הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

James S. Byers; Daniel F. Jarosz

doi:10.3791/56069

Method Article

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

James S. Byers¹ , Daniel F. Jarosz¹^,²

¹Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, ²Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קידוד מידע ביולוגי שנגיש לדורות מושגת בדרך כלל באמצעות שינויים רצף הדנ א. ירושה מאריכים מקודד חלבון קונפורמציה (במקום רצף) שהוצג זמן הפרדיגמה-shifting אבל נדיר. הדוגמאות מאופיין בצורה הטובה ביותר של רכיבים כגון epigenetic נמצאים prions, אשר בעלי התנהגות וההספק עצמית שיכולים להביא ביטוי heritable של פנוטיפים חדש. Prions ארכיטיפי רבים להציג דעה קדומה רצף מרשים של N/Q-עשיר ולהרכיב לתוך קיפול עמילואיד. אלה מאפיינים יוצאי דופן יש הודיע רוב המאמצים ההקרנה כדי לזהות חלבונים חדשים פריון. עם זאת, לפחות שלושה prions ידוע (כולל את הפריון המייסדים, PrP^Sc) לא הנמל מאפיינים אלו הביוכימי. לכן פיתחנו שיטה חלופית כדי לחקור את היקף הירושה חלבון מבוססת בהתבסס על מאפיין של פעולה המונית: ביטוי ארעית של חלבונים פריון מגדיל את תדירות שבו הם רוכשים קונפורמציה של העצמי-תבניות. מאמר זה מתאר שיטה לניתוח הקיבולת של שמרים ORFeome להפיק חלבון מבוססת ירושה. באמצעות אסטרטגיה זו, מצאנו כי בעבר > 1% של חלבונים שמרים יכול לתדלק את הופעתה של תכונות ביולוגיות היו מאריכים, יציב, וקם בתדירות גבוהה יותר מאשר מוטציה גנטית. יכול להיות מועסקים גישה זו תפוקה גבוהה על פני כל ORFeomes או פרדיגמה ההקרנה ממוקד עבור רשתות גנטיות ספציפיות או גירויים סביבתיים. בדיוק כמו מסכי גנטי קדימה להגדיר אינספור מסלולים התפתחותית, איתות, טכניקות אלה מספקים מתודולוגיה לחקור את ההשפעה של חלבון מבוססת ירושה תהליכים ביולוגיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות ביולוגיות חווים לעתים קרובות תנודות ארעי בשפע חלבון. בין אם אלה יש השפעה ממושכת בעיצוב של פנוטיפ של אורגניזם או של דורות העתיד עדיין לא ברור. המופעים הידועים ביותר של ביולוגיה זה לערב מחלקה נדיר של חלבונים, prions, אשר כונן את הופעתה של תכונות heritable ללא שינוי הגנום. במקום זאת, החלקיקים fectious pro, teinaceous וב -לשדר פנוטיפים באמצעות שינויים המנציחים את החלבון קונפורמציה¹^,². סוג זה של ירושה התגלה כגורם של הדפוסים ירושה יוצא דופן של מחלה ניווניות הרסנית. עם זאת, מחקרים אורגניזמים ועד פטריות יונקים³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ מאז גילו כי רכיבים דמויי פריון יכול להתייעץ ערך מסתגלת. למרות זאת, prions מתפרשת מרתקת אבל נדיר oddity ביולוגי.

זו חוכמה הרווחת מתקיים באופן חלקי בגלל האפיון של ירושה חלבון מבוססת זמן הוגבלה על ידי קבוצה קטנה של דוגמאות. מאמצי ההקרנה שיטתית ובמתמטיקה תמונה זו במידה ניכרת על-ידי זיהוי מספר bona אמן חדש prions¹¹ וכמעט שני תריסר חלבון תחומים¹² עם יכולת המרה הסתגלותי פריון כמו דלק. עם זאת, כי גישות אלה התמקדו בדרך כלל הטיות רצף חומצות אמיניות חזקה, prions זה התגלו לשתף את המאפיינים הביוכימי של המייסד שמרים prions [PSI⁺]¹³^,¹⁴, [URE3]¹⁵,¹¹^,[RNQ⁺]¹⁶. אלה כוללים: 1) מודולרי תחומים שאינם עשירים מותח פולימריים זמן של אספרגין (N) וגלוטמין (Q) 2) הרכבה לתוך עמילואיד [פריון⁺] קונפורמציה¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, ו- 3) להשלים את ההסתמכות על disaggregase Hsp104 פונקציה עבור הפצת נאמן מאמא ל בת¹³^,²⁰^,²¹. ואכן, רבים בונה פיד ה prions, לרבות [גאר⁺], [הט-s], והוא אפילו את הפריון המקורי (PrP^Sc), יהיו חסרים תחת קריטריונים מחמירים כגון. אולי חשוב יותר, הם יהיו מסוגלים ללכוד את כל מנגנוני הרומן של ירושה מבוססי חלבונים²². לכן, מגוון ביולוגי אמיתי תופעות כאלה עשויים להיות הרבה יותר נפוץ בטבע מכפי ששוער.

