הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56089

⸱

13 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Miami, 2Department of Medicine, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול עבור ויזואליזציה של אינסולין אקסוציטוזה ב איים שלמים באמצעות pHluorin, חלבון פלואורסצנטי ירוק pH-רגיש. איים מבודדים נגועים עם אדנו קידוד pHluorin מצמידים את שלפוחית מטען neuropeptide Y. דבר זה מאפשר הזיהוי של אינסולין גרגר פיוז'ן אירועים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

תקציר

הפרשת אינסולין ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס גלוקוז בתנאים רגילים פיזיולוגיים כמו גם כמו מחלה. לגישות ללמוד אקסוציטוזה גרגר אינסולין שאו להשתמש אלקטרופיזיולוגיה או מיקרוסקופ מצמידים את הביטוי של עיתונאים פלורסנט. עם זאת רוב שיטות אלה מוטבו עבור שורות תאים המשובטים או לדרוש בריא לנגרהנס. לעומת זאת, השיטה המובאת כאן מאפשר הדמיה בזמן אמת של אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב לנגרהנס ללא פגע. ב פרוטוקול זה, נתאר תחילה זיהום נגיפי של איים מבודדים הלבלב עם אדנו מקודד רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), pHluorin, מצמידים neuropeptide Y (NPY). שנית, אנו מתארים את קונאפוקלית הדמיה של איים קטנים חמישה ימים לאחר זיהום נגיפי, וכיצד לעקוב גרגר הפרשת אינסולין. בקצרה, איים נגועים מונחת על coverslip על חדר הדמיה, עם תמונה תחת זקוף לסריקת לייזר קונפוקלי במיקרוסקופ תוך כדי להיות perfused ללא הרף עם פתרון חוץ-תאית שמכילה גירויים שונים. תמונות קונאפוקלית פורש 50 מיקרומטר של איון נרכשים כמו בצילום מואץ הקלטות באמצעות סורק מהיר-תהודה. היתוך גרעיני של אינסולין בגרגרים עם קרום פלזמה ניתן בעקבות לאורך זמן. הליך זה גם מאפשר בדיקה סוללה של גירויים בניסוי יחיד תואם גם העכבר וגם איונים האנושית, יכול להיות משולב עם צבעים שונים עבור הדמיה תפקודית (למשל, ממברנה סידן פוטנציאליים או cytosolic צבע).

מבוא

האינסולין המיוצר על ידי תאי ביתא הלבלב איון, וזה המפתח מווסת של מטבוליזם של גלוקוז1. מוות או תפקוד לקוי של תאי הבטא מפריע גלוקוז הומאוסטזיס ומוביל סוכרת2. אינסולין ארוזה בגרגרים ליבה צפופה שפורסמו ב Ca2 +-אופן התלויים3. שחקרתי כמה אינסולין גרגר אקסוציטוזה מוסדר חיוני להבין באופן מלא את מה קובע את הפרשת האינסולין, פותח דרכים חדשות לזיהוי מטרות טיפולית חדשנית לטיפול בסוכרת.

אינסולין אקסוציטוזה נחקרה בהרחבה שימוש בגישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון מידות קיבול הממברנה, וגישות מיקרוסקופיים בשילוב עם מולקולות פלורסנט. מידות קיבול הממברנה יש רזולוציה טמפורלית טובים ומאפשרים הקלטות תא בודד. עם זאת, שינויים קיבוליות שישקפו את השינוי השטח נטו של התא ולא ללכוד אירועים בודדים פיוז'ן או להבדיל אינסולין פיוז'ן גרגר אחרים שלפוחית הפרשה ללא אינסולין3. גישות מיקרוסקופיים, כגון השתקפות פנימית שני הפוטונים או סכום מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) בשילוב עם הגששים פלורסנט וחלבונים מטען שלפוחית, לספק פרטים נוספים. טכניקות אלה ללכוד אירועים exocytotic יחיד, גם בשלבים שלפני, פוסט-exocytotic והוא יכול לשמש ללימוד דפוסי exocytotic באוכלוסיות של תאים3.

