אנו מתארים פרוטוקול עבור ויזואליזציה של אינסולין אקסוציטוזה ב איים שלמים באמצעות pHluorin, חלבון פלואורסצנטי ירוק pH-רגיש. איים מבודדים נגועים עם אדנו קידוד pHluorin מצמידים את שלפוחית מטען neuropeptide Y. דבר זה מאפשר הזיהוי של אינסולין גרגר פיוז'ן אירועים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרשת אינסולין ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס גלוקוז בתנאים רגילים פיזיולוגיים כמו גם כמו מחלה. לגישות ללמוד אקסוציטוזה גרגר אינסולין שאו להשתמש אלקטרופיזיולוגיה או מיקרוסקופ מצמידים את הביטוי של עיתונאים פלורסנט. עם זאת רוב שיטות אלה מוטבו עבור שורות תאים המשובטים או לדרוש בריא לנגרהנס. לעומת זאת, השיטה המובאת כאן מאפשר הדמיה בזמן אמת של אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב לנגרהנס ללא פגע. ב פרוטוקול זה, נתאר תחילה זיהום נגיפי של איים מבודדים הלבלב עם אדנו מקודד רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), pHluorin, מצמידים neuropeptide Y (NPY). שנית, אנו מתארים את קונאפוקלית הדמיה של איים קטנים חמישה ימים לאחר זיהום נגיפי, וכיצד לעקוב גרגר הפרשת אינסולין. בקצרה, איים נגועים מונחת על coverslip על חדר הדמיה, עם תמונה תחת זקוף לסריקת לייזר קונפוקלי במיקרוסקופ תוך כדי להיות perfused ללא הרף עם פתרון חוץ-תאית שמכילה גירויים שונים. תמונות קונאפוקלית פורש 50 מיקרומטר של איון נרכשים כמו בצילום מואץ הקלטות באמצעות סורק מהיר-תהודה. היתוך גרעיני של אינסולין בגרגרים עם קרום פלזמה ניתן בעקבות לאורך זמן. הליך זה גם מאפשר בדיקה סוללה של גירויים בניסוי יחיד תואם גם העכבר וגם איונים האנושית, יכול להיות משולב עם צבעים שונים עבור הדמיה תפקודית (למשל, ממברנה סידן פוטנציאליים או cytosolic צבע).
מבוא
האינסולין המיוצר על ידי תאי ביתא הלבלב איון, וזה המפתח מווסת של מטבוליזם של גלוקוז1. מוות או תפקוד לקוי של תאי הבטא מפריע גלוקוז הומאוסטזיס ומוביל סוכרת2. אינסולין ארוזה בגרגרים ליבה צפופה שפורסמו ב Ca2 +-אופן התלויים3. שחקרתי כמה אינסולין גרגר אקסוציטוזה מוסדר חיוני להבין באופן מלא את מה קובע את הפרשת האינסולין, פותח דרכים חדשות לזיהוי מטרות טיפולית חדשנית לטיפול בסוכרת.
אינסולין אקסוציטוזה נחקרה בהרחבה שימוש בגישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון מידות קיבול הממברנה, וגישות מיקרוסקופיים בשילוב עם מולקולות פלורסנט. מידות קיבול הממברנה יש רזולוציה טמפורלית טובים ומאפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ועדת האתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת מיאמי אישר את כל הניסויים.
1. נגיפי זיהום של שלם מבודד אנושית או העכבר לנגרהנס
- איון תרבות: להכין את המדיה תרבות איון: קונוט רפואי מחקר מעבדות (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS ו 2 מ מגלוטמין.
- האדם לנגרהנס מתקבלים מתוכנית משולב איון הפצה (NIDDK, NIH). עם ההגעה, העברה של איים קטנים (~ 500 איון מקבילות) עד 35 מ מ הלא-תרביות רקמה מטופלים צלחות פטרי עם 2 מ"ל CMRL תרבות המדיה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% / 95% CO 2 /O 2 עבור 24 שעות לפני זיהום ויראלי. לנגרהנס
- העכבר ניתן לבודד בעקבות פרוטוקולים שנקבעו קודם 16. בעקבות בידוד, תרבות ~ 200 איון להן מק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
זרימת העבודה כולו של הטכניקה מוצג באיור1. בקצרה, עכבר או איונים האנושי להיות נגוע אדנו קידוד NPY-pHluorin, עם תמונה, לאחר כמה ימים בתרבות, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. כמו גרגרי נתיך עם קרום פלזמה, פתוח, עלייה פלורסצנטיות נצפית, ניתן לכמת (איור 1). כדי לקבוע אם NPY-pHluorin הוא אכן כלי מתאים כדי לפקח על דינמיקה גרגר אינסולין, איים נגועים היו immunostained עם נוגדנים נגד ה-GFP, איון שונים ההורמונים אינסולין, סומטוסטטין או גלוקגון. רוב .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כתב יד זה מתאר טכניקה יכול לשמש כדי להמחיש אקסוציטוזה של גרגרי אינסולין בתאי בטא בתוך לנגרהנס ללא פגע על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. היא משתמשת NPY-pHluorin כמו הכתבת פלורסנט משובטים לתוך אדנו כדי להבטיח יעילות של תרביות תאים גבוהה.
למרות השיטה היה יעיל ביותר בידיים שלנו, זה עשוי לדרוש מספר שינויים התלויים בעיקר שני פרמטרים: 1) האיכות של איון, והכנה 2) כייל של מניות ויראלי עם אופטימיזציה של זיהום תנאים. לפני זיהום ויראלי של איים קטנים, לאפשר הכנת איון להתאושש בידוד ותחבורה מתח בין לילה ב 37 º C.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
המחברים תודה מרשה Boulina מ- DRI הדמיה מתקן הליבה לעזרה עם המיקרוסקופים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 1K01DK111757-01 (יא), F31668418 (מ מ), R01 DK111538, R33 ES025673, R56 DK084321 (AC).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר זקוף | Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה | TCS-SP5 | כולל LAS AF, תוכנת רכישת התמונה |
| תא הדמיה | Warner instruments | RC-26 | |
| פלטפורמת תא הדמיה | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 כיסויי זכוכית | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum גריז סיליקון | סיגמא | Z273554-1EA | |
| מערכת זלוף רב ערוצית | מכשירי וורנר | VC-8 | |
| מחמם פתרון מוטבע יחיד | מכשירי וורנר | SH-27B | |
| בקר טמפרטורה | מכשירי וורנר | TC-324C | |
| משאבת יניקה פריסטלטית | Pharmacia | P-1 | |
| צלחת פטרי 35 מ"מ, לא מטופל בתרבית רקמות | VWR | 10861-586 | |
| CMRL בינוני, ללא גלוטמין | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-גלוטמין 200 מ"מ | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M תמיסת NaCl | Sigma | S5150 | |
| 3 M תמיסת KCl | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| סרום בקר אלבומין | Sigma | A2153 | |
| 1 M תמיסת HEPES | Sigma | H0887 | |
| מסנן ואקום | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| פולי-D-ליזין הידרוברומיד | סיגמא-אולדריץ' | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| פורסקולין | סיגמא | F3917 |
מקורות
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the cont....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
