מאמר שיטה

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56080

⸱

24 ביולי 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Southern California, 2Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego

במאמר זה

סיכום

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

תקציר

במהלך השנים, השמרים assay אחת היברידית הוכיחה להיות טכניקה חשובה לזיהוי ואימות של אינטראקציות פיזיות בין חלבונים כגון גורמי שעתוק (TFs) ואת יעד ה- DNA שלהם. השיטה המוצגת כאן מנצל את המושג הבסיסי של Y1H אבל הוא שונה עוד יותר ללמוד ולאמת מתחמי חלבון מחייב את ה- DNA היעד שלהם. לפיכך, הוא מכונה שמרים שונה אחד היברידית (Y1.5H) assay. Assay זה הוא חסכוני וניתן לבצע בקלות במסגרת מעבדה רגילה. אם כי באמצעות מערכת heterologous, השיטה המתוארת יכול להיות כלי רב ערך כדי לבדוק ולאמת את החלבון heteromeric מורכבים מחייב יעד ה- DNA שלהם (ים) עבור גנומיקה תפקודית בכל מערכת של מחקר, במיוחד גנומיקה הצמח.

מבוא

באופן כללי, כדי להבין אינטראקציות DNA- חלבון, assay Y1H היא המערכת המועדפת בהצלחה בשימוש במעבדה הגדרה 1 . Assay בסיסי Y1H כוללת שני מרכיבים: א) כתב עם דנ"א של עניין בהצלחה משובטים במעלה הזרם של הגן קידוד חלבון הכתב; ו - ב) ביטוי ביטוי אשר יפיק חלבון היתוך בין TF של עניין ושדה ההפעלה שעתוק שעתוק (AD). ה- DNA של עניין הוא נפוץ המכונה "פתיון" בעוד חלבון היתוך המכונה "טרף". בשנים האחרונות, גרסאות מרובות של assay Y1H פותחו כדי להתאים לצרכים ספציפיים עם היתרונות שלהם 2 . Assay Y1H הקיים יכול להיות מיושם בהצלחה לזהות ולאמת אינטראקציה של חלבון אחד בכל פעם עם הפיתיון DNA שלה, אבל חסר את היכולת לזהות אינטראקציות DNA חלבון heterodimeric או multimeric.

"השיטה המתוארת כאן היא גרסה שונה של Y1H הקיים החוקרים המאפשרים בו זמנית ללמוד חלבונים מרובים המחייבים את רצף ה- DNA שלהם היעד.המטרה של assay זה היא לבטא את החלבון של עניין עם תחום ההפעלה (pDEST22: TF) ולהעריך את ההפעלה של אזורי ה- DNA המועמד התמזגו לכתב בנוכחות ו / או היעדרות של שותף חלבון אינטראקציה (pDEST32ΔDBD-TF) במערכת שמרים.ה assay זה יאפשר לנו לקבוע אם האינטראקציה בין שני אלה חלבונים נדרשים להפעלת המטרה.זו מערכת תואמת שיבוט GATEWAY ולכן ניתן להשתמש בהגדרת מעבדה רגילה.זה מבוסס על שינוי ישיר, אשר מספק את הקלות של שיתוף טרנספורמציה של TFs שונים במערכת שמרים לכן, זוהי אסטרטגיה יתרון כדי לאמת את מתחמי חלבון מחייב את מטרות DNA אפשרי שלהם במבחנה מולקולרית ופונקציונלית אימות Fאו כל מערכת. טכניקות הנוכחי כגון טנדם זיקה טיהור (TAP) שיטות יקרים ועבודה אינטנסיבית, אך מאפשרים זיהוי של hetrocomplexes חלבון בקנה מידה גדול 3 , 4 , 5 . זה שונה שמרים אחד היברידית ניתן לבצע בהצלחה במסגרת מעבדה רגילה בקנה מידה קטן ( איור 1 ) והוא גם חסכוני. Assay Y1.5H יכול להקל על חוקרים ברחבי הקהילה לבדוק ולאמת את ההשערה שלהם לקראת הגדרת תפקידו של חלבון רב מחייב מורכבים היעד DNA משותף באמצעות מערכת heterologous. בהתבסס על הממצאים, ההשערה יכולה להיות מאומתת ב- vivo במערכת המחקר המועדפת. לאחרונה, השתמשנו בגישה זו כדי להגדיר את תפקידו של TF ואת אופן הפעולה שלה כדי להסדיר פריחה ב Arabidopsis 6 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בניית וכתב פלסמיד ההכנה

