhEGF µg 10/mL, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין ו 2.5 µg/mL המפוטריצין). להעביר את צלחת תרבות 35 מ מ.
    הערה: על בידוד הראשונית, תאים ~ 400,000 מתקבלים מן העורקים wildtype P0.5 יחיד; ~ 300,000 של תאים אלה נמצאים SMCs.
  6. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס ושנה לבינונית תרבות SMC טריים כל 3 ימים. באמצעות טכניקות סטנדרטי עם טריפסין, המעבר את התאים בעת confluent. לניסויים, להשתמש בתאים של פסוקים 3-7-

4. עכברים השמתם משאבת מיני Osmotic בהריון (או Non-בהריון) תת עורית

הערה: גישה זו שימשה בעבר להעביר ברציפות סוכן תרופתי (למשל, אינטגרין β3 וβ5 מעכב cilengitide) העוברים ברחם 9. המשאבה היה מוכנס בתוך הסכר בהריון-E13.5, נשמר עד parturition.

  1. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין 2-5% חמצן (קצב הזרימה של 1 ליטר/דקה) אינדוקציה ו 1-3% לצורך תחזוקה. להשתמש את רפלקס הבוהן-קמצוץ כדי לנטר את רמת ההרדמה, והתאם את הסוכן הרדמה כנדרש. לנהל הבופרנורפין תת עורית (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג) על שיכוך כאבים.
  2. לגלח את הגב התחתון עם מספריים. השתמש תחבושות חיטוי, כפפות, מכשירים ולשמור על העכברים על מגש כירורגי חימום במהלך הניתוח.
  3. למקם את כל העכבר במיקום נוטה ותשרוט מאחור עם betadine ואחריו איזופרופיל אלכוהול. כ 3-5 ס מ rostral אל בסיס הזנב בגב התחתון, השתמש אזמל לעשות חתך אופקי העור 0.5 - 1.0 ס מ אורך מבלי לפצוע את השריר שמתחת.
  4. הכנס עוצר דימום לתוך החתך וליצור כיס תת עורית rostrally להשתלה המשאבה על ידי פתיחה וסגירה של הלסתות עוצר דימום-
  5. למלא משאבת מיני osmotic עם הסוכן של בחירה, לפי היצרן ' s הנחיות (ראה את הטבלה של חומרים). הוסף את המשאבה מילוי לתוך הכיס וסגור את החתך עם קליפים או תפרים נספגים 6-0. ודא כי הזמן כירורגי הכולל פחות מ 10 דקות
  6. וכאב לאחר הניתוח, לפקח על העכברים כל 15 דקות עד שהם התאוששו מן recumbency בחזה ובצלעות. לנהל הבופרנורפין תת עורית (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג) כל 6-12 h במשך 48 שעות. כאשר העכברים יש החלימו לחלוטין מן ההרדמה הכללית, לנטר אותם מדי יום. הסר את הקליפים או התפרים 7-10 ימים לאחר הניתוח-

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניתוח נציג המשובטים של SMCs ב עוברים מוטציה עבור Eln (הגן קידוד אלסטין חלבון של מטריצה חוץ-תאית), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 עכברים היו הזדווגו to Eln(+ /-) עכברים נושאת גם צבע רב ROSA26R(Rb/Rb) כתב. כפי שמתואר בשלב 1, תקעים שנבדקו, סכרים בהריון היו המושרה עם זריקה בודדת טמוקסיפן (1.5 מ ג)-E12.5, הם הוקרבו ב E18.5. העוברים היו שנקטפו, קבוע, קפואה ו genotyped. רוחבי יורד cryosections אבי העורקים נחתכו קטעים מתוך El...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניגוד חקירה מקיפה של העורקים מאתר ואת סניפיה הגדולים במצבים פתולוגיים למבוגרים, כגון מודלים של טרשת עורקים, פחות ידוע לגבי את מורפוגנזה בפתוגנזה של העורקים של הלידה. כאן, אנו מתמקדים העורקים עובריים/הלידה, במיוחד SMCs, ולספק פרוטוקולים ללמוד העורקים באמצעות ויוו, רקמת explant, ואת הגישות SMC בידוד. גישות אלה ללא תשלום לספק החוקר עם גישות מגוונות ללמוד העורקים עובריים/הלידה.