כדי לחקור את השאלה הזו, הועסק אסטרטגיה תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב. סימן היכר של כל prions, כולל PrP^Sc, [גאר⁺], והוא [הט-s], כי ביטוי ארעית של החלבונים סיבתי חזק מגביר את הקצב של פריון רכישה¹⁵^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶. אנחנו ניצלו תכונה זו באופן שיטתי לשאול, על פני כולו שמרים ORFeome, אם הברית מבוסס-חלבון, epigenetic יציב יכול להיות ביוזמת transiently שייצור את ביטוי של חלבונים בודדים. ידוע שכי ביטוי חלבון יכול לשנות פנוטיפים²⁷. עם זאת, פריון חלבונים הם יוצא דופן כי שלהם מתערובת זמנית מייצרת שינוי פנוטיפ זה heritable מאות רבות של דורות לאחר ביטוי ראשוני. בעבר לקחנו לנצל תכונה זו, כמו גם את דפוסי ירושה יוצא דופן של חלבון מבוססת מרכיבים גנטיים, לזהות עשרות חלבונים המסוגלים heritably חיווט מחדש נופים פנוטיפי מבלי לשנות את הגנום²⁸. למרות כמה לזהות חלבונים היו בעבר המכונה prions, רובם היו לא, דבר המלמד את הכוח של גישה זו לחשוף את צורות חדשות של חלבון מבוססת ירושה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביטוי יתר ראשוני

הפוך את תאי השמרים (במקרה זה, BY4741 MAT a haploids) שגדלו בעבר בנוזל YPD (10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון ו-20 גרם גלוקוז ל-1 ליטר) עם המבנים המועמדים הרצויים מספריית FLEXGene ORFeome (ORFs שמרים בשליטת מקדם המושרה על ידי גלקטוז בעמוד השדרה הצנטרומרי של הפלסמיד המסומן URA3, pBY011²⁹).
השתמשו בקיסמים שעברו חיטוי כדי לבחור ארבע מושבות נפרדות מהטרנספורמציות הללו כדי לשמש כשכפולים ביולוגיים. גדל אותם במשך 48-72 שעות ב -150 מיקרוליטר של SRaffinose-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, ו -20 גרם רפינוז לכל 1 ליטר) בצלחות של 96 בארות. חיסון מושבות מה-ORF הראשון בבאר A1 של כל הלוחות, מושבות מה-ORF השני ב-A2 של כל הלוחות וכו'.
הערה: כל שלבי הגידול מתבצעים ב-30 מעלות צלזיוס וברמות אטמוספריות של CO₂ (407.05 ppm), אלא אם צוין אחרת.
ודא שהתרביות רוויות (תאים הנראים בעין בתחתית כל באר) והשתמש ברובוט לטיפול בנוזלים כדי לחסן מערך 1:4 של 1 מיקרוליטר מכל צלחת של 96 בארות לתוך 4 בארות נפרדות של צלחת של 384 בארות מלאות ב-45 מיקרוליטר של SGal-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, ו -20 גרם גלקטוז ל -1 ליטר) לבאר.
הערה: זה יוצר צלחת מרוכבת שבה 4 שכפולים ביולוגיים של כל ORF מסודרים בתבנית מרובעת.
במקביל, הכינו צלחות נפרדות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SGal-URA עם גורמי הלחץ המעניינים (למשל, מנגן כלוריד ב-20 מ"מ) לבאר. חסנו את הצלחת הזו באותו אופן כמו בשלב 1.3.