כתבים פלורסנט יכולה להיות משלושה סוגים: 1) חוץ-תאית, cytoplasmic 2) או 3) vesicular. 1) הכתבים חוץ-תאית, המשדרים קוטבי (למשל, dextrans, sulforhodamine B (SRB), לוציפר צהוב, pyranine) זה יכול להיות מוצג דרך חצרו חוץ-תאית4. השימוש של המשדרים קוטבי מאפשר החקירה של הנקבובית פיוז'ן בקרב אוכלוסיה של תאים ו לוכדת מבנים המערכת שונים כגון כלי דם. עם זאת, הם אינם מדווחים על התנהגות מטען שלפוחית. 2) הכתבים cytoplasmic, פלורסנט הגששים מצמידים חלבוני ממברנה-הקשורים פנים הציטופלסמה, מעורבים עגינה והוצאה אקסוציטוזה. דוגמאות כוללות את בני מסיסים N- ethylmaleimide רגיש גורם מצורף חלבון קולטן (מוקש) משפחת בהן השתמשו בהצלחה במדעי המוח ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר5. חלבונים כאלה יש שותפים איגוד מרובים ואינם אינסולין-גרגר ספציפיים. 3) הכתבים vesicular, פלורסנט הגששים התמזגו חלבונים מטען vesicular לאפשר חקירת התנהגות ספציפית מטען שלפוחית. אינסולין-גרגר מטען מסוים חלבונים כוללים אינסולין, c-פפטיד, איון מפוליפפטיד עמילואיד NPY בין היתר6,7. NPY רק נוכח אינסולין המכיל גרגירים, שיתוף שוחרר עם אינסולין, שהופך אותו שותף מצוין כתב פלורסנט8.

היתוך גרעיני של שונה פלורסנט חלבונים כדי NPY כבר מועסקים בעבר לחקור היבטים שונים של אקסוציטוזה תאים נוירואנדוקריניים, כגון הדרישה של synaptotagmin ספציפיים איזופורמים9,10 וכיצד זמן-קורס של שחרור תלוי על שלד התא של אקטין צולבות הקישור חוטים שרירן II11,12. במחקר זה, בחרנו pHluorin כמו הכתבת פלורסנט, אשר GFP ששונה זה הלא-פלורסנט-רמת ה-pH חומצי בתוך ליבה צפופה בגרגרים אך הופך פלורסנט במאור פנים עם חשיפה ה-pH נייטרלי חוץ-תאית13. אינסולין בוגרת בגרגרים יש pH חומצי של מתחת 5.5. ברגע גרגר ולספות עם קרום פלזמה, פותח, את מטענה חשופים חוץ-תאי ה-pH נייטרלי של 7.4, המאפשר השימוש pHluorin ה-pH רגיש חלבונים בתור כתבת7,14.

לאור האופי הרגיש pH של pHluorin ואת הביטוי סלקטיבי של NPY ב אינסולין בגרגרים, הבונה פיוז'ן NPY-pHluorin ניתן ללמוד מאפיינים שונים של אינסולין גרגר אקסוציטוזה. מסירה ויראלי של הבונה פיוז'ן מבטיחה יעילות גבוהה תרביות תאים ועובד על ראשי תאי הבטא או שורות תאים, כמו גם על איים מבודדים. שיטה זו יכולה לשמש גם כקו מנחה ללמוד אקסוציטוזה בכל סוג תא אחר עם שלפוחית המכילה NPY. זה יכול גם להיות משולב עם כל דגם העכבר מהונדס ללמוד על ההשפעות של תנאים מסוימים (נפילות, ביטוי, וכו ') על אקסוציטוזה. טכניקה זו שימש בעבר כדי לאפיין יכולות דפוסי הפרשת האינסולין גרגר באוכלוסיות תאי בטא אנושיים איונים15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת מיאמי אישר את כל הניסויים.

