A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

באופן כללי, כדי להבין אינטראקציות DNA- חלבון, assay Y1H היא המערכת המועדפת בהצלחה בשימוש במעבדה הגדרה ¹ . Assay בסיסי Y1H כוללת שני מרכיבים: א) כתב עם דנ"א של עניין בהצלחה משובטים במעלה הזרם של הגן קידוד חלבון הכתב; ו - ב) ביטוי ביטוי אשר יפיק חלבון היתוך בין TF של עניין ושדה ההפעלה שעתוק שעתוק (AD). ה- DNA של עניין הוא נפוץ המכונה "פתיון" בעוד חלבון היתוך המכונה "טרף". בשנים האחרונות, גרסאות מרובות של assay Y1H פותחו כדי להתאים לצרכים ספציפיים עם היתרונות שלהם ² . Assay Y1H הקיים יכול להיות מיושם בהצלחה לזהות ולאמת אינטראקציה של חלבון אחד בכל פעם עם הפיתיון DNA שלה, אבל חסר את היכולת לזהות אינטראקציות DNA חלבון heterodimeric או multimeric.

"השיטה המתוארת כאן היא גרסה שונה של Y1H הקיים החוקרים המאפשרים בו זמנית ללמוד חלבונים מרובים המחייבים את רצף ה- DNA שלהם היעד.המטרה של assay זה היא לבטא את החלבון של עניין עם תחום ההפעלה (pDEST22: TF) ולהעריך את ההפעלה של אזורי ה- DNA המועמד התמזגו לכתב בנוכחות ו / או היעדרות של שותף חלבון אינטראקציה (pDEST32ΔDBD-TF) במערכת שמרים.ה assay זה יאפשר לנו לקבוע אם האינטראקציה בין שני אלה חלבונים נדרשים להפעלת המטרה.זו מערכת תואמת שיבוט GATEWAY ולכן ניתן להשתמש בהגדרת מעבדה רגילה.זה מבוסס על שינוי ישיר, אשר מספק את הקלות של שיתוף טרנספורמציה של TFs שונים במערכת שמרים לכן, זוהי אסטרטגיה יתרון כדי לאמת את מתחמי חלבון מחייב את מטרות DNA אפשרי שלהם במבחנה מולקולרית ופונקציונלית אימות Fאו כל מערכת. טכניקות הנוכחי כגון טנדם זיקה טיהור (TAP) שיטות יקרים ועבודה אינטנסיבית, אך מאפשרים זיהוי של hetrocomplexes חלבון בקנה מידה גדול ^{3 , 4 , 5} . זה שונה שמרים אחד היברידית ניתן לבצע בהצלחה במסגרת מעבדה רגילה בקנה מידה קטן ( איור 1 ) והוא גם חסכוני. Assay Y1.5H יכול להקל על חוקרים ברחבי הקהילה לבדוק ולאמת את ההשערה שלהם לקראת הגדרת תפקידו של חלבון רב מחייב מורכבים היעד DNA משותף באמצעות מערכת heterologous. בהתבסס על הממצאים, ההשערה יכולה להיות מאומתת ב- vivo במערכת המחקר המועדפת. לאחרונה, השתמשנו בגישה זו כדי להגדיר את תפקידו של TF ואת אופן הפעולה שלה כדי להסדיר פריחה ב Arabidopsis ⁶ .

1. בניית וכתב פלסמיד ההכנה

1. PCR להגביר את אזורי האמרגן / "שברי" (רצוי ~ 250 - 500 BP) של ה- DNA היעד להיות מנותח עבור שיבוט נוסף לתוך וקטור כניסה באמצעות E. coli (TOP10).
2. עם אישור רצף, subclone שיבוט חיובי ב וקטור ביטוי pGLacZi תואם ⁷ כפי שתואר לעיל ^{8 , 9 , 10 , 11} .
3. לשנות את המתח שמרים עבור שילוב האמרגן (YM4271) על ידי רקומבינציה הומולוגיים של pGLacZi לייצר זן כתב השמרים כפי שתואר קודם לכן ^{12 , 13} . השינוי ואישור השלבים של זן שמרים עם אזור ה- DNA יחד עם המתכון של התקשורת לא מתואר כאן, כמו השלבים דומים פרוטוקול Y1H קלאסיהתחת = "xref"> 9 ^{, 10 , 11 , 12 , 13} . PEXP-AD502 שליטה פלסמיד ניתן להשתמש למטרות הנורמליזציה בעוד quantifiying β-galactosidase פעילות כפי שתואר לעיל ⁸ .
4. לשכפל את TF או חלבון של עניין ולאחר מכן לשכפל את השותף אינטראקציה חלבון לתוך pDEST22 ו pDEST32ΔDBD (pDEST32 מינוס DNA מחייב דומיין) ביטוי וקטורים. השברים המרה שמרן מקדם שיבוטים TF משמשים בהמשך בפרוטוקול.

