מאמר שיטה

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

DOI:

10.3791/56063

⸱

9 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור התנהגויות הסלולר בזמן אמת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של קליפת המוח ראשי תאים המאפשרת בדיקה מקיפה של השלבים שחוקקו במהלך ההתקדמות שושלת היוחסין מתאי גזע עצביים העיקרי נוירונים הבדיל, עכשיו, דונלד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך התפתחות קליפת המוח, ובתאים עוברים כמה סבבים של חלוקות תאים סימטרי, אסימטרית כדי ליצור אבות חדש או נוירונים postmitotic. מאוחר יותר, כמה אבות לעבור גורל gliogenic, הוספת אסטרוציט ו אוליגודנדרוציטים האוכלוסיות. באמצעות זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של תרביות תאים קליפת המוח הראשי, זה אפשרי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית שליטה המצב של חלוקת התא ועל מחזור התא בפרמטרים של ובתאים. באופן דומה, אפשר לבחון את גורלו של תאים postmitotic באמצעות חלבונים כתב פלואורסצנט תאים ספציפיים או פוסט-הדמיה immunocytochemistry. חשוב מכך, ניתן לנתח כל התכונות הללו ברמה תא בודד, המאפשר זיהוי אבות מחויבת הדור של סוגי תאים ספציפיים. ניתן לבצע מניפולציה של ביטוי גנים גם באמצעות תקנים ויראלי בתיווך, המאפשר חקר תופעות תא-אוטונומי, ללא-תא-אוטונומי. לבסוף, השימוש של חלבונים פלורסנט פיוז'ן מאפשר חקר סימטרי אסימטרי והפצה של חלבונים הנבחר במהלך החטיבה, המתאם עם גורל תאי הבת. כאן, אנו מתארים את שיטת מיקרוסקופיה-וידאו זמן לשגות תמונה תאים מאתר קליפת המוח הראשי עבור ועד מספר ימים ולנתח את המצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, גורלו של תאים החדש שנוצר. אנו גם מתארים שיטה פשוטה כדי transfect ובתאים, אשר יכול להיות מיושם כדי לתפעל את הגנים של עניין או פשוט לשים תווית תאים עם הכתב חלבונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע עצביים (המל ל) ליצור נוירונים ותאי macroglial במהלך התפתחות קליפת המוח. בשעה מוקדמת-corticogenesis, NSCs עוברים כמה סבבים של חלוקת התא סימטרי, להרחיב את המאגר קדמון. לאחר מכן, NSCs לחלק בצורה א-סימטרית כדי ליצור נוירונים במישרין או בעקיפין דרך ביניים1. רק באמצע - עד מאוחר-corticogenesis, אבות מעבר להפקת האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים2,3,4. עם זאת, המנגנון מלאה לשלוט התפשטות תאים, בידול, כמו גם את התרומה של אבות מוגבלת גורל לדור של סוגים ייחודיים של נוירונים או תאים macroglial נשארים עניין של ויכוח אינטנסיבי-4,-5,-6. הפוטנציאל של הפרט NSCs בקליפת המוח לייצר נוירונים, האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים כבר למדה בהרחבה במבחנה וב ויוו באמצעות מספר עצום של טכניקות כגון: לחיות הדמיה תא בודד תרבויות7,8,9,10,11,12,13; חיים הדמיה תרבויות בצפיפות גבוהה תרבויות3,14,15; חיים הדמיה פרוסה תרבויות16,17,18; ניתוח המשובטים באמצעות ויראלי בתיווך וקטור גנטי תיוג תרבויות בצפיפות גבוהה14,15,19,20,21; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות הרטרווירוס22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות בעלי חיים הטרנסגניים34.