ניתוח המשובטים היא גישה רב עוצמה המאפשר אחד כדי לחקור את אופן הפעולה של תאים בודדים. לאחרונה השתמשנו בגישה זו כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים דין Li על שיתוף הפרוטוקול של המעבדה שלו לבידוד SMC אבי העורקים. תמיכה במימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R21NS088854, R01HL125815, R01HL133016 אל D.M.G), איגוד הלב האמריקני (מענק הסיוע 14GRNT19990019 כדי D.M.G.), ואת אוניברסיטת ייל (מלגת בראון-Coxe כדי לפנות בוקר וההרצה כספים D.M.G.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טמוקסיפןסיגמאT5648
שמן תירססיגמאC-8267רכב לטמוקסיפן
4-OH-טמוקסיפןסיגמאH7904מטבוליט פעיל של טמוקסיפן
פרוגסטרוןסיגמאP8783-5Gהשתמש במחצית הריכוז של תרכובת טמוקסיפן
OCTרקמת סאקורה טק4583להכנת קריובלוקים
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542צביעת IHC של גרעין, ריכוז סופי 5 מ"ג/מ"ל
Cy3 נוגדן אנטי-SMA מצומד ישירותSigmaA2547IHC צביעה של SMA, דילול סופי 1:500
נוגדן Anti-CD31BD Pharmingen550274צביעת IHC של GFP, ריכוז סופי 0.006 מ"ג/מ"ל
נוגדן נגד GFPThermo Fisher ScientificA-11121צביעת IHC של CD31, ריכוז סופי 0.0016 מ"ג/מ"ל
נוגדן משני נגד ארנב עזים, Alexa 647Life Technologiesa21244צביעת IHC, ריכוז סופי 0.004 מ"ג/מ"ל
נוגדן משני נגד ארנב, Alexa 488Life Technologiesa11008צביעת IHC, ריכוז סופי 0.004 מ"ג/מ"ל
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014לתרבית תאים
FBSThermo Fisher Scientific10437028
נוגדן חוסם אנטי-אינטגרין beta3 BDBiosciences553343Clone 2C9. G2, ריכוז סופי 0.02 מ"ג/מ"ל
קולגנאזוורת'ינגטון ביוכימיה קורפ44H14977Aלעיכול אבי העורקים
אלסטאזוורת'ינגטון ביוכימיה קורפ34K15139לעיכול אבי העורקים
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100X)ThermoFisher Scientific15240062
רקומביננטי אנושי FGFPromegaG5071
רקומביננטי EGF אנושיPromegaG5021
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)תרמו פישר 15140122
מדעי אמפוטריצין Bתרמו פישר Scientific15290026
צלחות תרבית רקמותקורנינגCLS430165
Alzet מיני משאבה אוסמוטיתDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i זקוף מיקרוסקופ פלואורסצנטיניקון 
  TCS  SP5Leica
Branson סוניפייר 450עכברי VWR
Myh11-CreERT2מעבדת ג'קסון 19079
Acta2-CreERT2הושג ממעבדתם של ד"ר פייר שמבון ודניאל מצגר
עכברי ROSA26R-CreERT2מעבדת ג'קסון 8463
עכברי ROSA26R(mTmG/mTmG)מעבדת ג'קסון  
עכברי ROSA26R(EYFP/EYFP)מעבדת ג'קסון   006148 
ROSA26R(קונפטי/קונפטי) עכבריםמעבדת ג'קסון 13731
עכברי ROSA26R(Rb/Rb)של ד"ר אירו ויסמןהתקבל ממעבדתו של ד"ר אירו ויסמן
עכברי 026862מעבדת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810(2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4(2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo

מאמרים קשורים