2. השתנה Y1.5H פרוטוקול

1. ביום 1 (אחר הצהריים), להתחיל עם 5 מ"ל של תרבות SD-Ura מ צלחת פטרי או מלאי גליצרול ו דגירה לילה ב 30 ° C שייקר.
   הערה: תרבות זו ניתן להתחיל מ צלחת טרי מפוספס או ישירות מתוך 25% או 30% גליצרול המניות של שמריםלשכפל עם קטע ה- DNA.
2. ביום 2 (אחר הצהריים), לחסן 10 מ"ל של התקשורת YPDA עם 500 μL של תרבות לילה דגירה לילה ב 30 ° C שייקר.
3. יום 3 (מוקדם בבוקר וכל אחר הצהריים): הכינו תאים המוסמכים (מוקדם בבוקר).
   1. לחסן 100 מ"ל של התקשורת YPDA עם 2 מ"ל של תרבות לילה דגירה של 30 ° C שייקר. לגדל את התרבות הטרייה עד OD ₆₀₀ מגיע 0.4-0.8 (3-5 שעות).
      הערה: בדוק את OD ₆₀₀ של התרבות לילה ולוודא כי נקודת המוצא OD ₆₀₀ עבור שלב זה הוא 0.1 - 0.2. שימוש בתרבות מעל או מתחת לגיל יכול להאריך את הניסוי.
   2. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
   3. מחדש pellets ב 10 מ"ל של מים סטריליים באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה.
   4. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
   5. ReconstituTe ב 2 מ"ל של Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / ליתיום אצטט (LiAc) באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה.
      הערה: ראה מתכון TE / LiAc בטבלה 1 .
   6. צנטריפוגה במשך 5 דקות 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
   7. Re- להשעות גלולה ב 4 מ"ל של TE / LiAc + 400 μL של סלמון זרע DNA (10 מ"ג / מ"ל) pipetting למעלה ולמטה ולהמשיך לשלב הבא.
4. Co- טרנספורמציה: הלם חום התאים (מאוחר אחר הצהריים)
   1. להפיץ 20 μL של תאים לכל היטב צלחת 96-היטב ערבוב (U-bottom).
   2. הוסף 150 ng (~ 1.5 μL) כל אחד pDEST22: TF פלסמיד, pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד ו PEXP-AD502 בתוספת pDEST32ΔDBD: TF (בקרת נורמליזציה) לבארות.
      הערה: תוצאות אופטימליות צפויות עם ~ 150 ng כל אחד pDEST22: TF ו pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד להצלחה שיתוף השינוי. יכול להשתנות עם הבעות לבנות פלסמיד, ולכןצריך להיות מותאם עם כל ניסוי. עוד שליטה pDEST22-TF בתוספת pDEST32deltaDBD יכול גם להיכלל על פי שיקול דעתו של המשתמש.
   3. הוסף 100 μL של TE / LiAc / פוליאתילן גליקול (PEG) לכל טוב ( לערבב שלוש פעמים ).
      הערה: ראה מתכון TE / LiAc / PEG בטבלה 1 .
   4. מכסים את הצלחת עם חותם לנשימה ו דגירה של 20 - 30 דקות (יכול להיות ארוך) ב 30 מעלות צלזיוס (ללא צורך תסיסה).
   5. הלם חום במשך 20 דקות ( דווקא ) ב 42 ° C.
5. פלייט התאים.
   1. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant באמצעות פיפטה רב. הוסף 110 μL של TE ומערבבים.
   2. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר 100 μL של supernatant באמצעות פיפטה רב. Re- להשעות את גלולה עם האגרוף.
   3. העברת תאים על SD-Trp-Leu צלחות אגר. דגירה צלחותב 30 ° C עד לשלב הבא.
6. יום 5 (אחר הצהריים): להעביר את התאים על צלחות חדשות באמצעות פונצ'ר / משכפל microplate.
   1. ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבוב גם (U- תחתית) עם 50 μL של TE באמצעות פיפטה רב ערוצי. טרום רטוב את האגרוף ב TE.
      הערה: את puncher או את שכבת microplate צריך להיות מעוקרים לפני שלב זה ולאחר מכן מאוחר יותר בפרוטוקול. הדרך הנפוצה של מעקר אגרופים כגון טבילה אותו באתנול (100%, לא בכיתה ביולוגיה מולקולרית) ולאחר מכן שריפת אותו אל הלהבה ניתן ליישם. המתן 1 דקות כדי לצנן את הסיכות puncher.
