הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

מערכות ביולוגיות חווים לעתים קרובות תנודות ארעי בשפע חלבון. בין אם אלה יש השפעה ממושכת בעיצוב של פנוטיפ של אורגניזם או של דורות העתיד עדיין לא ברור. המופעים הידועים ביותר של ביולוגיה זה לערב מחלקה נדיר של חלבונים, prions, אשר כונן את הופעתה של תכונות heritable ללא שינוי הגנום. במקום זאת, החלקיקים fectious pro, teinaceous וב -לשדר פנוטיפים באמצעות שינויים המנציחים את החלבון קונפורמציה^1,2. סוג זה של ירושה התגלה כגורם של הדפוסים ירושה יוצא דופן של מחלה ניווניות הרסנית. עם זאת, מחקרים אורגניזמים ועד פטריות יונקים^{3,4,5,6,7,8,9,10} מאז גילו כי רכיבים דמויי פריון יכול להתייעץ ערך מסתגלת. למרות זאת, prions מתפרשת מרתקת אבל נדיר oddity ביולוגי.

זו חוכמה הרווחת מתקיים באופן חלקי בגלל האפיון של ירושה חלבון מבוססת זמן הוגבלה על ידי קבוצה קטנה של דוגמאות. מאמצי ההקרנה שיטתית ובמתמטיקה תמונה זו במידה ניכרת על-ידי זיהוי מספר bona אמן חדש prions¹¹ וכמעט שני תריסר חלבון תחומים¹² עם יכולת המרה הסתגלותי פריון כמו דלק. עם זאת, כי גישות אלה התמקדו בדרך כלל הטיות רצף חומצות אמיניות חזקה, prions זה התגלו לשתף את המאפיינים הביוכימי של המייסד שמרים prions [PSI⁺]^13,14, [URE3]¹⁵,^11,[RNQ⁺]¹⁶. אלה כוללים: 1) מודולרי תחומים שאינם עשירים מותח פולימריים זמן של אספרגין (N) וגלוטמין (Q) 2) הרכבה לתוך עמילואיד [פריון⁺] קונפורמציה^17,18,19, ו- 3) להשלים את ההסתמכות על disaggregase Hsp104 פונקציה עבור הפצת נאמן מאמא ל בת^13,20,21. ואכן, רבים בונה פיד ה prions, לרבות [גאר⁺], [הט-s], והוא אפילו את הפריון המקורי (PrP^Sc), יהיו חסרים תחת קריטריונים מחמירים כגון. אולי חשוב יותר, הם יהיו מסוגלים ללכוד את כל מנגנוני הרומן של ירושה מבוססי חלבונים²². לכן, מגוון ביולוגי אמיתי תופעות כאלה עשויים להיות הרבה יותר נפוץ בטבע מכפי ששוער.

כדי לחקור את השאלה הזו, הועסק אסטרטגיה תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב. סימן היכר של כל prions, כולל PrP^Sc, [גאר⁺], והוא [הט-s], כי ביטוי ארעית של החלבונים סיבתי חזק מגביר את הקצב של פריון רכישה^{15,23,24,25,26}. אנחנו ניצלו תכונה זו באופן שיטתי לשאול, על פני כולו שמרים ORFeome, אם הברית מבוסס-חלבון, epigenetic יציב יכול להיות ביוזמת transiently שייצור את ביטוי של חלבונים בודדים. ידוע שכי ביטוי חלבון יכול לשנות פנוטיפים²⁷. עם זאת, פריון חלבונים הם יוצא דופן כי שלהם מתערובת זמנית מייצרת שינוי פנוטיפ זה heritable מאות רבות של דורות לאחר ביטוי ראשוני. בעבר לקחנו לנצל תכונה זו, כמו גם את דפוסי ירושה יוצא דופן של חלבון מבוססת מרכיבים גנטיים, לזהות עשרות חלבונים המסוגלים heritably חיווט מחדש נופים פנוטיפי מבלי לשנות את הגנום²⁸. למרות כמה לזהות חלבונים היו בעבר המכונה prions, רובם היו לא, דבר המלמד את הכוח של גישה זו לחשוף את צורות חדשות של חלבון מבוססת ירושה.