כל אחת מהטכניקות הללו מציג יתרונות וחסרונות. למשל, אין ויוו שושלת היוחסין עקיבה חשופה מכלילה, פיצול שגיאות3, המוביל למסקנות סותרות לגבי הפוטנציאל של אבות קורטיקלית בודדים. יתר על כן, שני חוץ גופית בתוך ויוו מחקרים בהתבסס על תיוג של ובתאים בנקודות זמן מוקדמת, ניתוח האחורי של תא שושלות עלול להיות מושפע המופע להתגלות של מוות של תאים במהלך שושלת היוחסין-התקדמות35. לכן, מערכת מתאימה כדי לנתח את הפוטנציאל של NSCs יחיד לאפשר הזיהוי של כל התאים שנוצר, כמו גם אפיון תא הגורלות בתוך שושלת היוחסין המתאים. שילוב של תרבות התא העיקרי הדמיה חיה מספק הגדרה זו. באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות והתרבות של תא בודד, מקדש. et al. הראו את המתג בשושלת של קליפת המוח בודדים אבות מ נוירוג'נסיס gliogenesis11. מאוחר יותר, הם השתמשו באותה המערכת כדי להראות כי סוגים שונים של נוירונים נוצרות יחיד קדמון קורטיקלית12. עם זאת, מערכת זו מציג של הקונה חשוב: רק 1% של אבות בקליפת המוח מבודדים-corticogenesis מוקדם ליצור שיבוטים של רומא של 4 או יותר-9. לאחר התוספת של FGF2, מגדילה את התדירות של תאים ליצירת תאים 4 או יותר ל- 8-10%9. למרות זאת, מספר זה הוא קטן מדי בהתחשב כי כמעט כל אבות קורטיקלית proliferative בשלב זה. יתר על כן, השפעת פוטנציאל FGF2 על גורל-מפרט שלא ניתן לשלול36. כדי לעקוף את המגבלות האלה, השתמשנו תרביות תאים בצפיפות גבוהה התומכים ההתפשטות של שניהם חדרית (לבטא Pax6) ו subventricular (ביטוי Tbr2) אבות קורטיקלית15. יתר על כן, התצפית בזמן אמת של תרבויות אלה הראו כי מספר תכונות של המועצה לבטחון לאומי שושלת היוחסין התקדמות משוחזרות בתנאים אלה, כגון מצב של חלוקת התא, הארכה של מחזור התא, הפוטנציאל של תאים בודדים ליצירת נוירונים, עכשיו, דונלד, בין היתר3,15. לאחרונה, גם השתמשנו מערכת זו כדי להראות כי איתות CREB משפיע על ההישרדות תא של קליפת המוח ילדותי נוירונים בעכברים37. כך, אנו מאמינים כי מיקרוסקופיה-וידאו בצילום מואץ של קליפת מאתר ראשי תאים גדל בצפיפות גבוהה הוא כלי רב עוצמה ונגיש לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית של מחזור התא התקדמות, מצב של חלוקת התא, התא הישרדות מפרט הגורל התא. האחרון יכול להתבצע באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר זיהוי תאים מסוים הגורלות בזמן אמת-38,-39,-40 או השימוש של פוסט-הדמיה immunocytochemistry3,38,41,42.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד להכנת ראשי קליפת תרבית תאים תומכים התפשטות NSCs הדור הבא של נוירונים ותאי macroglial. נדון גם את השימוש של retroviral בתיווך תרביות תאים לתמרן ביטוי גנים של תאים בודדים, אשר ניתן לזהות מעקב ברמה תא בודד באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד קליפת המוח ראשי תאים מבודדים מההתחלה לסוף corticogenesis של מכרסמים, אך כמה התאמות העשויים להידרש, בהתאם שלב14. NSCs מבודד ממקורות אחרים שניתן גם ללמוד באמצעות מיקרוסקופ וידאו בצילום מואץ של תרבויות 2D, אבל במערכת culturing המתאימה צריך להיקבע על-ידי השוואת תא התנהגויות במבחנה , ויוו38,43.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה נערכים על פי החוקים הלאומיים והבינלאומיים ואושרו על ידי הוועדה האוניברסיטאית המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (CEUA/UFRN), תחת רישיון 009/2014. הפרוטוקול הבא מבוצע בסביבה סטרילית. צפויה היכרות עם תרבית תאים בסיסית.