הערה: כדי להשיג את הטווח הדינמי הגדול ביותר לזיהוי פנוטיפי, מומלצת סדרת דילול פי 2 סביב ריכוז ה-LD50 של גורם לחץ נתון. ניתן לעשות זאת מראש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי בו ניתן לצפות בצמיחה מוגברת ומופחתת.
כבקרה מקבילה אחרונה, חסנו צלחת שלישית של 384 בארות באותו אופן, עם אותו גורם לחץ כלול במדיום שלא יגרום לביטוי פלסמיד. ודא שהצלחת מכילה 45 מיקרוליטר SD-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו ו-20 גרם גלוקוז ל-1 ליטר) לבאר והיא מחוסנת כמו בשלבים 1.3 ו-1.4.
הנח מיד צלחות עם תאים על מערם מיקרו-פלטות והגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 72 שעות, תוך מדידת ה-OD₆₀₀ עם קורא מיקרו-פלטות המצויד במערמים בטמפרטורת החדר ו-CO₂אטמוספרי (407.05 עמודים לדקה).
הערה: תדירות מדידת הגדילה תהיה תלויה במספר הלוחות (שנקבעים בסופו של דבר על ידי מספר הגנים והתנאים שהחוקר רוצה לחקור) המשמשים בריצה. ככל שמשתמשים ביותר צלחות, כך ייקח לקורא הלוחות זמן רב יותר להשלים לולאה ובכך הזמן ארוך יותר בין המדידות (זמן המדידה לצלחת הוא ~45 שניות, תלוי במכשור המופעל).
לאחר מדידות הגידול, השתמש באותו רובוט לטיפול בנוזלים כדי להעביר 1 מיקרוליטר לבאר של התרביות המושרות על ידי SGal-URA (כלומר, אלה שחוו ביטוי יתר של חלבון) לצלחות חדשות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SD-URA לבאר (מדיום שאינו מאפשר ביטוי חלבון של הפלסמיד).
1. במקביל, בצע חיסונים אנלוגיים של קבוצה שנייה של צלחות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SD-URA לבאר מהתרביות שגודלו ב-SD-URA בנוכחות גורמי הלחץ (כלומר, אלה משלב 1.5).
2. גדל את הצלחות במשך 48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לרוויה בתא לח (כלומר, פח פלסטיק אטום ובתוכו מגבת נייר לחה).
קח את הצלחות מהשלב הקודם וחסן מחדש 1 מיקרוליטר לבאר בצלחות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SD-URA. לאחר מכן, בצע חיסון נפרד של 1 מיקרוליטר לבאר מאותה לוחית מקור לצלחת נפרדת של 384 בארות המכילה 45 מיקרוליטר של SD-URA עם גורם הלחץ.
הערה: זה יקבע אם פנוטיפים של רגישות/התנגדות לגורם לחץ נמשכים לאחר הפסקת ביטוי יתר של החלבון.
הנח מיד צלחות עם תאים על מערם מיקרו-פלטות והגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 48 שעות המודדת את ה-OD₆₀₀ עם קורא מיקרו-פלטות בטמפרטורת החדר ו-CO₂אטמוספרי (407.05 עמודים לדקה).
ייצא את מדידות הזמן לעומת OD₆₀₀כטבלת XY באמצעות תוכנת קורא הלוחות. עמודות קבוצתיות של OD₆₀₀ עבור כל ביולוגי משכפלות יחד ומחשבות את הממוצע. צור תרשים זמן XY לעומת OD₆₀₀כדי ליצור עקומות צמיחה.
1. השווה את שיעורי הצמיחה של תרביות שהיו נתונות לביטוי יתר בעבר (כלומר, אלה שהושרו במקור במדיום המכיל גלקטוז לפני חיסון מחדש ב-SD-URA) לעומת תרביות שלא (כלומר, אלה שהופצו בגלוקוז), כפי שתואר קודם לכן³⁰.
עבור תרביות המראות הבדלי גדילה משמעותיים בתגובה לגורם לחץ נתון, התלויים בביטוי יתר של חלבון אבות, קחו 1 מיקרוליטר מכל שכפול ביולוגי, דללו אותו ב-10 מ"ל מים, ולאחר מכן צלחו 50 מיקרוליטר על צלחות המכילות 5-FOA (0.74 גרם CSM-URA, 1 גרם 5-FOA, 50 מ"ג אורציל, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו -20 גרם אגר לליטר). גדל בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
1. אם זה גורם ליותר מדי או מעט מדי מושבות לצלחת, התאם את גורם הדילול בהתאם.