1. ביטוי יתר ראשוני

1. הפוך את תאי השמרים (במקרה זה, BY4741 MAT a haploids) שגדלו בעבר בנוזל YPD (10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון ו-20 גרם גלוקוז ל-1 ליטר) עם המבנים המועמדים הרצויים מספריית FLEXGene ORFeome (ORFs שמרים בשליטת מקדם המושרה על ידי גלקטוז בעמוד השדרה הצנטרומרי של הפלסמיד המסומן URA3, pBY011²⁹).
2. השתמשו בקיסמים שעברו חיטוי כדי לבחור ארבע מושבות נפרדות מהטרנספורמציות הללו כדי לשמש כשכפולים ביולוגיים. גדל אותם במשך 48-72 שעות ב -150 מיקרוליטר של SRaffinose-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, ו -20 גרם רפינוז לכל 1 ליטר) בצלחות של 96 בארות. חיסון מושבות מה-ORF הראשון בבאר A1 של כל הלוחות, מושבות מה-ORF השני ב-A2 של כל הלוחות וכו'.
   הערה: כל שלבי הגידול מתבצעים ב-30 מעלות צלזיוס וברמות אטמוספריות של CO₂ (407.05 ppm), אלא אם צוין אחרת.
3. ודא שהתרביות רוויות (תאים הנראים בעין בתחתית כל באר) והשתמש ברובוט לטיפול בנוזלים כדי לחסן מערך 1:4 של 1 מיקרוליטר מכל צלחת של 96 בארות לתוך 4 בארות נפרדות של צלחת של 384 בארות מלאות ב-45 מיקרוליטר של SGal-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, ו -20 גרם גלקטוז ל -1 ליטר) לבאר.
   הערה: זה יוצר צלחת מרוכבת שבה 4 שכפולים ביולוגיים של כל ORF מסודרים בתבנית מרובעת.
4. במקביל, הכינו צלחות נפרדות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SGal-URA עם גורמי הלחץ המעניינים (למשל, מנגן כלוריד ב-20 מ"מ) לבאר. חסנו את הצלחת הזו באותו אופן כמו בשלב 1.3.
   הערה: כדי להשיג את הטווח הדינמי הגדול ביותר לזיהוי פנוטיפי, מומלצת סדרת דילול פי 2 סביב ריכוז ה-LD50 של גורם לחץ נתון. ניתן לעשות זאת מראש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי בו ניתן לצפות בצמיחה מוגברת ומופחתת.
5. כבקרה מקבילה אחרונה, חסנו צלחת שלישית של 384 בארות באותו אופן, עם אותו גורם לחץ כלול במדיום שלא יגרום לביטוי פלסמיד. ודא שהצלחת מכילה 45 מיקרוליטר SD-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו ו-20 גרם גלוקוז ל-1 ליטר) לבאר והיא מחוסנת כמו בשלבים 1.3 ו-1.4.
6. הנח מיד צלחות עם תאים על מערם מיקרו-פלטות והגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 72 שעות, תוך מדידת ה-OD₆₀₀ עם קורא מיקרו-פלטות המצויד במערמים בטמפרטורת החדר ו-CO₂ אטמוספרי (407.05 עמודים לדקה).
   הערה: תדירות מדידת הגדילה תהיה תלויה במספר הלוחות (שנקבעים בסופו של דבר על ידי מספר הגנים והתנאים שהחוקר רוצה לחקור) המשמשים בריצה. ככל שמשתמשים ביותר צלחות, כך ייקח לקורא הלוחות זמן רב יותר להשלים לולאה ובכך הזמן ארוך יותר בין המדידות (זמן המדידה לצלחת הוא ~45 שניות, תלוי במכשור המופעל).
7. לאחר מדידות הגידול, השתמש באותו רובוט לטיפול בנוזלים כדי להעביר 1 מיקרוליטר לבאר של התרביות המושרות על ידי SGal-URA (כלומר, אלה שחוו ביטוי יתר של חלבון) לצלחות חדשות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SD-URA לבאר (מדיום שאינו מאפשר ביטוי חלבון של הפלסמיד).
   1. במקביל, בצע חיסונים אנלוגיים של קבוצה שנייה של צלחות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SD-URA לבאר מהתרביות שגודלו ב-SD-URA בנוכחות גורמי הלחץ (כלומר, אלה משלב 1.5).
   2. גדל את הצלחות במשך 48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לרוויה בתא לח (כלומר, פח פלסטיק אטום ובתוכו מגבת נייר לחה).
8. קח את הצלחות מהשלב הקודם וחסן מחדש 1 מיקרוליטר לבאר בצלחות של 384 בארות המכילות 45 מיקרוליטר של SD-URA. לאחר מכן, בצע חיסון נפרד של 1 מיקרוליטר לבאר מאותה לוחית מקור לצלחת נפרדת של 384 בארות המכילה 45 מיקרוליטר של SD-URA עם גורם הלחץ.
   הערה: זה יקבע אם פנוטיפים של רגישות/התנגדות לגורם לחץ נמשכים לאחר הפסקת ביטוי יתר של החלבון.
9. הנח מיד צלחות עם תאים על מערם מיקרו-פלטות והגדר את הפרוטוקול ללולאה רציפה של 48 שעות המודדת את ה-OD₆₀₀ עם קורא מיקרו-פלטות בטמפרטורת החדר ו-CO₂ אטמוספרי (407.05 עמודים לדקה).
10. ייצא את מדידות הזמן לעומת OD₆₀₀ כטבלת XY באמצעות תוכנת קורא הלוחות. עמודות קבוצתיות של OD₆₀₀ עבור כל ביולוגי משכפלות יחד ומחשבות את הממוצע. צור תרשים זמן XY לעומת OD₆₀₀ כדי ליצור עקומות צמיחה.
    1. השווה את שיעורי הצמיחה של תרביות שהיו נתונות לביטוי יתר בעבר (כלומר, אלה שהושרו במקור במדיום המכיל גלקטוז לפני חיסון מחדש ב-SD-URA) לעומת תרביות שלא (כלומר, אלה שהופצו בגלוקוז), כפי שתואר קודם לכן³⁰.
11. עבור תרביות המראות הבדלי גדילה משמעותיים בתגובה לגורם לחץ נתון, התלויים בביטוי יתר של חלבון אבות, קחו 1 מיקרוליטר מכל שכפול ביולוגי, דללו אותו ב-10 מ"ל מים, ולאחר מכן צלחו 50 מיקרוליטר על צלחות המכילות 5-FOA (0.74 גרם CSM-URA, 1 גרם 5-FOA, 50 מ"ג אורציל, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו -20 גרם אגר לליטר). גדל בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
    1. אם זה גורם ליותר מדי או מעט מדי מושבות לצלחת, התאם את גורם הדילול בהתאם.
       הערה: 5-FOA מומר למתווך רעיל על ידי מסלול הביוסינתזה של אורציל. זה יגרום לאובדן של פלסמיד הביטוי המסומן URA3 שהפך בשלב הראשון.
12. בחר 8-32 מושבות בודדות עם קיסמים שעברו חיטוי והצמד אותן לצלחות של 96 בארות המכילות 150 מיקרוליטר SD-CSM. גדל לרוויה במשך 48-72 שעות בתא לח בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. השתמש בתרביות אלה כדי לחסן שתי קבוצות חדשות של צלחות 96 בארות המכילות 150 מיקרוליטר של SD-CSM, הן עם והן בלי גורמי הלחץ משלב 1.11.
13. הנח את הלוחות על מערם מיקרופלייט והגדר את הפרוטוקול למדידת ה-OD₆₀₀ בלולאה רציפה של 48 שעות.
14. נתח את הנתונים כמו בשלב 1.10 ואשר כי הבדלי הצמיחה המשמעותיים שנראו בשלב 1.10 נשמרים לאחר אובדן פלסמיד.
    הערה: תאים אלה מכילים מצבים פנוטיפיים יציבים שעשויים להעיד על תורשה מבוססת חלבון.
15. בדוק את התאים ששמרו על הפנוטיפים המושרים עבור סימני היכר קלאסיים של תורשה מבוססת חלבון (ראה להלן).