1. נגיפי זיהום של שלם מבודד אנושית או העכבר לנגרהנס

  1. איון תרבות: להכין את המדיה תרבות איון: קונוט רפואי מחקר מעבדות (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS ו 2 מ מגלוטמין.
    1. האדם לנגרהנס מתקבלים מתוכנית משולב איון הפצה (NIDDK, NIH). עם ההגעה, העברה של איים קטנים (~ 500 איון מקבילות) עד 35 מ מ הלא-תרביות רקמה מטופלים צלחות פטרי עם 2 מ"ל CMRL תרבות המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 /O 2 עבור 24 שעות לפני זיהום ויראלי.
      2. לנגרהנס
    2. העכבר ניתן לבודד בעקבות פרוטוקולים שנקבעו קודם 16. בעקבות בידוד, תרבות ~ 200 איון להן מקבילות ב- 35 מ מ הלא-תרביות רקמה מטופלים צלחות פטרי עם 2 מ"ל CMRL תרבות המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 /O 2 עבור 24 שעות לפני זיהום ויראלי.
      הערה: הימנע משימוש העכברים הטרנסגניים עם כתבים GFP או YFP הביע על איים קטנים כדי למנוע קרינה פלואורסצנטית חפיפה עם NPY-pHluorin.
  2. וירוס הכנה
    הערה: פיוז'ן NPY-pHluorin היה משובטים לתוך וקטור pcDNA3 10, subcloned לתוך וקטור adenoviral לייצור adenoviral [אדנו serotype 5 (DE1/E3)] על ידי אדנו רקומביננטי החברה הייצור. הווירוס היה aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס. המניה ויראלי מסופק על ידי החברה ב titers של 10 12 13 10 חלקיקים נגיפיים (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
    1. במבחנה איון זיהום, שימוש 10 6 PFU/mL, והתוצאה ריבוי משוער של זיהום (MOI) של בסביבות 2 (ראה דיון לפרטים)
  3. נגיפית של לנגרהנס
    התראה: עבודה עם adenoviruses מחייב נהלי אבטחה ברמה 2 (BSL2) והסמכה. בדוק עם הקצין אבטחה מוסדיים הדרכה והדרכה על הליכים BSL2.
    1. להכין אדם/עכבר איונים כמתואר לעיל-
    2. להוסיף 5-10 µL של וירוס מניות כל צלחת פטרי 35 מ מ המכיל האדם/עכבר איים ב- mL 2 אמצעי התרבות CMRL (עם 10% FBS ו 2 מ מגלוטמין).
      הערה: להתאים את עוצמת הקול של הנגיף נעשה בהתאם כייל נגיפי כפי שנמסרו על ידי גליון הנתונים של החברה.
    3. תרבות של איים ב המכיל וירוס מדיה-37 °C/5% CO 2 עבור ה 24
    4. לאחר 24 שעות, תשאף התקשורת המכיל וירוס ולהחליף עם 2 מ"ל CMRL תרבות מדיה (עם 10% FBS ו 2 מ מגלוטמין).
    5. תרבות של איים קטנים 4-6 ימים-37 °C/5% CO 2, החלפת המדיה כל 3 ימים.
    6. לאחר 4 - 6 ימים של culturing, לצפות בסביבות 30% של תאים איון נגועה. ניתן להשתמש איונים לניסויים הדמיה בשידור חי-

2. קונאפוקלית הדמיה של נגוע איים

הערה: עיין טבלה של חומרים עבור החומרים והציוד הנדרש עבור הדמיה קונפוקלי.