1. מיקרודיסקציה טלנצפלונית דורסולטרלית

  1. הכן את מדיום החיתוך (100 מ"ל): 98.5 מ"ל תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), 0.5 מ"ל 5 מ"ל HEPES pH 7.4, 1 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל).
  2. מסנן לעקר את מדיום הדיסקציה.
  3. הסר עוברים ביום 14 (E14) מעכבר בהריון C57/Bl6 (Mus musculus) בהרדמה עם איזופלורן.
    הערה: קחו בחשבון את E0 כיום זיהוי הפקק בנרתיק. יש להשלים את הדיסקציה לא יאוחר משעה לאחר הוצאתו מהעכבר ההרה. פרוטוקול זה חל גם על עוברים E11-E17.
  4. הסר את העוברים על ידי כריתת רחם בתנאים סטריליים.
  5. מעבירים את העוברים לצלחת פטרי עם מדיום חיתוך קר (4 מעלות צלזיוס).
  6. הסר את המוח מהגולגולת על ידי חיתוך לאורך הסדק האורכי. מספר העוברים נע בדרך כלל בין חמישה לעשרה. כל מוח E14 מניב כ-2 x 106 תאים, כולל אבות ונוירונים פוסט-מיטוטיים (יחס של 1:1)
    הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ עבור השלבים הבאים.
  7. הסר את קרומי המוח באמצעות מלקחיים לדיסקציה. פצל את הטלנצפלון באמצע כדי להפריד בין חצאי הכדור. כדי לבודד את הטלנצפלון הדורסולטרלי, חתוך לאורך העקומה הגבית והגבול הפליאלי-תת-פליאלי באמצעות מלקחיים דיסקציה. העבירו את הטלנצפלון הגבי לצינור של 2 מ"ל עם מדיום דיסקציה קרה (4 מעלות צלזיוס) עד שכל המוחות מנותחים.

2. דיסוציאציה וציפוי תאים

  1. הכן את מדיום הריבוי (50 מ"ל DMEM+10% FCS): 44 מ"ל Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM), 5 מ"ל סרום עגל עוברי (FCS), 0.5 מ"ל 40% גלוקוז, 0.5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל). עיקור מסנן את אמצעי ההתפשטות.
  2. הכן מדיום בידול (50 מ"ל DMEM + 2% B27): 48 מ"ל DMEM, 1 מ"ל B27, 0.5 מ"ל 40% גלוקוז, 0.5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל). עיקור מסנן את מדיום ההתמיינות.
  3. לאחר מיקרו-דיסקציה של הטלנצפלון הדורסולטרלי מעכברי E14, צנטריפוגה את הצינור עם הרקמה שנאספה ומדיום הדיסקציה הקרה (למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, 340 x גרם) כדי לזרז את הרקמה.
  4. הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה והוסף 1 מ"ל טריפסין-EDTA מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) (0.05%) לעיכול כימי. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 2 מ"ל של מדיום התפשטות כדי לעצור את פעילות הטריפסין.
  5. יש ללטש את קצה פיפטת פסטר מזכוכית מעל מבער גז או מבער בונסן למשך מספר שניות כדי לצמצם מעט את הצמצם. שטפו את הפיפטה על ידי שאיבת FCS לציפוי הקצה. הימנע מבועות, נתק מכנית את התאים עם פיפטה פסטר מלוטשת אש ומצופה FCS.
  6. צנטריפוגה של התאים (למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 340 x גרם). הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה. הוסף 1 מ"ל של מדיום התפשטות והשהה מחדש את התאים באמצעות פיפטה. חזור על שלב זה פעם אחת.
  7. הכן דילול של 1:1 של תרחיף התאים באמצעות תמיסת טריפן כחול של 0.4%. תאים שאינם ברי קיימא יהיו כחולים. ספרו את מספר התאים ברי קיימא (לא מוכתמים) באמצעות תא נויבאואר.
  8. לדלל את התאים במדיום התפשטות כדי לקבל 106 תאים/מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר של צלחת תרבית רקמות של 24 בארות (כ -2.5 × 105 תאים / ס"מ2). דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    הערה: אל תשתמש בכיסויי זכוכית, מכיוון שהם יכולים לנוע במהלך הניסוי ולשנות את שדה התצפית. לחלופין, השתמש בצלחות תרבית רקמות תחתונות מזכוכית.
    הערה: אם אינך משתמש בריבוי מנות שטופלו בתרבית תאים, חשוב לטפל מראש בצלחות שלך בפולי-D-ליזין (50 מיקרוגרם/מ"ל) שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן צלחות שטופלו ב-PDL ב-4 מעלות צלזיוס לאחר שטיפה במים מזוקקים.

3. טרנספקציה בתיווך רטרו-ויראלי

הערה: זוהי שיטה פשוטה להעביר רק תאי אב. עם זאת, ניתן להשתמש בווקטורים נגיפיים אחרים או בטרנספקציה כימית/חשמלית כדי להחדיר גנים מעניינים לתאים מתורבתים.