2. בדיקות עבור ירושה דמוית פריון

1. "ריפוי" בתיווך מלווה
   1. מבחן תלות מלווה Hsp104.
      1. בחר מושבה של זן שמרים בעל מצב פנוטיפי יציב, פס למושבות בודדות על צלחת YPD (10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר) המכיל 3 מ"מ GdnHCl וגדל ב-30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. במקביל, פס מושבה מזן נאיבי למושבות בודדות על YPD+ 3 מ"מ GdnHCl כבקרה באותו אופן.
      2. חזור על הפעולה פעמיים נוספות על צלחות YPD טריות המכילות 3 מ"מ GdnHCl.
      3. מכיוון שחשיפה ל-GdnHCl יכולה להגביר את התדירות שבה נוצרים תאי פטיט, בחר מספר מושבות שעברו 3 מעברים ב-GdnHCl ובדוק אם יש נשימה מיטוכונדריאלית תפקודית על ידי בחינת יכולתן לגדול למושבות גלויות על צלחות YP-Glycerol (10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון, 20 מ"ל גליצרול ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר) לאחר 7 ימים.
      4. בחר מושבות מרובות מלוחות ה-YP-Glycerol ובדוק את השמירה על מצבים פנוטיפיים יציבים באמצעות צמיחה בנוכחות גורם הלחץ בהשוואה לבקרות לא "נרפאות" ונאיביות (כלומר, תאים איזוגניים שאינם מכילים את המצב הפנוטיפי, כגון BY4741 MATa הפלואידים) באופן דומה כמתואר בשלב 1.13.
   2. בדוק את התלות במלווה Hsp70.
      1. "ריפוי" באמצעות פלסמיד.
         1. טרנספורמציה הן של תאים נאיביים והן של תאים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים עם פלסמידים המסומנים ב-URA3 המבטאים אלל שלילי דומיננטי של Hsp70 (K69M)^25,31 ממקדם מכונן חזק (GPD).
         2. בחר טרנספורמטורים בודדים לכל אחד, פס למושבות בודדות על צלחת SD-URA (0.74 גרם CSM-URA, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר), וגדל במשך 3 ימים ב-30 מעלות צלזיוס ו-CO₂ אטמוספרי.
         3. חזור על קטע זה פעמיים נוספות על לוחות SD-URA.
         4. בחר מספר מושבות ופס למושבות בודדות על צלחות 5-FOA כדי לחסל את הפלסמיד.
         5. בחר מספר מושבות בודדות עבור כל מבודד ובדוק שימור (או אובדן) של המצבים הפנוטיפיים היציבים באופן דומה כמתואר בשלב 1.13.
      2. "ריפוי" באמצעות הכלאה גנטית.
         1. חצו BY4741 MATזנים הפלואידים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים וזנים נאיביים מסוג ההזדווגות הנגדי (במקרה זה, BY4742 MATα) המכילים מחיקות גנטיות בשניים מארבעת הפרלוגים של השמרים Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
            הערה: זן זה לוקה בחסר בתפקוד המלווה Hsp70.
         2. בחר לצמיחה של דיפלואידים על ידי פסים למושבות בודדות על SD-LYS-MET (0.74 גרם CSM-LYS-MET, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר) מדיום נשירה כפולה.
         3. בחרו מושבות דיפלואידיות בודדות וגידלו במשך 24 שעות ב-30 מעלות צלזיוס ב-8 מ"ל של מדיום קדם-נבגים (0.8% תמצית שמרים, 0.3% פפטון, 10% דקסטרוז ו-100 מ"ג/ליטר אדנין סולפט).
         4. סובבו את התרביות למשך 3 דקות בטמפרטורה של 3,000 xg, שאפו את המדיום הקדם-נבגי (pre-SPO) ושטפו את הכדורים פעם אחת במים סטריליים.
         5. השעו מחדש את הכדורים ב-2 מ"ל של מדיום נבגים (1% אשלגן אצטט, 0.1% תמצית שמרים, 0.05% גלוקוז ו-0.01% תערובת תוספת חומצות אמינו (2 גרם היסטידין, 10 גרם לאוצין, 2 גרם ליזין ו-2 גרם אורציל)). גדל בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
         6. העבירו את התרביות ל-30 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 48 שעות נוספות.
         7. העריכו את יעילות הנבגים על ידי חיפוש נוכחות של טטרדות באמצעות מיקרוסקופ אור³².
         8. קח 40 מיקרוליטר של תרבית, סובב למשך דקה אחת ב-3,000 xg בשפופרת של 1.5 מ"ל, והשהה מחדש בנפח שווה של תערובת אנזימים זימוליאז (1 M סורביטול, 0.1 M EDTA ו-10 מ"ג/מ"ל זימוליאז 100T)
         9. יש לדגור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
         10. מרחו 10 מיקרוליטר של תרבית מעוכלת על צלחת אגר YPD יבשה מאוד ומישורית מאוד ואפשרו לתרבית להתפשט לאט במורד הצלחת בקו ישר.
         11. הניחו לצלחות להתייבש לפחות 30 דקות בקולט אדים למינארי.
         12. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה, הפרד את הנבגים לטטרדות וסדר אותם על הצלחת.
         13. אפשר לנבגים ההפלואידים הבודדים לגדול למושבות ובדוק את יכולתם לגדול על צלחות SD-HIS-LEU (0.67 גרם CSM-HIS-LEU, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר), מה שמצביע על כך שהם מכילים את שתי המחיקות הגנטיות (ssa1Δ ssa2Δ
         ).
         14. בדוק כל אחד מהם לשמירה על המצב הפנוטיפי ברקע חסר Hsp70 באופן דומה למתואר בשלב 1.13.
             הערה: חציית נבגים אלה בחזרה לזן פרא עם פונקציית Hsp70 משוחזרת לא אמורה לשחזר את פנוטיפ הפריון.
2. בדיקת תורשה שאינה מנדלית.
   1. חצו BY4741 MATזנים הפלואידים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים ובקרות נאיביות איזוגניות לזן נאיבי איזוגני מסוג ההזדווגות הנגדי (במקרה זה, BY4742 MATα).
   2. בחר לצמיחה של דיפלואידים על ידי פסים למושבות בודדות במדיום הנשירה הכפולה SD-LYS-MET.
   3. בחר מושבות דיפלואידיות בודדות וגדל במשך 24 שעות ב-30 מעלות צלזיוס ב-8 מ"ל של מדיום טרום נבגים.
   4. חזור על שלבים 2.2.2.3-2.2.2.12, כמתואר לעיל.
   5. אפשר לנבגים ההפלואידים הבודדים לגדול למושבות ובדוק כל אחד מהם לשמירה על המצב הפנוטיפי באמצעות מיוזה באמצעות בדיקת הגדילה, כמו בשלב 1.13.
      הערה: מאפיין מגדיר נוסף של פריונים הוא שניתן לחסל אותם בתורשה באמצעות הסרת החלבון המזדמן המקורי. לפיכך, באופן אנלוגי, הכלאה של זן פריון עם זן המכיל מחיקה גנטית של החלבון המושרה המקורי תבטל את הפנוטיפים של פריונים בנבגים היורשים את המחיקה. כמו כן, שים לב שייתכן שהפריון יישמר במצב "קריפטיק" במוטציה כזו אם הגן שנמחק נדרש כדי לבטא את פנוטיפ הפריון אך לא כדי להפיץ את הפריון עצמו. כדי להבחין בין שתי האפשרויות הללו, חצו את הנבגים בחזרה לזן פרא נאיבי ובדקו אם פנוטיפ הפריון מופיע מחדש ברקע גנטי דיפלואידי, שבו תפקוד הגן שוחזר.