  1. PCR להגביר את אזורי האמרגן / "שברי" (רצוי ~ 250 - 500 BP) של ה- DNA היעד להיות מנותח עבור שיבוט נוסף לתוך וקטור כניסה באמצעות E. coli (TOP10).
  2. עם אישור רצף, subclone שיבוט חיובי ב וקטור ביטוי pGLacZi תואם 7 כפי שתואר לעיל 8 , 9 , 10 , 11 .
  3. לשנות את המתח שמרים עבור שילוב האמרגן (YM4271) על ידי רקומבינציה הומולוגיים של pGLacZi לייצר זן כתב השמרים כפי שתואר קודם לכן 12 , 13 . השינוי ואישור השלבים של זן שמרים עם אזור ה- DNA יחד עם המתכון של התקשורת לא מתואר כאן, כמו השלבים דומים פרוטוקול Y1H קלאסיהתחת = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . PEXP-AD502 שליטה פלסמיד ניתן להשתמש למטרות הנורמליזציה בעוד quantifiying β-galactosidase פעילות כפי שתואר לעיל 8 .
  4. לשכפל את TF או חלבון של עניין ולאחר מכן לשכפל את השותף אינטראקציה חלבון לתוך pDEST22 ו pDEST32ΔDBD (pDEST32 מינוס DNA מחייב דומיין) ביטוי וקטורים. השברים המרה שמרן מקדם שיבוטים TF משמשים בהמשך בפרוטוקול.