  הערה: 5-FOA מומר למתווך רעיל על ידי מסלול הביוסינתזה של אורציל. זה יגרום לאובדן של פלסמיד הביטוי המסומן URA3 שהפך בשלב הראשון.
בחר 8-32 מושבות בודדות עם קיסמים שעברו חיטוי והצמד אותן לצלחות של 96 בארות המכילות 150 מיקרוליטר SD-CSM. גדל לרוויה במשך 48-72 שעות בתא לח בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. השתמש בתרביות אלה כדי לחסן שתי קבוצות חדשות של צלחות 96 בארות המכילות 150 מיקרוליטר של SD-CSM, הן עם והן בלי גורמי הלחץ משלב 1.11.
הנח את הלוחות על מערם מיקרופלייט והגדר את הפרוטוקול למדידת ה-OD₆₀₀ בלולאה רציפה של 48 שעות.
נתח את הנתונים כמו בשלב 1.10 ואשר כי הבדלי הצמיחה המשמעותיים שנראו בשלב 1.10 נשמרים לאחר אובדן פלסמיד.
הערה: תאים אלה מכילים מצבים פנוטיפיים יציבים שעשויים להעיד על תורשה מבוססת חלבון.
בדוק את התאים ששמרו על הפנוטיפים המושרים עבור סימני היכר קלאסיים של תורשה מבוססת חלבון (ראה להלן).

2. בדיקות עבור ירושה דמוית פריון

"ריפוי" בתיווך מלווה
1. מבחן תלות מלווה Hsp104.
  1. בחר מושבה של זן שמרים בעל מצב פנוטיפי יציב, פס למושבות בודדות על צלחת YPD (10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר) המכיל 3 מ"מ GdnHCl וגדל ב-30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. במקביל, פס מושבה מזן נאיבי למושבות בודדות על YPD+ 3 מ"מ GdnHCl כבקרה באותו אופן.
  2. חזור על הפעולה פעמיים נוספות על צלחות YPD טריות המכילות 3 מ"מ GdnHCl.
  3. מכיוון שחשיפה ל-GdnHCl יכולה להגביר את התדירות שבה נוצרים תאי פטיט, בחר מספר מושבות שעברו 3 מעברים ב-GdnHCl ובדוק אם יש נשימה מיטוכונדריאלית תפקודית על ידי בחינת יכולתן לגדול למושבות גלויות על צלחות YP-Glycerol (10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון, 20 מ"ל גליצרול ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר) לאחר 7 ימים.
  4. בחר מושבות מרובות מלוחות ה-YP-Glycerol ובדוק את השמירה על מצבים פנוטיפיים יציבים באמצעות צמיחה בנוכחות גורם הלחץ בהשוואה לבקרות לא "נרפאות" ונאיביות (כלומר, תאים איזוגניים שאינם מכילים את המצב הפנוטיפי, כגון BY4741 MATa הפלואידים) באופן דומה כמתואר בשלב 1.13.
2. בדוק את התלות במלווה Hsp70.
  1. "ריפוי" באמצעות פלסמיד.
    1. טרנספורמציה הן של תאים נאיביים והן של תאים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים עם פלסמידים המסומנים ב-URA3 המבטאים אלל שלילי דומיננטי של Hsp70 (K69M)²⁵^,³¹ ממקדם מכונן חזק (GPD).
    2. בחר טרנספורמטורים בודדים לכל אחד, פס למושבות בודדות על צלחת SD-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר), וגדל במשך 3 ימים ב-30 מעלות צלזיוס ו-CO₂ אטמוספרי.
    3. חזור על קטע זה פעמיים נוספות על לוחות SD-URA.
    4. בחר מספר מושבות ופס למושבות בודדות על צלחות 5-FOA כדי לחסל את הפלסמיד.
    5. בחר מספר מושבות בודדות עבור כל מבודד ובדוק שימור (או אובדן) של המצבים הפנוטיפיים היציבים באופן דומה כמתואר בשלב 1.13.
  2. "ריפוי" באמצעות הכלאה גנטית.
    1. חצו BY4741 MATזנים הפלואידים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים וזנים נאיביים מסוג ההזדווגות הנגדי (במקרה זה, BY4742 MATα) המכילים מחיקות גנטיות בשניים מארבעת הפרלוגים של השמרים Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
      הערה: זן זה לוקה בחסר בתפקוד המלווה Hsp70.