3. ציטודוקציה.
   1. צור את זן הנמען הראשוני של BY4742.
      1. באמצעות טרנספורמציה, הציגו אלל KAR פגום (kar1-15) המונע היתוך גרעיני במהלך הזדווגות²³.
      2. הפכו את הזן הזה ל"קטן" (כלומר, לא מסוגל לנשימה מיטוכונדריאלית) על ידי חיסון מושבה בודדת במרק YPD עם 0.25% אתידיום ברומיד.
      3. מגדלים את התרבית ב-30 מעלות צלזיוס עד לשלב האקספוננציאלי / נייח המאוחר (OD₆₀₀ ~ 1).
      4. יש לדלל 1:1,000 ב-YPD טרי עם 0.25% אתידיום ברומיד ולחזור על הפעולה פעמיים.
      5. ברגע שהתרבית מגיעה לשלב אקספוננציאלי מאוחר/נייח מוקדם (OD₆₀₀ 0.8-1.2), צלחת למושבות בודדות על ידי דילול 1:10,000 במים סטריליים וציפוי 50 מיקרוליטר על צלחת YPD. לאחר גידול במשך 3 ימים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, בחרו מספר מושבות ובדקו כל אחת מהן לאי יכולת נשימה על ידי בחינת יכולתן לגדול למושבות גלויות על צלחות YP-Glycerol לאחר 7 ימים.
   2. בצע ציטודוקציה ראשונית ל-BY4742.
      1. ערבבו תאים של הזן התורם BY4741 המכיל מצב פנוטיפי יציב עם תאים של הזן הנאיבי BY4742 kar1-15 על פני צלחת אגר YPD.
      2. גדל במשך 24 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-CO₂ אטמוספרי (407.05 חלקים למיליון) והעביר למדיום נשירה של מתיונין המכיל גליצרול (SGly-MET: 0.74 גרם CSM-MET, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 מ"ל גליצרול ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר).
         הערה: זה בוחר עבור שני הסמנים הגרעיניים BY4742, יחד עם מתן אפשרות לשיקום המיטוכונדריה התפקודית באמצעות חילופי ציטופלזמה.
      3. לאחר 3-5 ימים, בחרו מספר מושבות בודדות ובצעו סבב סלקציה נוסף על SD-MET (0.74 גרם CSM-MET, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר ל-1 ליטר).
      4. במקביל, ודא שהמושבות אינן דיפלואידיות על ידי מעבר על מדיום SD-LYS-MET.
   3. בצע ציטודוקציות הפוכות.
      1. ערבבו את זני התורמים החדשים (הפעם, הציטודוקטנטים המוצלחים BY4742 kar1-15) עם תאי BY4741 נאיביים קטנים (שנוצרו כאמור לעיל) על אגר YPD.
      2. חזור על ציטודוקציות, כמתואר קודם לכן (שלבים 2.3.2.1-2.3.2.4), למעט בחירה עבור סמנים גרעיניים של מקבל BY4741 על מדיום גליצרול חסר ליזין (SGly-LYS: 0.74 גרם CSM-LYS, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 20 מ"ל גליצרול ו-20 גרם אגר לכל 1 ליטר).
      3. בחר מספר ציטודוקטנטים ובדוק שמירה על מצבים פנוטיפיים יציבים באמצעות בדיקת הגדילה, כמו קודם בשלב 1.13.
4. טרנספורמציה של חלבון.
   1. הכן את הליזאט.
      1. גדל 50 מ"ל של תאים המכילים מצבים פנוטיפיים יציבים ב-YPD למשך 18 שעות ב-30 מעלות צלזיוס.
      2. גלולה את התרביות ב-3,000 x גרם למשך 4 דקות ולאחר מכן שטפו פעמיים: פעם אחת ב-H₂O חיטוי ולאחר מכן ב-1 M סורביטול.
      3. השעו מחדש את התאים ב-200 מ"ל של מאגר SCE (1 מ"מ סורביטול, 10 מ"מ EDTA, 10 מ"מ DTT, 100 מ"מ נתרן ציטראט וטבליה אחת של מעכב פרוטאז מיני ללא EDTA לכל 50 מ"ל, pH 5.8) עם 50 U/mL של אנזים ליטי שמרים 100T.
      4. דגרו את התערובת בחום של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      5. סוניקציה של התאים ב-20 קילו-הרץ ובעוצמה של 20% למשך 10 שניות על קרח עם דיסמברטור קולי.
      6. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      7. העבירו את הסופרנטנטים לצינור נקי והוסיפו RNase I ו-DNase ביוטיניל בעודף של פי 3 (כפי שנקבע על ידי יחידות פעילות) ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
      8. הסר את ה-DNase I על ידי הוספת עודף חרוזי סטרפטווידין-אגרוז, דגירה למשך 5 דקות וגלולה על ידי צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 1.5 דקות.
      9. העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי.
   2. הכן את הספרופלסט המקבל.
      1. גדל 5 מ"ל של תאי נמען נאיביים ב-YPD עד אמצע השלב האקספוננציאלי (OD₆₀₀ שנע בין 0.5-1).
      2. קציר על ידי צנטריפוגה (3,000 x גרם למשך 4 דקות) ושטוף 4 פעמים: פעמיים ב- H₂O ופעמיים ב- 1 M סורביטול.
      3. השעו מחדש את התאים בסורביטול 1 M המכיל 200 U/mL אנזים ליטי שמרים ודגרו למשך 15 דקות ב-35 מעלות צלזיוס כדי לעכל את דפנות התא.
      4. קצרו את הספרופלסטים המתקבלים עם צנטריפוגה עדינה ב-600 x גרם למשך 5 דקות ושטפו עם 1 מ"ל של 1 מ"ל של 1 מ"ל סורביטול ולאחר מכן שוב עם 1 מ"ל של מאגר STC (1 מ"מ סורביטול, 10 מ"מ טריס pH 7.5 ו-10 מ"מ CaCl₂).
      5. השעו מחדש את הספרופלסטים השטופים ב-50 מיקרוליטר של מאגר STC.
         הערה: השתמש במספריים כדי לחתוך את ~0.7 ס"מ האחרון של קצה פיפטה; זה ייצור פה רחב יותר וימנע ליזה של הספרופלסטים.
   3. הפוך את התאים הנאיביים עם חלבון.
      1. הפוך 50 מיקרוליטר של aliquots ספרופלסט עם 50 מיקרוליטר של ליזאט תורם, 20 מיקרוליטר של DNA זרע סלמון (2 מ"ג/מ"ל) ו-5 מיקרוליטר של פלסמיד בחירה המסומן ב-URA3 (למשל, pAG426-GFP)^28,33.
      2. דגרו את התערובת בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-600 x g כדי לאסוף את הספרופלסטים ולהשעות מחדש ב-150 מיקרוליטר של מאגר SOS (1 M סורביטול, 7 מ"מ CaCl₂, 0.25% תמצית שמרים ו-0.5% פפטון).
      4. יש להתאושש למשך 30 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
      5. צלחת את כל התרבות על צלחות SD-URA.
      6. כסה במהירות את התרבית המצופה ב-SD-URA חם (~45 מעלות צלזיוס) המכיל 0.8% אגר.< > הערה: זה ימנע את התפוצצות הספרופלסטים
      7. דגרו את לוחות הטרנספורמציה למשך 2-3 ימים בחום של 30 מעלות צלזיוס.
      8. בעזרת קיסם, בחר בהצלחה תאים הגדלים מהצלחת המכוסה ופס מחדש למושבות בודדות על לוחות SD-URA.
      9. בחר עשרות מושבות לכל אחת ופס על 5-FOA לוחות כדי לחסל פלסמיד נשא המסומן ב-URA3.
      10. בחר מושבות הגדלות על לוחות 5-FOA ובדוק העברת מצבים פנוטיפיים יציבים באמצעות מבחן הגדילה, כמו קודם (שלב 1.13).