2. השתנה Y1.5H פרוטוקול

  1. ביום 1 (אחר הצהריים), להתחיל עם 5 מ"ל של תרבות SD-Ura מ צלחת פטרי או מלאי גליצרול ו דגירה לילה ב 30 ° C שייקר.
    הערה: תרבות זו ניתן להתחיל מ צלחת טרי מפוספס או ישירות מתוך 25% או 30% גליצרול המניות של שמריםלשכפל עם קטע ה- DNA.
  2. ביום 2 (אחר הצהריים), לחסן 10 מ"ל של התקשורת YPDA עם 500 μL של תרבות לילה דגירה לילה ב 30 ° C שייקר.
  3. יום 3 (מוקדם בבוקר וכל אחר הצהריים): הכינו תאים המוסמכים (מוקדם בבוקר).
    1. לחסן 100 מ"ל של התקשורת YPDA עם 2 מ"ל של תרבות לילה דגירה של 30 ° C שייקר. לגדל את התרבות הטרייה עד OD 600 מגיע 0.4-0.8 (3-5 שעות).
      הערה: בדוק את OD 600 של התרבות לילה ולוודא כי נקודת המוצא OD 600 עבור שלב זה הוא 0.1 - 0.2. שימוש בתרבות מעל או מתחת לגיל יכול להאריך את הניסוי.
    2. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
    3. מחדש pellets ב 10 מ"ל של מים סטריליים באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה.
    4. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
    5. ReconstituTe ב 2 מ"ל של Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / ליתיום אצטט (LiAc) באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה.
      הערה: ראה מתכון TE / LiAc בטבלה 1 .
    6. צנטריפוגה במשך 5 דקות 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
    7. Re- להשעות גלולה ב 4 מ"ל של TE / LiAc + 400 μL של סלמון זרע DNA (10 מ"ג / מ"ל) pipetting למעלה ולמטה ולהמשיך לשלב הבא.
  4. Co- טרנספורמציה: הלם חום התאים (מאוחר אחר הצהריים)
    1. להפיץ 20 μL של תאים לכל היטב צלחת 96-היטב ערבוב (U-bottom).
    2. הוסף 150 ng (~ 1.5 μL) כל אחד pDEST22: TF פלסמיד, pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד ו PEXP-AD502 בתוספת pDEST32ΔDBD: TF (בקרת נורמליזציה) לבארות.
      הערה: תוצאות אופטימליות צפויות עם ~ 150 ng כל אחד pDEST22: TF ו pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד להצלחה שיתוף השינוי. יכול להשתנות עם הבעות לבנות פלסמיד, ולכןצריך להיות מותאם עם כל ניסוי. עוד שליטה pDEST22-TF בתוספת pDEST32deltaDBD יכול גם להיכלל על פי שיקול דעתו של המשתמש.
    3. הוסף 100 μL של TE / LiAc / פוליאתילן גליקול (PEG) לכל טוב ( לערבב שלוש פעמים ).
      הערה: ראה מתכון TE / LiAc / PEG בטבלה 1 .
    4. מכסים את הצלחת עם חותם לנשימה ו דגירה של 20 - 30 דקות (יכול להיות ארוך) ב 30 מעלות צלזיוס (ללא צורך תסיסה).
    5. הלם חום במשך 20 דקות ( דווקא ) ב 42 ° C.
  5. פלייט התאים.
    1. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant באמצעות פיפטה רב. הוסף 110 μL של TE ומערבבים.
    2. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר 100 μL של supernatant באמצעות פיפטה רב. Re- להשעות את גלולה עם האגרוף.
    3. העברת תאים על SD-Trp-Leu צלחות אגר. דגירה צלחותב 30 ° C עד לשלב הבא.
  6. יום 5 (אחר הצהריים): להעביר את התאים על צלחות חדשות באמצעות פונצ'ר / משכפל microplate.
    1. ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבוב גם (U- תחתית) עם 50 μL של TE באמצעות פיפטה רב ערוצי. טרום רטוב את האגרוף ב TE.
      הערה: את puncher או את שכבת microplate צריך להיות מעוקרים לפני שלב זה ולאחר מכן מאוחר יותר בפרוטוקול. הדרך הנפוצה של מעקר אגרופים כגון טבילה אותו באתנול (100%, לא בכיתה ביולוגיה מולקולרית) ולאחר מכן שריפת אותו אל הלהבה ניתן ליישם. המתן 1 דקות כדי לצנן את הסיכות puncher.
      זהירות: אם ביצוע עיקור על הספסל; ודא הספסל הוא מראש לנקות עם אתנול ללא חומר דליק סביב. ללבוש ציוד מגן אישי אישי (PPE).
    2. פונץ מושבות מחדש להשעות צלחת TE- מלא.
      הערה: אם יש צמיחה חלקה על הצלחת, מושבות ניתן אגרוף ישירותכדי TE- מלא צלחת או לחילופין, מושבה אחת (במקרה של מושבות מרובות) יש לבחור באמצעות קיסם מעוקר לצלחת TE מלא ולאחר מכן אגרופים ניתן להשתמש לשלב הבא.
    3. להעביר אותם על חדש SD-Trp-Leu אגר צלחות עבור כיסוי משטח אופטימלי. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא.
  7. יום 7 (אחר הצהריים): להתחיל תרבות למדוד פעילות β-galactosidase.
    1. ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבובית (U-bottom) עם 50 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב.
    2. ממלאים בלוק סטרילי 96-סטרילי היטב עם 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב.
    3. טרום רטוב את האגרוף בתקשורת ולהעביר מושבות מן הצלחת μL 50 של התקשורת.
    4. העברת 20 μL של שמרים ל 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת חותם את הבלוק עם חותם לנשימה. לִדגוֹרעבור 36 שעות ב 30 ° C שייקר.
  8. יום 9 (בוקר): הפעל את התרבות למדידה אנזימטית.
    1. העברת 100 μL של התרבות 500 μL של התקשורת YPDA בבלוק מעוקרים היטב 96 היטב.
    2. מכסים את צלחת היטב מעוקר היטב עם חותם לנשימה ו דגירה של 3 - 5 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה בסל"ד 200 (עד 600 OD 0.3-0.6).
    3. מחדש להשעות את התרבות ולהעביר 125 μL באמצעות פיפטה רב ערוצי על צלחת ספקטרופוטומטר (למדוד OD 600 ).
      הערה: זהירות: לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות, אם OD 600 הוא מתחת 0.3 - 0.6, דגירה התאים הנותרים עבור 1 - 2 שעות יותר על פי הקריאה. התרבות 125 μL בשימוש בשלב זה ניתן להשליך או להעביר לראש המקורי עמוק לחסום לפי שיקול דעתו של המשתמש.
    4. צנטריפוגה התאים הנותרים בבלוק היטב לעומק במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatanלא על ידי הפיכת.
    5. הוסף 200 μL של Z-buffer ו מערבולת.
      הערה: נא לראות את המתכון למאגר Z בטבלה 1 .
    6. צנטריפוגה 5 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant על ידי היפוך.
    7. הוסף 20 μL Z- חיץ ו מערבולת.
    8. מכסים את הצלחת עם רדיד איטום שיכול להתנגד להקפיא להפשיר מחזורי. בצע 4 מחזורים של הקפאה / הפשרה באמצעות חנקן נוזלי במכסה המנוע ולאחר מכן 42 מעלות צלזיוס באמבט מים (2 דקות כל אחד).
    9. הוספת 200 μL Z- חיץ / ביתא-mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) (12 מ"ל, 21 μL, 8.4 מ"ג בהתאמה תניב פתרון 20 מ"ל, תמיד להכין טרי ).
      הערה: ONPG ייקח קצת זמן כדי להמיס כראוי כדי להכין את הפתרון שעה לפני שמגיעים לשלב זה. ONPG משמש כמצע למדידת פעילות β-galactosidase.
    10. דגירה עד 17 - 24 שעות ב 30 ° C (לבדוק בין, אם צבע מפתחת קודם לכן יחסי ציבורלהמשיך לשלב הבא).
  9. יום 10 (בוקר): עצור את התגובה למדוד.
    1. הוסף 110 μL 1M Na 2 CO 3 להפסיק את התגובה ואת זמן ההקלטה.
    2. וורטקס צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C.
    3. קח 125 μL של supernatant באמצעות multichannel ולמדוד OD 420 .
      הערה: זהירות, לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות.
    4. חישוב פעילות β-gal: 1000 x OD 420 / (time (min) x volume (mL) x OD 600 בגיליון אלקטרוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הצלחת הכללית הגדרת הליך עבור שיתוף טרנספורמציה של אזורי ה- DNA בתאים שמרים עם חלבון של עניין ( איור 2 ). הצלחת הגדרת יכול להיות שונה בהתאם לצורך של הניסוי ומספר אזורי DNA / שברי נבדק. לאחר יום 5 של פרוטוקול צלחת טובה מבוגר חיובי צריך להיות גלוי כמו באיור 3 . במחקר שלנו, באזור היזם של 2600 BP במעלה הזרם מתחילת האתר שעתוק להתחיל היה מחולק לששה אזורים או שברי (FR 1-6) 6