  1. כדי לתפעל את ביטוי הגנים ולתייג תאים עם חלבונים מדווחים פלואורסצנטיים, הוסף רטרו-וירוסים הנושאים פלסמידים עם גנים מעניינים שעתיים לאחר ציפוי התא.
    הערה: וקטורים רטרו-ויראליים משתלבים רק בגנום של תאים מתחלקים. לכן, חשוב להדביק תאים כאשר הריבוי גבוה.
    הערה: השתמשנו בפלסמיד המכיל את רצף ההיתוך של בטא-אקטין/CMV (CAG) ואתר כניסה ריבוזומלי פנימי (IRES) ואחריו רצף הקידוד של החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP), המיועד pCAG-IRES-GFP44. ניתן לשכפל גנים מעניינים בין מקדם ה-CAG לרצף IRES37.
  2. לדלל את הרטרו-וירוס במדיום התמיינות כדי להשיג את המספר הרצוי של חלקיקים למ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות עם רטרו-וירוס לכל באר.
    הערה: כמות הרטרו-וירוסים בשימוש תלויה בטיטר שלה ויש לחשב אותה כדי להשיג 50 עד 100 תאים נגועים בכל באר. טיטר זה מאפשר זיהוי של שיבוטים מבודדים המבטאים GFP, שניתן לאשר את הקשר ביניהם על ידי מעקב אחר תמונות ניגודיות פאזה (ראה סעיף 6). יש לבצע טיטרציה של רטרו-וירוס באמצעות אותה אוכלוסיית תאים45.

4. מיקרוסקופ וידאו בהילוך מהיר

הערה: שלב זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם תא דגירה (ראה טבלת חומרים).

  1. לאחר ההדבקה ברטרו-וירוס, הנח את לוחית תרבית הרקמה באינקובטור המחובר לבקרי טמפרטורה ו-CO2.
    הערה: חימום מוקדם של החדר למשך 3 שעות לפני תחילת ההדמיה יכול לעזור למזער את הסחיפה וחוסר המיקוד במהלך הרכישה.
    הערה: החדר צריך לשמור על התאים בתנאים קבועים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  2. בחר מיקום בציר XY שישמש כנקודת אפס (XY = 0). זה יאפשר הפניה למצוא את המיקומים שוב בעתיד, למשל לאחר אימונוציטוכימיה לאחר הדמיה (ראה סעיף 5).
    הערה: רצוי לצייר שלט בצלחת שיכול לשמש כהתייחסות לקביעת נקודת האפס.
  3. בחר את המיקומים לתמונה בהגדלה של פי 10.
    הערה: בחר 10-15 מיקומים לכל באר כדי להגדיל את הסבירות לצפות בתאים שעברו טרנספטציה רטרו-ויראלית.
    הערה: ניתן להשתמש ביעדי הגדלה גבוהים למרחקים ארוכים (20X או 40X) כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה יותר. בהתאם למרחק העבודה של היעדים, ייתכן שיידרשו לוחות תחתית זכוכית.
  4. רכוש תמונות ניגודיות פאזה כל 5 דקות ותמונות פלואורסצנטיות כל 3 שעות כדי להפחית את הפוטוטוקסיות. בדוק והתאם את המיקוד ב-3 השעות הראשונות של הניסוי, מכיוון שהוא עשוי להשתנות בזמן שהטמפרטורה מתאזנת. בדוק והתאם את המיקוד מדי יום.
    הערה: אנו רואים שהפוקוס הופך יציב לאחר 24 השעות הראשונות. עם זאת, רצוי לעקוב אחר המיקוד. לחלופין, השתמש במערכת פוקוס אוטומטי מבוססת תוכנה.
  5. לאחר 7 ימים, הפסק את הרכישה והמשך לאימונוציטוכימיה לאחר הדמיה (ראה סעיף 5).
  6. לאחר אימונוציטוכימיה, החלף את הצלחת בחממת המיקרוסקופ, מצא את נקודת האפס, אפס XYZ = 0 וטען מחדש את הניסוי במיקומים שמורים. רכוש את תמונות הקרינה של כל עמדה באמצעות מסנני פלואורסצנציה מתאימים.