ביטוי יתר של חלבון ידוע כמשנה באופן דרמטי פנוטיפים תאיים27. ואכן, בגישת סינון ראשונית, מאות פנוטיפים חדשים שוחזרו באופן שחזורי מביטוי יתר של שיבוטים מהשמרים ORFeome באמצעות עשרה גורמי לחץ בלבד. עם זאת, הבדיקות שתוארו לעיל מאפשרות להעריך אם התאים שומרים על פנוטיפים יציבים לטווח ארוך בעקבות ביטוי יתר זה. חלבון אחד המסוגל לקודד מצב כזה הוא Psp1. Psp1 הוא חלבון בעל תפקוד לא ידוע שיכול לדכא מוטציות במנגנון השכפול (למשל, ב-pol alpha34). ביטוי יתר של PSP1 ORF מווסת פנוטיפים תאיים במגוון גורמי לחץ. באופן מדהים, פנוטיפ אחד (עמידות למנגן כלוריד) נשמר במשך מאות דורות בתאים זמן רב לאחר הפסקת ביטוי היתר (כלומר, צאצאים שמעולם לא חוו אינדוקציה ישירה של Psp1, אך אבותיהם חוו) (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A). זמן מחצית החיים של Psp1 הוא ~5 שעות35, מה שהופך את זה לבלתי סביר ביותר שפנוטיפ העמידות נובע מהתפשטות של חלבון Psp1 יציב ומאריך חיים מאמהות לבנותיהן לאורך ציר זמן זה (מכיוון שהחלבון המקורי יתפרק תוך קומץ דורות).