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההליך הסטנדרטי הקיים של Y1H מתאים לזיהוי טרף חלבון בודד המחייב את הפיתיון הדנ"א שלו. עם שינויים טכניים שונים, המערכת הקיימת כבר רתמה להגדרת רשתות רגולטוריות תמלוליות. עם זאת, TFs ידועים לתפקד כחלק ממכלול מורכב של שניים או יותר TFs או חלבונים, עם רק חלק TF מסוגל לחייב את ה- DNA. חלבונים או TFs אשר מחזיקים רק את תחומים מחייב חלבון וחסרים את היכולת לקשור ד.נ.א. נוטים יותר לעבוד במכלול, עדיף עם TF כי הוא מסוגל מחייב את הדנ"א. תפוקה גבוהה המסכים באמצעות Y1H המסורתית מדי פעם מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לס"ס ואנג, מ 'עמר וא' גאלה לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרסים RO1GM067837 ו RO1GM056006 (כדי SAK). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת מערכת היברידית pDEST22 וקטורInvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two ערכת מערכת היברידית
pDEST32delatDBDInvitrogenPQ1000102Pro-Quest Two; ערכת מערכת היברידית זו השתנתה. זה pDEST32 מינוס דומיין מחייב DNA
pENTR/D-TOPO ערכת שיבוטInvitrogenK240020
YM4271 זןClontechK1603-1MATCHMAKER מערכת היברידית
אחת pEXP-AD502InvitrogenPQ1000101Pro-Quest ערכת מערכת היברידית
שתיים GATEWAY LR Clonase II תערובת אנזימיםInvitrogen11791020
YPDA mediaClontech630410
SD-AgarClontech630412
SD מינימלי מדיהClontech630411
Uracil DO תוסףClontech630416
טריפטופן Do תוסףClontech630413
TrisBase Fisher ScientificBP152-1
EDTAFisher ScientificS311-500
LiAcSigma-AldrichL4158
Saplmon זרע (10 מ"ג/מ"ל)Invitrogen15632011
96 צלחת תחתונה עגולההיטב Greiner bio-one650101
PEG3350 Sigma-Aldrich1546547
96 בלוק באר עמוקUSA Scientific1896-2000
רדיד אטוםארה"ב סיינטיפיק2923-0110
ArasealExcel ScientificB-100
2-mercaptoethanolפישר סיינטיפיק034461-100
ONPGסיגמא-אולדריץ'73660
Na2CO3Sigma-Aldrich223484
Na2HPO4 סיגמא-אולדריץ'S3264
NaH2PO4 סיגמא-אולדריץ'S3139
KCLפישר סיינטיפיקBP366-500
MgSO4 Sigma-Aldrich83266
HCLFisher ScientificSA54-4
DrybathThermo Fischer
VoretxThermo Fischer
CentrifgueEppendorfצנטריפוגה 5810R
קורא צלחותמכשירSPECTRAMAX PLUS ספקטרופוטומטר
מיקרופלייטאינקובטורתרמו פישרדגם מס' 5250- 37 מעלות, 6250-30 מעלות
שייקר אינקובטוראמבט מים ניו ברונסוויק
תרמו פישראיזוטמפ 205
פאנצ'ר
50 מ"ל פאלוקןBD פלקון
Nalgene
בקבוקNalgene
פלטות (150 מ"מ)גריינר ביו-וואן
ערכת מערכת היברידית מולקולרי

מקורות

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SD

מאמרים קשורים