    2. בחר לצמיחה של דיפלואידים על ידי פסים למושבות בודדות על SD-LYS-MET (0.74 גרם CSM-LYS-MET, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר) מדיום נשירה כפולה.
    3. בחרו מושבות דיפלואידיות בודדות וגידלו במשך 24 שעות ב-30 מעלות צלזיוס ב-8 מ"ל של מדיום קדם-נבגים (0.8% תמצית שמרים, 0.3% פפטון, 10% דקסטרוז ו-100 מ"ג/ליטר אדנין סולפט).
    4. סובבו את התרביות למשך 3 דקות בטמפרטורה של 3,000 xg, שאפו את המדיום הקדם-נבגי (pre-SPO) ושטפו את הכדורים פעם אחת במים סטריליים.
    5. השעו מחדש את הכדורים ב-2 מ"ל של מדיום נבגים (1% אשלגן אצטט, 0.1% תמצית שמרים, 0.05% גלוקוז ו-0.01% תערובת תוספת חומצות אמינו (2 גרם היסטידין, 10 גרם לאוצין, 2 גרם ליזין ו-2 גרם אורציל)). גדל בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
    6. העבירו את התרביות ל-30 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 48 שעות נוספות.
    7. העריכו את יעילות הנבגים על ידי חיפוש נוכחות של טטרדות באמצעות מיקרוסקופ אור³².
    8. קח 40 מיקרוליטר של תרבית, סובב למשך דקה אחת ב-3,000 xg בשפופרת של 1.5 מ"ל, והשהה מחדש בנפח שווה של תערובת אנזימים זימוליאז (1 M סורביטול, 0.1 M EDTA ו-10 מ"ג/מ"ל זימוליאז 100T)
    9. יש לדגור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    10. מרחו 10 מיקרוליטר של תרבית מעוכלת על צלחת אגר YPD יבשה מאוד ומישורית מאוד ואפשרו לתרבית להתפשט לאט במורד הצלחת בקו ישר.
    11. הניחו לצלחות להתייבש לפחות 30 דקות בקולט אדים למינארי.
    12. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה, הפרד את הנבגים לטטרדות וסדר אותם על הצלחת.
    13. אפשר לנבגים ההפלואידים הבודדים לגדול למושבות ובדוק את יכולתם לגדול על צלחות SD-HIS-LEU (0.67 גרם CSM-HIS-LEU, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר), מה שמצביע על כך שהם מכילים את שתי המחיקות הגנטיות (ssa1Δ ssa2Δ
    14. בדוק כל אחד מהם לשמירה על המצב הפנוטיפי ברקע חסר Hsp70 באופן דומה למתואר בשלב 1.13.
      הערה: חציית נבגים אלה בחזרה לזן פרא עם פונקציית Hsp70 משוחזרת לא אמורה לשחזר את פנוטיפ הפריון.
בדיקת תורשה שאינה מנדלית.
1. חצו BY4741 MATזנים הפלואידים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים ובקרות נאיביות איזוגניות לזן נאיבי איזוגני מסוג ההזדווגות הנגדי (במקרה זה, BY4742 MATα).
2. בחר לצמיחה של דיפלואידים על ידי פסים למושבות בודדות במדיום הנשירה הכפולה SD-LYS-MET.
3. בחר מושבות דיפלואידיות בודדות וגדל במשך 24 שעות ב-30 מעלות צלזיוס ב-8 מ"ל של מדיום טרום נבגים.
4. חזור על שלבים 2.2.2.3-2.2.2.12, כמתואר לעיל.
5. אפשר לנבגים ההפלואידים הבודדים לגדול למושבות ובדוק כל אחד מהם לשמירה על המצב הפנוטיפי באמצעות מיוזה באמצעות בדיקת הגדילה, כמו בשלב 1.13.
  הערה: מאפיין מגדיר נוסף של פריונים הוא שניתן לחסל אותם בתורשה באמצעות הסרת החלבון המזדמן המקורי. לפיכך, באופן אנלוגי, הכלאה של זן פריון עם זן המכיל מחיקה גנטית של החלבון המושרה המקורי תבטל את הפנוטיפים של פריונים בנבגים היורשים את המחיקה. כמו כן, שים לב שייתכן שהפריון יישמר במצב "קריפטיק" במוטציה כזו אם הגן שנמחק נדרש כדי לבטא את פנוטיפ הפריון אך לא כדי להפיץ את הפריון עצמו. כדי להבחין בין שתי האפשרויות הללו, חצו את הנבגים בחזרה לזן פרא נאיבי ובדקו אם פנוטיפ הפריון מופיע מחדש ברקע גנטי דיפלואידי, שבו תפקוד הגן שוחזר.