מכיוון שפנוטיפ ההתנגדות של MnCl2 הופיע בתדירות גבוהה ובמספר ניסויי ביטוי יתר חולפים עצמאיים, אין זה סביר שהפנוטיפ הזה נבע ממוטציה דה נובו. הסבר אפשרי לאופי התורשתי של פנוטיפ זה הוא אינדוקציה של אלמנט בעל תבניות עצמיות (כלומר, פריון). ואכן, תכולת חומצות האמינו Psp1 מכילה כמה רצועות קטנות של אספרגין וגלוטמין, המזכירות פריונים קנוניים כמו [PSI+], המונעים על ידי חלבונים המכילים רצועות ארוכות של חומצות אמינו אלה. אלגוריתמי חיזוי36 מדרגים את מסוף ה-N של Psp1 כ"דמוי פריון" במידה בינונית (איור 1B, דרגה 173 בפרוטאום השמרים). עם זאת, בניגוד לחלבוני פריון קנוניים, חלבון Psp1 מתאים המכילים את המצב הפנוטיפי היציב לא יצר סיבי עמילואיד, כפי שנשפט על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז למחצה28,37. כדי לקבוע אם Psp1 יצר פריון בתום לב, בדקנו אם דפוס התורשה של המצב הפנוטיפי המושרה על ידי Psp1 עולה בקנה אחד עם סימני ההיכר של ביולוגיה של פריונים: הסתמכות על מנגנון הומאוסטזיס חלבוני להתפשטות נאמנה ותורשה לא מנדלית במיוזה. לבסוף, בדיקת "תקן זהב" של העברה בוצעה באמצעות חלבון מורכב בלבד.