  1. ריאגנט והכנה הגדרת הניסוי
    1. להכין פתרון חוץ-תאית: להוסיף 125 מ"מ NaCl, מ מ 5.9 אשלגן כלורי, מ"מ 2.56 CaCl 2, 1 מ MgCl 2, 25 מ מ HEPES, BSA 0.1%, pH 7.4, סטרילי מסונן.
      הערה: מאגר זה מוגש בדרך כלל ללא גלוקוז, ניתן לאחסן ב 4 ° C עד חודש. גלוקוז נוספת ביום של הניסוי כדי להגיע את הריכוז הסופי הרצוי.
      1. הכן הבזליים גלוקוז (3 מ"מ) בינוני: להוסיף µL 75 של 2 מ' מניות גלוקוז 50 מ של פתרון חוץ-תאית.
      2. Hyperglycemic (16 מ מ) בינוני: להוסיף 400 µL של 2 מ' מניות גלוקוז 50 מ של פתרון חוץ-תאית
    2. לדלל כל גירוי נוסף (למשל, אשלגן כלורי או אדנוזין טריפוספט (ATP)) בתמיסה חוץ-תאית, המכילה גלוקוז 3 מ מ.
    3. לפני תחילת הניסוי, pretreat על coverslips עם פולי-D-ליזין על-ידי הוספת 30 µL של פולי-D-ליזין פתרון (1 מ"ג/מ"ל) coverslip עבור 1 h ושטיפה ביסודיות עם H 2 O.
      הערה: coverslips זכוכית אקרילית-ליזין מצופה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
    4. לפחות שעה לפני הניסוי, באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להעביר את איונים 35 מ מ פטרי המכילות פתרון חוץ-תאית עם גלוקוז 3 מ מ. לשמור ע ב CO של 37 ° C ו- 5%-2-
      הערה: אם יש צורך, ניתן שכותרתו קרום פלזמה בשלב זה. להוספת תווית קרום פלזמה, להוסיף 2 מיקרומטר di-8-ANEPP לצבוע הפתרון חוץ-תאית עם גלוקוז 3 מ מ. דגירה של איים בפתרון צבע עבור h 1-37 °C/5% CO 2. יכול להיות שמחים לצבוע קרום פלזמה-488 ננומטר וזוהה על 620 nm.
    5. דקות לפני תחילת הניסוי, לצרף את coverslip לחדר ההדמיה על ידי איטום זה עם גריז סיליקון ואקום. לתקן לחדר ההדמיה פלטפורמת הדמיה. באמצעות פיפטה, במקום 20-30 איים על אזור פולי-D-ליזין-יחס של coverslip ולתת איונים לדבוק פני השטח במשך 20 דקות
      הערה: חשוב לא לתת את coverslip להתייבש לחלוטין כדי למנוע נזק איון.
    6. בזמן איים קטנים הם והקפדה coverslip, להכין את המערכת זלוף בשטיפת זה ביסודיות עם מים. הוספת כל פתרון לערוץ אחר: גלוקוז 3 מ מ (ערוץ 1), מ מ 16 גלוקוז (ערוץ 2), גלוקוז 16 מ מ עם 100 מיקרומטר 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX) ו- 10 מיקרומטר forskolin (ערוץ 3), 25 מ מ אשלגן כלורי גלוקוז 3 מ מ (ערוץ 4), 10 מיקרומטר ATP ב- 3 מ מ (גלוקוז ערוץ 5). להסיר את כל הבועות של המערכת על ידי פתיחת כל ערוץ בנפרד ולתת את זרימת פתרון לכמה דקות, וודא כי הזרם עקבית (0.5 mL/min), הצנרת לא דולף.
    7. להתחבר החימום פתרון בתוך שורה הצינור לשקע זלוף ולהתאים את הטמפרטורה של מאגר outflowing המשמש 37 מעלות צלזיוס.
    8. להכין את השאיבה. להסיר את כל הבועות מהמערכת, וודא כי הזרם עקבית, הצנרת לא דולף.
    9. , ברגע איים קטנים לדבוק פני השטח coverslip, בעדינות למלא תא הדמיה עם הפתרון חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ. להימנע לשטוף את איונים מהמשטח של coverslip.
    10. למיקום פלטפורמת הדמיה עם איונים לבמה מיקרוסקופ ולחבר אותה מערכת זלוף, השאיבה.