5. אימונוציטוכימיה לאחר הדמיה

  1. לאחר 7 ימים בתרבית, יש לתקן את תרבית התאים עם קיבוע 4% Paraformaldehyde (PFA) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר><. זהירות: PFA רעיל ויש לטפל בו במכסה אדים כימי.
  2. יש לשטוף עם 0.5 מ"ל PBS 0.1 מ' למשך 5 דקות.
  3. דגירה בנוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס ב-0.5% טריטון ו-10% מסרום עיזים רגיל ב-PBS 0.1 M.
    הערה: השתמש בנוגדני חלבון 2 (MAP2) נגד מיקרו-צינוריות כדי לאשר את הפנוטיפ העצבי (IgG1 של עכבר, 1:1,000) ואנטי-GFP כדי לתייג את התאים המומרים (נוגדן עוף, 1:500). ניתן להשתמש בנוגדנים אחרים לאיתור תאי אב או גליה.
  4. יש לשטוף עם 0.5 מ"ל PBS 0.1 מ' למשך 5 דקות.
  5. לדלל נוגדנים משניים ב-0.5% טריטון ו-10% מסרום עיזים רגיל ב-PBS 0.1 M ולדגור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. דילול מומלץ: 1:1,000.
  6. יש לשטוף עם 0.5 מ"ל PBS 0.1 מ' למשך 5 דקות.
  7. לצביעת גרעינים, דגרו את התאים למשך 5 דקות עם 0.1 מיקרוגרם/מ"ל 4′6′-diamino-2-phenylindone (DAPI) ב-PBS 0.1 M.
  8. יש לשטוף עם 0.5 מ"ל PBS 0.1 מ' למשך 5 דקות.
  9. שמור את התאים ב-PBS 0.1 מ' והגן מפני אור (למשל, עטוף את הצלחת בנייר כסף).

6. מעקב אחר תאים

הערה: כאן, אנו מתארים בקצרה את השלבים העיקריים לניתוח נתוני מיקרוסקופ וידאו בהילוך מהיר באמצעות התוכנה The Tracking Tool (tTt), הזמינה בקישור המופיע בטבלת החומרים.

הערה: אם רכישת התמונה מתבצעת באמצעות תוכנה אחרת, ייבא את נתוני התמונה באמצעות ממיר tTt הזמין במתקין tTt (הקישור מופיע בטבלת החומרים). רק פורמטים של תמונות png, tif או jpg מתקבלים. בצע את השלבים המוצגים ב- איור 1 A - B לאחר הפעלת ממיר tTt.

  1. הפעל את התוכנה tTt ובחר שם משתמש. לחץ על כפתור "הוסף משתמש" ו"המשך" (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2A). דפדף ובחר את "TTTWorkFolder" (איור 2B). עצי שושלות, סטטיסטיקות ותמונות מיוצאות יישמרו בתיקייה זו. לאחר מכן, בחרו את הניסוי לניתוח וטענו אותו (איור 2B).
  2. אם התמונות הומרו בעבר על ידי tTt Converter, לחץ על "LogFileConverter" (איור 3A) וציין את מספר השניות בין שתי נקודות זמן רצופות בחלון LogFileConverter. לחץ על "המרת קבצי יומן עבור כל הניסוי" (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1C).
  3. ברשימת התמונות, המופיעות בחלון tTt, בחר את התמונות הרצויות על ידי טעינה ידנית או באמצעות האפשרות המוצגת בתוכנית. טען תמונות (איור 3).
  4. בחר קובץ > פתח > מושבה חדשה. לחץ על "מעקב", ולאחר מכן על "התחל מעקב" כדי להתחיל את המעקב במיקום שנבחר.
  5. יופיע חלון סרט (איור 4). בחר את התא באמצעות עיגול המעקב והקש על המקש 0. התוכנה תעבור למסגרת הבאה. המשך למקם את מעגל המעקב סביב התא הנמצא במעקב באמצעות העכבר ולחץ על 0 בכל מסגרת כדי להוסיף סימן מעקב על התא.
  6. השתמש במקשים 1 ו- 3 כדי לעבור למסגרת הקודמת או הבאה, בהתאמה. כדי למחוק סימן מסלול, פשוט לחץ על המיקום הנכון לסימון ולחץ על 0.
  7. אם התא מחולק, בחרו בכפתור "חלוקה" (מלבן אדום ב-איור 4). המשך לעקוב אחר תא בת אחד על-ידי הקשה על Shift+D. כדי לעקוב אחר תא הבת השני, בחר אותו בעורך התאים והקש F2.
  8. אם התא מת במהלך מיקרוסקופ הווידאו, בחרו "אפופטוזיס" (מלבן כחול ב-איור 4).
    הערה: למרות שהתוכנה מתייגת את האירוע כ"אפופטוזיס", מנגנונים אחרים עשויים להיות אחראים למוות התאי.
  9. אם התא עוזב את שדה התצפית או מתערבב עם תאים שכנים שמונע מעקב, בחרו "אבוד" (מלבן ירוק ב-איור 4).
  10. כדי להפסיק לעקוב ולהמשיך מאוחר יותר לחץ על "הפסקה" (מלבן סגול ב-איור 4).
    הערה: בחלון עורך התאים ייווצר עץ במהלך המעקב. כדי לשמור את עץ השושלת, בחר קובץ > שמור > עץ נוכחי (בחלון עורך התאים).
  11. כדי להתחיל לעקוב אחר תא אחר, לחץ על התא באמצעות לחצן העכבר הימני או בחר את התא באמצעות לחצן העכבר השמאלי ולחץ על מעקב > התחל מעקב.
  12. כדי לייצא את הסרט עם נתוני המעקב, התוכנה לא צריכה להיות ב"מצב מעקב". כדי לכבות את מצב המעקב, בצע את שלב 6.10. בחלון Movie בחר Export > Movie. הגדר את הפורמט, טווח המסגרות, מספר הפריימים לשנייה וקצב הסיביות. לחץ על "התחל ייצוא".