בניגוד למוטציות או צורות אחרות של תורשה אפיגנטית, פריונים מסתמכים באופן ייחודי על תפקודם של מלווים מולקולריים וזרועות אחרות של רשת ההומאוסטזיס של החלבון המווסתות את קיפול החלבון בתא. רוב הפריונים הקנוניים דורשים את ה-Hsp104 disaggregase כדי לפעול על סיבי העמילואיד שהם מאמצים. תהליך זה מייצר "זרעים" תורשתיים המעבירים את קונפורמציה הפריון מאמהות לבנות13. יוצא מן הכלל בולט אחד לדרישה זו הוא הפריון [ISP+], הניתן לריפוי באמצעות עיכוב Hsp104 אך אינו דורש את פעילותו הבלתי ניתנת לריפוי עבור התפשטות38. יתר על כן, אנו ואחרים דיווחנו לאחרונה על דוגמאות רבות של פריונים שאינם תלויים ב-Hsp104 ובמקום זאת מווסתים על ידי מלווים מולקולריים אחרים (בעיקר Hsp70 ובמקרים נדירים, Hsp90)25,28. תחילה בדקנו אם התורשה של עמידות MnCl2 המושרה על ידי Psp1 תלויה ב-Hsp104. תאים המכילים מצב זה הועברו 3 פעמים על מדיום עשיר (YPD) בתוספת מינון נמוך של גואנידין הידרוכלוריד (מעכב Hsp104). לאחר מכן החזרנו את התאים למדיום עשיר סטנדרטי כדי לשחזר את תפקוד Hsp104 המלא. משטר זה לא השפיע על התורשה של עמידות MnCl2 המושרה על ידי Psp1, וקבע כי המצב התאי אינו תלוי ב-Hsp104 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2).

לאחר מכן, נעשה שימוש בגישת חצייה כדי לבדוק אם המצב הפנוטיפי המושרה על ידי Psp1 תלוי ב-Hsp70. התאים העמידים ל-MnCl2 חוברו לזן חסר Hsp70, עם מחיקות גנטיות בשניים מתוך ארבעת הפרלוגים של שמרים Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ). דיפלואידים נבחרו ולאחר מכן נבגים ליצירת נבגים הפלואידים. בדקנו את שימור המצב התלוי ב-Psp1 ומצאנו שפנוטיפ ההתנגדות MnCl2 המושרה על ידי Psp1 בוטל לחלוטין בנבגים המכילים את המחיקה הכפולה ssa1Δ ssa2Δ (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2). לפיכך, המצב הפנוטיפי המושרה על ידי Psp1 דורש שהפעילות של Hsp70 תעבור מדור אחד למשנהו.

מאפיין מגדיר נוסף של פריונים הוא דפוס תורשה לא מנדליאני. תכונות המקודדות על ידי מוטציות ב-DNA מפרידות 2:2 בהכלאות מיוטיות: מחצית מהצאצאים יורשים אלל הורי אחד והמחצית השנייה יורשת את האלל ההורי השני. התורשה של פריונים, לעומת זאת, אינה תלויה בשינויים ב-DNA, אלא בשינויים הניתנים להעברה בקונפורמציה של החלבון. לפיכך, הם עוברים בתורשה על ידי רוב, אם לא כולם, צאצאים מיוטיים בהכלאות גנטיות (3:1 או 4:0 inheritance)39. בדקנו את דפוס התורשה של עמידות MnCl2 המושרה על ידי Psp1 על ידי הכלאה של זנים המכילים את המדינה לבקרות נאיביות מסוג ההזדווגות ההפוך. הדיפלואידים שהתקבלו נבגים ונבדקו לנוכחות פנוטיפ העמידות Psp1 MnCl2 בתוך נבגים שמקורם באותם טטרדים. כל הנבגים מ-2 טטרדות נפרדות שבהן הורה אחד החזיק את המצב האפיגנטי התלוי ב-Psp1 ירשו את פנוטיפ העמידות המתאים ל-MnCl2 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2). לעומת זאת, אף תא מצלבי בקרה נאיביים לא הציג את הפנוטיפ. נתונים אלה קובעים כי המצב הפנוטיפי המושרה על ידי Psp1 אינו מקודד על ידי מוטציה מבוססת DNA. עם זאת, חשוב לציין שבעוד שמצב Psp1 אינו מקודד ב-DNA, המצב דורש נוכחות מתמשכת של הגן PSP1. חציית המצב הפנוטיפי התלוי ב-Psp1 לרקע גנטי חסר הגן PSP1 (psp1Δ) חיסלה תורשתית את פנוטיפ העמידות ל-MnCl2 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2). לפיכך, ביטוי יתר של Psp1 אינו פשוט מתזמר את היווצרות לולאת משוב יציבה ביותר המתפקדת באופן אוטונומי של Psp1 לאחר התחלתה.