      זהירות: אם ביצוע עיקור על הספסל; ודא הספסל הוא מראש לנקות עם אתנול ללא חומר דליק סביב. ללבוש ציוד מגן אישי אישי (PPE).
   2. פונץ מושבות מחדש להשעות צלחת TE- מלא.
      הערה: אם יש צמיחה חלקה על הצלחת, מושבות ניתן אגרוף ישירותכדי TE- מלא צלחת או לחילופין, מושבה אחת (במקרה של מושבות מרובות) יש לבחור באמצעות קיסם מעוקר לצלחת TE מלא ולאחר מכן אגרופים ניתן להשתמש לשלב הבא.
   3. להעביר אותם על חדש SD-Trp-Leu אגר צלחות עבור כיסוי משטח אופטימלי. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא.
7. יום 7 (אחר הצהריים): להתחיל תרבות למדוד פעילות β-galactosidase.
   1. ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבובית (U-bottom) עם 50 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב.
   2. ממלאים בלוק סטרילי 96-סטרילי היטב עם 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב.
   3. טרום רטוב את האגרוף בתקשורת ולהעביר מושבות מן הצלחת μL 50 של התקשורת.
   4. העברת 20 μL של שמרים ל 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת חותם את הבלוק עם חותם לנשימה. לִדגוֹרעבור 36 שעות ב 30 ° C שייקר.
8. יום 9 (בוקר): הפעל את התרבות למדידה אנזימטית.
   1. העברת 100 μL של התרבות 500 μL של התקשורת YPDA בבלוק מעוקרים היטב 96 היטב.
   2. מכסים את צלחת היטב מעוקר היטב עם חותם לנשימה ו דגירה של 3 - 5 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה בסל"ד 200 (עד ₆₀₀ OD 0.3-0.6).
   3. מחדש להשעות את התרבות ולהעביר 125 μL באמצעות פיפטה רב ערוצי על צלחת ספקטרופוטומטר (למדוד OD ₆₀₀ ).
      הערה: זהירות: לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות, אם OD ₆₀₀ הוא מתחת 0.3 - 0.6, דגירה התאים הנותרים עבור 1 - 2 שעות יותר על פי הקריאה. התרבות 125 μL בשימוש בשלב זה ניתן להשליך או להעביר לראש המקורי עמוק לחסום לפי שיקול דעתו של המשתמש.
   4. צנטריפוגה התאים הנותרים בבלוק היטב לעומק במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatanלא על ידי הפיכת.
   5. הוסף 200 μL של Z-buffer ו מערבולת.
      הערה: נא לראות את המתכון למאגר Z בטבלה 1 .
   6. צנטריפוגה 5 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant על ידי היפוך.
   7. הוסף 20 μL Z- חיץ ו מערבולת.
   8. מכסים את הצלחת עם רדיד איטום שיכול להתנגד להקפיא להפשיר מחזורי. בצע 4 מחזורים של הקפאה / הפשרה באמצעות חנקן נוזלי במכסה המנוע ולאחר מכן 42 מעלות צלזיוס באמבט מים (2 דקות כל אחד).
   9. הוספת 200 μL Z- חיץ / ביתא-mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) (12 מ"ל, 21 μL, 8.4 מ"ג בהתאמה תניב פתרון 20 מ"ל, תמיד להכין טרי ).
      הערה: ONPG ייקח קצת זמן כדי להמיס כראוי כדי להכין את הפתרון שעה לפני שמגיעים לשלב זה. ONPG משמש כמצע למדידת פעילות β-galactosidase.
   10. דגירה עד 17 - 24 שעות ב 30 ° C (לבדוק בין, אם צבע מפתחת קודם לכן יחסי ציבורלהמשיך לשלב הבא).
9. יום 10 (בוקר): עצור את התגובה למדוד.
   1. הוסף 110 μL 1M Na ₂ CO ₃ להפסיק את התגובה ואת זמן ההקלטה.
   2. וורטקס צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C.
   3. קח 125 μL של supernatant באמצעות multichannel ולמדוד OD ₄₂₀ .
      הערה: זהירות, לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות.
   4. חישוב פעילות β-gal: 1000 x OD ₄₂₀ / (time (min) x volume (mL) x OD ₆₀₀ בגיליון אלקטרוני.