7. כימות

הערה: ניתן לבצע מספר מדידות באמצעות נתוני מיקרוסקופ וידאו46. כאן, אנו מתארים שלוש אפשרויות המודגמות בהמשך הסעיף "תוצאות מייצגות".

  1. כמת את הישרדות התאים עבור כל שושלת תאים על ידי חלוקת מספר התאים החיים בנקודות זמן שונות במספר הכולל של תאים שנוצרו לפני שהגיעו לנקודות זמן אלה בתוך שיבוטים בודדים37.
  2. כמת את הפרופורציה של אב סימטרי (SP, שני תאי הבת ממשיכים להתרבות), אסימטרי (A, תא בת אחד ממשיך להתרבות והשני הופך לפוסט-מיטוטי), או מסוף סימטרי (ST, שני תאי הבת הופכים לפוסט-מיטוטיים)15,38.
  3. מדוד את אורך מחזור התא על ידי חישוב טווח הזמן של תאים מתרבים בין היווצרותם לחלוקה15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרביות ראשוניות של תאי קליפת המוח שבודדו מעוברים E14 מכילות גם תאי אב וגם תאים עצביים. במהלך תקופת ההדמיה, אבות עוברים כמה סבבים של חלוקת תאים, מה שמגדיל את מספר התאים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5 ואיור וידאו 1).

טרנספקציה בתיווך רטרו-ויראלי של כמה תאי אב מקלה על זיהוי שיבוטי תאים (איור 6). שים לב שביטוי GFP ניתן לזיהוי לאחר 24 שעות. בנקודת זמן זו, ניתן לזהות תאים המבטאים GFP ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תצפית בזמן אמת של קליפת המוח ראשי תאים מאפשרת הניתוח של התפשטות תאים, מצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, תאית התמיינות תאים הישרדות3,14,15,37. חשוב מכך, הוא מאפשר חקר שושלות מתא בודד, שמוביל הזיהוי של שלבי ביניים שחוקקו במהלך ההתקדמות של NSCs נוירונים3. לבסוף, השילוב של מערכת זו תרבות עם כלים בביו-הנדסה לתמרן ביטוי גנים היא טכניקה חזקה כדי לחקור את השפעת יעדים נבחרים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי CNPq (Conselho נאסיונאל דה Desenvolvimento אזור e Tecnológico), שכמיות (Coordenação דה Aperfeiçoamento דה Pessoal דה Nível מעולה), FAPERN (Fundação de אמפרו עושה Pesquisa ריו גרנדה דו נורטה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESסיגמא-אולדריץ'H3375-25G
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco12400-024
סרום עגל עוברי (FCS)Gibco10437028
גלוקוזגיבקוA2494001
B27ג'יבקו17504044
טריפסין-EDTA (0.05%)גיבקו25300054
פרפורמלדהידסיגמא16005
סרום עיזיםסיגמא-אולדריץ'69023
טריטון X-100VWR אינטרנשיונל בע"מ306324N
IsofluraneSigma792632
אנטי-MAP2, עכברSigmaM4403
אנטי-GFP עוףAves0511FP12
DAPISigmaD9542
עז נגד עכבר alexa 594InvitrogenA11005
עיזים נגד עוף אלקסה 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH ציריך
תא משקיף מיקרוסקופZeiss
פסטר פיפטה
PBS
הכלי מעקב (tTt) תוכנהhttps://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.htmlקישור להורדה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time lapse

מאמרים קשורים