עצם ההגדרה של תורשה מבוססת חלבון היא העברת תכונות יציבות לצאצאים תוך שימוש רק בחלבון מורכב כחומר תורשתי. כדי לבצע "טרנספורמציות חלבון" כאלה, נעשה שימוש בשיטה אגנוסטית ביחס לסטוכיומטריה, שינוי או אינטראקציה של חלבון40,41. תרביות נפרדות של תאים המכילים את המצב הפנוטיפי המושרה על ידי Psp1 ובקרות נאיביות גדלו לשלב האקספוננציאלי האמצעי, ודפנות התאים שלהן עברו ליזה ליצירת ספרופלסטים תורמים. לאחר מכן הספרופלסטים הללו עברו סוניקציה וסובבו מטה כדי לגלול את פסולת התא שנוצרה. לבסוף, הליזטים הנותרים היו נתונים לעיכול יתר עם RNase ו-DNase כדי למגר את חומצת הגרעין (כדי לסייע בשלבים מאוחרים יותר בפרוטוקול, האנזים DNase הביוטיני הוסר לאחר מכן באמצעות טיהור זיקה).

ליזטים מדוללי חומצות גרעין אלה שימשו להתמרת תאים נאיביים. כדי לסייע בספיגת "זרעי חלבון" תורשתיים, דפנות התאים של הנמענים התמימים עוכלו אנזימטית לפני הטרנספורמציה. פלסמיד נשא המסומן ב-URA3 עם ליזטים של תורם החלבון נכלל גם הוא כדי לאפשר בחירת תאים המתאימים לספיגת חומר זר. הטרנספורמנטים צופו על מדיום חסר אורציל, נבחרו מושבות עמידות, והפלסמיד הנושא המסומן ב-URA3 הוסר על ידי גידול על 5-FOA. לאחר מכן נבחנה ההתנגדות של המושבות שנוצרו ל-MnCl2. באופן מדהים, למעלה ממחצית מהטרנספורמטורים שנבדקו נשאו התנגדות תורשתית ל-MnCl2 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3). לעומת זאת, אף תא שהשתנה עם ליזטים נאיביים לא הציג פנוטיפ כזה. חשוב לציין, יעילות זו נאספה מליזטים תאיים המבטאים רמות אנדוגניות של חלבון Psp1 (~340 מולקולות לתא). זה יעיל להפליא מהטרנספורמציה של פריונים שמרים אחרים, כגון [PSI+]. תוצאות אלה קובעות כי Psp1 מסוגל ליצור יסוד תורשתי מבוסס חלבון - "פריון" - הידוע מעתה והלאה בשם [PSP1+]. יתר על כן, טכניקת טרנספורמציה של חלבון המתוארת כאן מספיקה לבדיקת תורשה מבוססת חלבון שאינה עמילואידית, בלתי תלויה ב-Hsp104, באופן בעל תפוקה גבוהה.

<מחלקה חזקה="xfig">איור 1. ביטוי יתר חולף של PSP1 מניע התנגדות MnCl2 תורשתית. (A) גידול של זנים לא מושרים ([psp1-]) ו-Psp1 ([PSP1+]) ב-SD-CSM עם 10 מ"מ MnCl2. פסי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע משלושה שכפולים ביולוגיים. (B) משמאל: רצף חומצות האמינו הראשוניות של Psp1 מקבל ציון דומה מאוד לפריונים באלגוריתמים לחיזוי פריונים (PLAAC). מימין: ניתוח PLAAC מייצג עבור רוב החלבונים המעוררים ששוחזרו במסך שלנו לא חזה כמעט שום תכונות רצף משמעותיות דמויות פריון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2. תלות מלווה Psp1 ודפוס ירושה. גידול הזנים ב-SD-CSM עם 10 מ"מ MnCl2, מנורמל לבקרה נאיבית מקבילה [psp1-]. העיכוב של Hsp104 (GdnHCl "נרפא") אינו פוגע בעמידות MnCl2 התלויה ב-Psp1, בעוד שהסרת המלווה Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ) והגן PSP1 (psp1Δ) מבטלת את הפנוטיפ הזה באופן תורשתי. כל הנבגים מטטרדות בודדות של הכלאות בין זנים המכילים את המצב הפנוטיפי התלוי ב-Psp1 וזנים נאיביים מציגים עמידות ל-MnCl2, מה שמעיד על תורשה לא מנדליאנית (4:0) של הפנוטיפ (n=2 טטרדים). פסי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע משלושה שכפולים ביולוגיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3. העברת מצב פנוטיפי תלוי Psp1 באמצעות "זרעים" של חלבון תורשתי. שיעורי הדבקה לטרנספורמציה של חלבון בהשוואה ליזטים מדומים ([psp1-]) ו-[PSP1+] - המכילים ליזטים כחומר הניתן להעברה. הדבקה מחושבת כאחוז ההעברה חלקי כמות החלבון הזרוע בשימוש. למעלה מ-53% מהתאים הנאיביים שעברו טרנספורמציה עם זרעים [PSP1+] קיבלו את פנוטיפ ההתנגדות המתאים ל-MnCl2, בעוד שאף תא שהפך עם [psp1-] לא הראה עמידות ל-MnCl2 (p=7.4 x 10-4 על ידי מבחן ה-t של הסטודנט). קצב ההדבקה של פריון השמרים שאופיין בעבר [PSI+] מוצג באמצעות הקו האופקי המקווקו40. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

המחברים אין לחשוף.