ציטודוקציה.
1. צור את זן הנמען הראשוני של BY4742.
  1. באמצעות טרנספורמציה, הציגו אלל KAR פגום (kar1-15) המונע היתוך גרעיני במהלך הזדווגות²³.
  2. הפכו את הזן הזה ל"קטן" (כלומר, לא מסוגל לנשימה מיטוכונדריאלית) על ידי חיסון מושבה בודדת במרק YPD עם 0.25% אתידיום ברומיד.
  3. מגדלים את התרבית ב-30 מעלות צלזיוס עד לשלב האקספוננציאלי / נייח המאוחר (OD₆₀₀ ~ 1).
  4. יש לדלל 1:1,000 ב-YPD טרי עם 0.25% אתידיום ברומיד ולחזור על הפעולה פעמיים.
  5. ברגע שהתרבית מגיעה לשלב אקספוננציאלי מאוחר/נייח מוקדם (OD₆₀₀ 0.8-1.2), צלחת למושבות בודדות על ידי דילול 1:10,000 במים סטריליים וציפוי 50 מיקרוליטר על צלחת YPD. לאחר גידול במשך 3 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, בחרו מספר מושבות ובדקו כל אחת מהן לאי יכולת נשימה על ידי בחינת יכולתן לגדול למושבות גלויות על צלחות YP-Glycerol לאחר 7 ימים.
2. בצע ציטודוקציה ראשונית ל-BY4742.
  1. ערבבו תאים של הזן התורם BY4741 המכיל מצב פנוטיפי יציב עם תאים של הזן הנאיבי BY4742 kar1-15 על פני צלחת אגר YPD.
  2. גדל במשך 24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-CO₂ אטמוספרי (407.05 חלקים למיליון) והעביר למדיום נשירה של מתיונין המכיל גליצרול (SGly-MET: 0.74 גרם CSM-MET, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 מ"ל גליצרול ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר).
    הערה: זה בוחר עבור שני הסמנים הגרעיניים BY4742, יחד עם מתן אפשרות לשיקום המיטוכונדריה התפקודית באמצעות חילופי ציטופלזמה.
  3. לאחר 3-5 ימים, בחרו מספר מושבות בודדות ובצעו סבב סלקציה נוסף על SD-MET (0.74 גרם CSM-MET, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר).
  4. במקביל, ודא שהמושבות אינן דיפלואידיות על ידי מעבר על מדיום SD-LYS-MET.
3. בצע ציטודוקציות הפוכות.
  1. ערבבו את זני התורמים החדשים (הפעם, הציטודוקטנטים המוצלחים BY4742 kar1-15) עם תאי BY4741 נאיביים קטנים (שנוצרו כאמור לעיל) על אגר YPD.
  2. חזור על ציטודוקציות, כמתואר קודם לכן (שלבים 2.3.2.1-2.3.2.4), למעט בחירה עבור סמנים גרעיניים של מקבל BY4741 על מדיום גליצרול חסר ליזין (SGly-LYS: 0.74 גרם CSM-LYS, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 מ"ל גליצרול ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר).
  3. בחר מספר ציטודוקטנטים ובדוק שמירה על מצבים פנוטיפיים יציבים באמצעות בדיקת הגדילה, כמו קודם בשלב 1.13.
טרנספורמציה של חלבון.
1. הכן את הליזאט.
  1. גדל 50 מ"ל של תאים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים ב-YPD למשך 18 שעות ב-30 מעלות צלזיוס.
  2. גלולה את התרביות ב-3,000 x גרם למשך 4 דקות ולאחר מכן שטפו פעמיים: פעם אחת ב-H₂O חיטוי ולאחר מכן ב-1 M סורביטול.
  3. השעו מחדש את התאים ב-200 מ"ל של מאגר SCE (1 מ"מ סורביטול, 10 מ"מ EDTA, 10 מ"מ DTT, 100 מ"מ נתרן ציטראט וטבליה אחת של מעכב פרוטאז מיני ללא EDTA לכל 50 מ"ל, pH 5.8) עם 50 U/mL של אנזים ליטי שמרים 100T.