    11. התור על הזרם, כל הזמן perfuse של איים עם הפתרון חוץ-תאית דור 3. המערכת מוכן כעת לדימות קונפוקלי.
  2. הדמיה קונאפוקלית
    1. לאתר של איים בשדה מיקרוסקופ הגדלה נמוכה יותר. ברגע ממוקדת של איים קטנים, לעבור מטרות הגדלה גבוהה יותר (לדוגמה, המטרה של טבילה במים X 63 (63 X / 0.9 NA)).
    2. פתח את הרכישה באמצעות תוכנה (טבלה של חומרים) ולהפעיל את מצב סורק תהודה.
    3. לבחור את מצב הדמיה XYZT ולהגדיר את ההגדרות הרכישה כדלקמן:
      1. להפוך-ארגון לייזר ו- 488 ננומטר לייזר קו ולהתאים את עוצמת הלייזר כדי 50% עבור עירור pHluorin.
      2. לאסוף פליטה-505-555 nm.
      3. לבחור רזולוציה של 512 x 512 פיקסלים. הקש " Live " כפתור כדי להתחיל הדמיה לכוונן את רמות רווח (רווח טיפוסי הוא בסביבות 600 V).
      4. להגדיר את begin ו- end z-המחסנית של: להתמקד בחלק העליון איון ובחרו " בגין " ולעבור האחרון המטוס יכול להיות ממוקד ובחרו " סיום ". השתמש בגודל z-צעד של 5 מיקרומטר. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את מספר מטוסים קונפוקלי.
      5. להגדיר את מרווח הזמן עבור רכישת כל ערימה-z קרוב-1.5-2 s ובחר את האפשרות " לרכוש עד הפסיק " עבור הדמיה רציף.
      6. העיתונות " להתחיל " כפתור initialize.
    4. שימוש בפרוטוקולים גירוי שונות לזירוז גרגר אקסוציטוזה מאת פרפוזיה של איים עם הגירויים הרצוי. פרוטוקולים גירוי יכול להיות מותאם אישית כדי להתאים את תכלית מדעית הרצויה (ראו להלן).
  3. גירוי פרוטוקולים
    הערה: כל פרוטוקול גירוי, להתחיל בהקלטת לפחות 2 דקות של איון רקע פעילות במהלך זלוף קבוע עם פתרון חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ. Perfuse עם תמריץ עבור תקופת הזמן הרצוי. ניתן להתאים אישית את הסדר של ממריצים, משך הזמן של גירוי, כמו גם משך הקלטות כדי להתאים למטרות מדעיות הרצוי. הקפידו לשטוף איונים ביסודיות עם פתרון חוץ-תאית המכילה גלוקוז 3 מ מ לפני שמתחילים עם גירוי חדש. להלן למצוא את הפרוטוקולים גירוי מדגם שנוצלו להדגים את היכולות שיטה.
    1. Stimulate עם אמוניום כלוריד (NH 4 Cl) כפקד חיובי עבור pHluorin pH רגישות ויעילות זיהום ויראלי ( איור 3): גלוקוז 3 מ מ (2 דקות) → 50 מ מ NH 4 קלרנית (2 דקות), גלוקוז 3 מ מ → גלוקוז 3 מ מ (2 דקות)
      הערה: ב- NH-4 פתרון קלרנית, להחליף את NaCl על בסיס equimolar.
    2. Stimulate אינסולין גרגר אקסוציטוזה על ידי הגדלת ריכוז הגלוקוז ( איור 5, איור 6): גלוקוז 3 מ מ (2 דקות) → מ מ 16 גלוקוז (15-30 דקות) → גלוקוז 3 מ מ (2 דקות
      הערה: כדי לראות מספר התפרצויות של פעילות, perfuse של איים באופן רציף עם הפתרון 16 גרם לפחות 15 דקות
      הערה: על מנת להגדיל את העקביות של הפרשה תגובות 17, משתמשים יכולים להוסיף הרמת-מחנה סוכנים (100 מיקרומטר IBMX ו- 10 מיקרומטר forskolin) לפתרונות דור 3 והן 16 גרם. אפשרות זו אינה משנה את דפוסי הטמפורלי של הפרשת גרגר. לפרטים נוספים ראו 15 ודיון..