הצלחת הכללית הגדרת הליך עבור שיתוף טרנספורמציה של אזורי ה- DNA בתאים שמרים עם חלבון של עניין ( איור 2 ). הצלחת הגדרת יכול להיות שונה בהתאם לצורך של הניסוי ומספר אזורי DNA / שברי נבדק. לאחר יום 5 של פרוטוקול צלחת טובה מבוגר חיובי צריך להיות גלוי כמו באיור 3 . במחקר שלנו, באזור היזם של 2600 BP במעלה הזרם מתחילת האתר שעתוק להתחיל היה מחולק לששה אזורים או שברי (FR 1-6) 6 . בדמות הייצוג ( איור 3 ), אזורי ה- DNA 1 ו 4 מראים אינטראקציה חיובית עם חלבון A ו- B קומפלקס. עם המדידה של פעילות β- galactosidase ( טבלה משלימה 1 ) רק קטע -1 מראה אינדוקציה ארבעה לקפל של פעילות הגן הכתב בעוד שבר 4 לא עבר את inte שלנוסף rnal של שני פי שניים.

איור 1: סקירה של השמרים שונה אחד היברידית (Y1.5H) assay. פריסת מתאר שלב אחר שלב ההליך של assay. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: ייצוג פשוט של הצלחת הגדרת עבור שיתוף טרנספורמציה של תאים שמרים עם חלבון (TF) של עניין. בשנת ניסוי כללי הגדרת, את הצלחת ניתן לארגן כפי שמוצג בתרשים. השילוב של מבנים ובקרות ניתן לשנות בהתאם לצורך והוא לחלוטין על פי שיקול דעתו של המשתמש.

איור 3: תמונה נציג של הצלחת החיובית (SD-Trp-Leu) לשכפל 1 לאחר שינוי מוצלח שיתוף. תוצאה דומה יש לראות עם משכפל יותר. שבר 1-6 מייצג אזור DNA; אין שבר הוא שליטה שלילית.

חיץ TE 10X (10ml)
רצוי	מהמלאי
100mM Tris-Cl (pH8.0)	1mL של טריס 1M
10 מ"מ EDTA (pH8.0)	200uL של EDTA 0.5M
להמציא נפח עם מים
TE / LiAc (10 מ"ל)
<strOng> רצוי	מהמלאי
1X	1mL TE 10X
0.1M LiAc	1mL LiAc 1M
להמציא נפח עם מים
TE / LiAc / PEG (50 מ"ל)
רצוי	מהמלאי
1X	5 מ"ל TE 10X
0.1M LiAc	5 מ"ל LiAc 1M
40 מ"ל PEG3350 50%
Z-buffer (1L) pH 7.0
Na 2 HPO 4 16.1 גרם של heptahydrated או 8.52g של מימיך
NaH 2 PO 4 5.5 גרם של hydrated או 4G של מים מתוקים
KCl 0.75g
MGSO 4 0.246g של התייבשות או 0.12g של נטול
לשמור על ה- pH עם HCL
הערה:
כל soultized הם sterlized לפני השימוש.
מדיה ו אגר צלחות בשימוש בפרוטוקול (YPDA, SD-Ura, SD-Trp-Ura ו- SD-Trp- אורה צלחות אגר) בצע את המתכון אותו כמו Y1H

טבלה 1: המתכון לפתרונות המשמשים בפרוטוקול. הטבלה מספקת את המתכון למלאי ופתרונות עבודה של המאגרים העיקריים המשמשים את assay.

טבלה 1: β-galactosidase פעילות המדידה. גיליון גיליון אלקטרוני המוצג כאן יכול לשמש כתבנית למדידת פעילות β-galactosidase באמצעות הנוסחה ניתנה בפרוטוקול. קומבייןAtion של מבנים יכול להיות שונה בהתאם לשיקול דעתו של המשתמש. לחץ כאן להורדת הקובץ.

המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.