  4. דגרו את התערובת בחום של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. סוניקציה של התאים ב-20 קילו-הרץ ובעוצמה של 20% למשך 10 שניות על קרח עם דיסמברטור קולי.
  6. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. העבירו את הסופרנטנטים לצינור נקי והוסיפו RNase I ו-DNase ביוטיניל בעודף של פי 3 (כפי שנקבע על ידי יחידות פעילות) ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  8. הסר את ה-DNase I על ידי הוספת עודף חרוזי סטרפטווידין-אגרוז, דגירה למשך 5 דקות וגלולה על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 1.5 דקות.
  9. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי.
2. הכן את הספרופלסט המקבל.
  1. גדל 5 מ"ל של תאי נמען נאיביים ב-YPD עד אמצע השלב האקספוננציאלי (OD₆₀₀ שנע בין 0.5-1).
  2. קציר על ידי צנטריפוגה (3,000 x גרם למשך 4 דקות) ושטוף 4 פעמים: פעמיים ב- H₂O ופעמיים ב- 1 M סורביטול.
  3. השעו מחדש את התאים בסורביטול 1 M המכיל 200 U/mL אנזים ליטי שמרים ודגרו למשך 15 דקות ב-35 מעלות צלזיוס כדי לעכל את דפנות התא.
  4. קצרו את הספרופלסטים המתקבלים עם צנטריפוגה עדינה ב-600 x גרם למשך 5 דקות ושטפו עם 1 מ"ל של 1 מ"ל של 1 מ"ל סורביטול ולאחר מכן שוב עם 1 מ"ל של מאגר STC (1 מ"מ סורביטול, 10 מ"מ טריס pH 7.5 ו-10 מ"מ CaCl₂).
  5. השעו מחדש את הספרופלסטים השטופים ב-50 מיקרוליטר של מאגר STC.
    הערה: השתמש במספריים כדי לחתוך את ~0.7 ס"מ האחרון של קצה פיפטה; זה ייצור פה רחב יותר וימנע ליזה של הספרופלסטים.
3. הפוך את התאים הנאיביים עם חלבון.
  1. הפוך 50 מיקרוליטר של aliquots ספרופלסט עם 50 מיקרוליטר של ליזאט תורם, 20 מיקרוליטר של DNA זרע סלמון (2 מ"ג/מ"ל) ו-5 מיקרוליטר של פלסמיד בחירה המסומן ב-URA3 (למשל, pAG426-GFP)²⁸^,³³.
  2. דגרו את התערובת בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-600 x g כדי לאסוף את הספרופלסטים ולהשעות מחדש ב-150 מיקרוליטר של מאגר SOS (1 M סורביטול, 7 מ"מ CaCl₂, 0.25% תמצית שמרים ו-0.5% פפטון).
  4. יש להתאושש למשך 30 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
  5. צלחת את כל התרבות על צלחות SD-URA.
  6. כסה במהירות את התרבית המצופה ב-SD-URA חם (~45 מעלות צלזיוס) המכיל 0.8% אגר.< > הערה: זה ימנע את התפוצצות הספרופלסטים
  7. דגרו את לוחות הטרנספורמציה למשך 2-3 ימים בחום של 30 מעלות צלזיוס.
  8. בעזרת קיסם, בחר בהצלחה תאים הגדלים מהצלחת המכוסה ופס מחדש למושבות בודדות על לוחות SD-URA.
  9. בחר עשרות מושבות לכל אחת ופס על 5-FOA לוחות כדי לחסל פלסמיד נשא המסומן ב-URA3.