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זרימת העבודה כולו של הטכניקה מוצג באיור1. בקצרה, עכבר או איונים האנושי להיות נגוע אדנו קידוד NPY-pHluorin, עם תמונה, לאחר כמה ימים בתרבות, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. כמו גרגרי נתיך עם קרום פלזמה, פתוח, עלייה פלורסצנטיות נצפית, ניתן לכמת (איור 1). כדי לקבוע אם NPY-pHluorin הוא אכן כלי מתאים כדי לפקח על דינמיקה גרגר אינסולין, איים נגועים היו immunostained עם נוגדנים נגד ה-GFP, איון שונים ההורמונים אינסולין, סומטוסטטין או גלוקגון. רוב ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב יד זה מתאר טכניקה יכול לשמש כדי להמחיש אקסוציטוזה של גרגרי אינסולין בתאי בטא בתוך לנגרהנס ללא פגע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. היא משתמשת NPY-pHluorin כמו הכתבת פלורסנט משובטים לתוך אדנו כדי להבטיח יעילות של תרביות תאים גבוהה.

למרות השיטה היה יעיל ביותר בידיים שלנו, זה עשוי לדרוש מספר שינויים התלויים בעיקר שני פרמטרים: 1) האיכות של איון, והכנה 2) כייל של מניות ויראלי עם אופטימיזציה של זיהום תנאים. לפני זיהום ויראלי של איים קטנים, לאפשר הכנת איון להתאושש בידוד ותחבורה מתח בין לילה ב 37 º C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

המחברים תודה מרשה Boulina מ- DRI הדמיה מתקן הליבה לעזרה עם המיקרוסקופים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 1K01DK111757-01 (יא), F31668418 (מ מ), R01 DK111538, R33 ES025673, R56 DK084321 (AC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר זקוףLeica Microsystems, Wetzlar, גרמניהTCS-SP5כולל LAS AF, תוכנת רכישת התמונה
תא הדמיהWarner instrumentsRC-26
פלטפורמת תא הדמיהWarner instrumentsPH-1
22 x 40 כיסויי זכוכיתDaiggerbrandG15972H
Vacuum גריז סיליקוןסיגמאZ273554-1EA
מערכת זלוף רב ערוציתמכשירי וורנרVC-8
מחמם פתרון מוטבע יחידמכשירי וורנרSH-27B
בקר טמפרטורהמכשירי וורנרTC-324C
משאבת יניקה פריסטלטיתPharmaciaP-1
צלחת פטרי 35 מ"מ, לא מטופל בתרבית רקמותVWR10861-586
CMRL בינוני, ללא גלוטמיןThermoFisher11530037
FBS,ThermoFisher16140071
L-גלוטמין 200 מ"מThermoFisher25030081
5 M תמיסת NaClSigmaS5150
3 M תמיסת KClSigma60135
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M MgCl2 solutionSigmaM1028
סרום בקר אלבומיןSigmaA2153
1 M תמיסת HEPESSigmaH0887
מסנן ואקוםVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
פולי-D-ליזין הידרוברומידסיגמא-אולדריץ'P6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX)SigmaI5879
פורסקוליןסיגמאF3917

מקורות

  1. Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
  2. Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
  3. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  4. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
  5. Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
  6. Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
  7. Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
  8. Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478(2011).
  9. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  10. Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
  11. Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
  12. Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
  13. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  14. Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).
  15. Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
  16. Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632(2015).
  17. Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
  20. Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
  21. Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
  22. Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  25. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NPY pHluorinZ stack
קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.