  10. בחר מושבות הגדלות על לוחות 5-FOA ובדוק העברת מצבים פנוטיפיים יציבים באמצעות מבחן הגדילה, כמו קודם (שלב 1.13).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי יתר של חלבון ידוע כמשנה באופן דרמטי פנוטיפים תאיים²⁷. ואכן, בגישת סינון ראשונית, מאות פנוטיפים חדשים שוחזרו באופן שחזורי מביטוי יתר של שיבוטים מהשמרים ORFeome באמצעות עשרה גורמי לחץ בלבד. עם זאת, הבדיקות שתוארו לעיל מאפשרות להעריך אם התאים שומרים על פנוטיפים יציבים לטווח ארוך בעקבות ביטוי יתר זה. חלבון אחד המסוגל לקודד מצב כזה הוא Psp1. Psp1 הוא חלבון בעל תפקוד לא ידוע שיכול לדכא מוטציות במנגנון השכפול (למשל, ב-pol alpha³⁴). ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prions הראשון שמרים זוהו על ידי שלהם יוצא דופן פנוטיפים ודפוסי מביך של ירושה. המאפיינים של אלה prions ואז שימשו לבניית אלגוריתמים, כלים חישוביים למסך חלבונים פריון נוספים. השיטה המתוארת כאן, לעומת זאת, נסיוני ומסתמך על ביטוי ארעית כדי ליצור מתמשך שינוי-a יציב מקודד המדינה קונפורמציה חלבון. עם זאת, אם היעילות של "זריעה" ההרכבות פריון על ידי ביטוי עבור כל חלבון נתון נמוך מאוד, את הפרוטאין ללא הרף יתגלה תוצאה שלילית שגויה במסכים ביטוי מסוג זה. אחד כגון השינוי כדי לתקן זאת תהיה לשימוש של פלסמיד 2-מיקרו-ביטוי חלבון בעתיד ניסו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים Sohini Chakrabortee סנדרה ג'ונס, דייוויד גרסיה, Bhupinder Bhullar, אמיליה צ'אנג, ריצ'רד היא, סוזן Lindquist לסיוע שלהם בפיתוח מבחני את הנייר הזה, כמו גם הבודקים המשמש את הערותיהם מתחשב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
גואנידין הידרוכלוריד	סיגמא	חתול #G3272-25G	כימי
מנגן כלוריד	סיגמא	חתול#M8054-100G
כימי אתידיום ברומיד	סיגמא	E1510	כימי
5-חומצה פלואורורוטית	סיגמא	חתול#F5013-50 מ"ג	כימי
BY4741 MATa (his3&דלתא; 1 leu2&דלתא; 0 LYS2 met15&דלתא; 0 ura3&דלתא; 0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A	זן שמרים
BY4741 MATα (his3&דלתא; 1 leu2&דלתא; 0 lys2&דלתא; 0 MET15 ura3Δ 0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A	זן שמרים
Hsp70 (K69M)	Jarosz et al., 2014b	N/A
Plasmid FLEXGene library	Hu et al., 2007	/A	ספריית פלסמיד
דקסטרוז (גלוקוז)	פישר סיינטיפיק	D16-3	רכיב מדיה
Raffinose	Sigma	R0250-25G	רכיב מדיה
גלקטוז	פישר סיינטיפיק	BP656-500	רכיב מדיה
CSM	זריחה מדע	1001-100	רכיב מדיה
CSM-URA	Sunrise Science	1004-100	רכיב מדיה
CSM-LYS	Sunrise Science	1032-100	רכיב מדיה
CSM-MET	Sunrise Science	1019-100	רכיב מדיה
CSM-LYS-MET	Sunrise Science	1035-100	רכיב מדיה
תמצית שמרים	פישר Scientific	BP1422-2	רכיב מדיה
פפטון	מוצרי מחקר בינלאומיים	P20240-5000	רכיב מדיה
בקטו-פפטון	BD	211677	רכיב מדיה
גליצרול	EMD Millipore	GX0185-2	רכיב מדיה
שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו	BD	291920	רכיב מדיה
אגר	IBI Scientific	IB49172	רכיב מדיה
אדנין סולפט	סיגמא	A3159-25G	רכיב מדיה
אשלגן אצטט	סיגמא	P1190-500G	רכיב מדיה
Uracil	Sigma	U0750-100G	רכיב מדיה
Histidine	Sigma	H8000-100G	רכיב מדיה
לאוצין	סיגמא	L8000-25G	רכיב מדיה
ליזין	סיגמא	L5501-25G	רכיב מדיה
RNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0601	אנזים
ביוטיניל DNase	Thermo Fisher Scientific	AM1906	אנזים
זימוליאז 100T (אנזים ליטי שמרים)	Sunrise Science	N0766555	קורא
מיקרו-פלטות	BioTek	Synergy H1	ציוד
מערם Microplate	BioTek	BioStack3	צלחת ציוד
מילוי	BiotTek	EL406	ציוד
רובוט לטיפול בנוזלים	בקמן קולטר	Biomek FX	ציוד

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).
Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766(2016).
Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).
Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles