מאמר שיטה

מדריך הייצור, התגבשות ונחישות מבנה של IKK1 האנושי/α

DOI:

10.3791/56091

⸱

2 בנובמבר 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קינאז IκB 1/α (IKK1/α CHUK) הוא חלבון Ser/חמישי קינאז מעורב מספר עצום של פעילויות הסלולר בעיקר באמצעות הפעלה של גורמי שעתוק NF-κB. כאן, אנו מתארים את השלבים העיקריים הדרושים כדי להפוך את ייצור מכשור לקביעת קשיות ומבנה הגביש של חלבון זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלקה של גירויים חוץ-תאית מחייב הפעלה של IKK1/α לזירוז דור של יחידת משנה NF-κB, p52, דרך עיבוד p100 קודמן שלו. פונקציות p52 homodimer או heterodimer עם יחידת משנה נוספת של NF-κB, RelB. הדימרים הללו בתורו לווסת את הביטוי של מאות גנים מעורבים דלקת, הישרדות cell ו מחזור התא. IKK1/α בעיקר נשאר משויך IKK2/β, נמו כמו קומפלקס ternary. עם זאת, בריכה קטנה של זה הוא ציין גם בתור complex(es) נמוך משקל מולקולרי. זה לא ידוע אם הפעילות עיבוד p100 המופעלת על-ידי הפעלה של IKK1/α במרחק גדול יותר או של הבריכה מורכבת קטנים יותר. פעילות המכונן של IKK1/α זוהתה במספר סוגי סרטן ומחלות דלקתיות. כדי להבין את המנגנון של הפעלה של IKK1/α, ולאפשר את השימוש בו כמטרה סמים, אנחנו הביע IKK1 רקומביננטי/α במערכות מארח שונים, כגון e. coli, חרקים, ואת תאי יונקים. שהצלחנו להביע מסיסים IKK1 α ב baculovirus נגוע תאים חרקים, קבלת mg כמויות של פרוטאין טהור מאוד, אך איבדו מחוזקן. בנוכחות מעכבי, וקביעת מבנה שלה. כאן, אנו מתארים את השלבים המפורטים כדי לייצר חלבון רקומביננטי להתגבשותו, נחישותה מבנה הגביש רנטגן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פעילות גנים ברמת השעתוק NF-κB משפחתו של גורמי שעתוק dimeric נדרשים לפונקציות הסלולר מגוונות, החל דלקת וחסינות הישרדות ומוות. פעילויות אלה נשלטים והטכני תאים, לאובדן של רגולציה מוביל מצבים פתולוגיים שונים, כולל הפרעות אוטואימוניות וסרטן1,2,3. בהיעדר גירוי, הפעילות של NF-κB נשמרים עכבות על ידי חלבונים IκB (מעכב של - κB)4. זירחון של שאריות Ser ספציפי על חלבונים IκB מסמן אותם ubiquitination, proteasomal הבאים השפלה או עיבוד סלקטיבי5. Kinases שני Ser/חמישי מאוד הומולוגיים, IKK2/β, IKK1/α, לשמש הרגולטורים המרכזי של NF-κB פעילויות על-ידי ביצוע אלה זרחון אירועים6,7.

אינטראקציות בין ליגנד קולטן transduces אות דרך סדרה של מתווכים מובילים לקראת הפעלת גורמי NF-κB. באופן כללי ניתן לסווג תהליך האיתות NF-κB שני מסלולים נפרדים – ואמנות קאנונית (אלטרנטיבית)8. הפעילות של IKK2/β בעיקר מסדיר את NF-κB איתות של הנתיב הקנוני חיונית תגובות חיסוניות דלקתיות, מולדת9. תכונה ברורים של מסלול זה היא הפעלה של מהיר ולא קצרת ימים של IKK2/β10 בתוך IKK עד כה מבחינה ביוכימית uncharacterized מורכבות – אוכל מורכב IKK1, IKK2, כמו גם רכיב תקינה, נמו (NF-κB חיוני אפנן )11,12,13. בין שני קטליטי IKK subunits של המתחם IKK, IKK2 הוא בעיקר אחראי14 עבור זירחון של שאריות ספציפית של IκBs טיפוסית (α, - β, & - γ) קשורה NF-κB, וגם של החלבון IκB טיפוסיות, NF-κB1/p105, אשר הוא קודמן של יחידת משנה p505NF-κB. זרחון המושרה ubiquitination ומוביל proteasomal השפלה של IκB (או עיבוד של p105) שחרור, הפעלה של קבוצה ספציפית של NF-κB הדימרים15. פעילות חריגה NF-κB בשל הפונקציה מוסדר בצורה שגויה של IKK2 נצפתה ב סרטן רבים כמו גם כמו הפרעות אוטואימוניות2,3,16.

בניגוד IKK2/β, מווסת פעילות של IKK1/α NF-κB איתות של מסלול קאנונית, שהיא הכרחית עבור פיתוח חסינות. IKK1 phosphorylates שאריות ספציפי של NF-κB2/p100 שלה קטע C-terminal IκBδ, מה שמוביל את העיבוד שלו, את הדור של p52. היווצרות של heterodimer p52:RelB transcriptionally פעיל יוזם תגובה איטית ומתמשכת אותות התפתחותית7,17,18,19,20. מעניין, הדור של p52 גורם מרכזי NF-κB של מסלול זה תלויה באופן ביקורתי גורם נוסף, NF-κB גרימת קינאז (NIK)21,22, אבל לא על IKK2 או נמו. בתאים resting, הרמה של ניק נשאר נמוך עקב שלה24,23,השפלה מתמדת פרוטאוזום תלוית25. על גירוי של תאים על-ידי ליגנדים 'קאנונית' ולאחר בתאים ממאירים מסוימים, ניק הופך התייצב לגייס ולהפעיל IKK1 / α. פעילות קינאז של ניק וגם IKK1 הם חיוניים עבור עיבוד יעיל של p100 לתוך p527. IKK1, ניק phosphorylate serines 3 (Ser866, 870, 872) של NF-κB2/p100 בקטע שלה-IκBδ C-מסוף המוביל את העיבוד שלו את הדור של p52. ההפעלה aberrant של השביל קאנונית היה מעורב ממאירות רבות כולל מיאלומה26,27,28.

מספר מעכבי מאוד יעילה, מדויקת עבור IKK2/β ידועים, למרות אף אחד עד כה יש התברר להיות תרופה יעילה. לעומת זאת, מעכבי IKK1/α-ספציפיות הם דלילים. זה עשויה לנבוע בחלקה שלנו חוסר מידע ביוכימי מבניים על IKK1/α, אשר מגביל את ההבנה שלנו של הבסיס מכניסטית של הפעלה של NF-κB מאת IKK1 תאים, תכנון תרופות רציונלי. המבנים רנטגן של IKK2/β סיפק לנו תובנות לגבי מנגנון ההפעלה של IKK2/β29; עם זאת, מבנים אלה לא יכלו לחשוף כמה שונה לגירויים במעלה להפעיל הפעלה של IKK1/α או IKK2/β להסדיר סטים ברורים של NF-κB פעילויות 30,31. כדי להבין את הבסיס מכניסטית שבבסיס הפונקציה האיתות מובהק של IKK1/α, וכדי ליצור פלטפורמה עבור תכנון רציונלי תרופות, התמקדנו לקביעת המבנה של IKK1/α.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת וירוס רקומביננטי מתאים לביטוי בקנה מידה גדול של IKK1/α

  1. הכנת וירוס P1 32
    1. יום 1: צלחת Sf9 תאים (~ 6 X 105) (פסקה מספר פחות מ 10) ב 2 מ של Sf900 השלישי תא חרקים בינוני בכל טוב של צלחת 6-ובכן, דגירה ב-27 º C מעבר תאים כאשר הם מגיעים צפיפות של 2-3 X 106 תאים לכל מ ל השעיה על-ידי דילול לתוך המדיה טריים-צפיפות של ~ 6 X 105.
    2. יום 2: לדלל 8 µL של ריאגנט Sf9-תרביות תאים ב- 100 µL Sf900 III או של גרייס חרקים בינוני ללא אנטיביוטיקה, סרום. מערבולת בקצרה.
    3. למהול 1 µg של ערכת טיהור bacmid רקומביננטי (פרטים הינם מסופקים בחדרי 'נציג תוצאות')32 לתוך עוד 100 µL של המדיום אותו, צינור נפרדים.
    4. לשלב DNA מדולל ו ריאגנט תרביות תאים (הנפח הכולל ~ 210-220 μL), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
    5. הסר את המדיום של הבאר. להוסיף 1 מ"ל בינוני טריים ללא אנטיביוטיקה, סרום.
    6. להוסיף את התערובת ריאגנט מדולל DNA-תקנים dropwise אל התאים. להתאים את גודל טיפה כזאת זה לא לסלק תאים חסיד.
    7. לאחר ~ 6 h, להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני טריים מלמעלה או להסיר את המדיום ולהוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים. חם בינוני טריים עד 25-27 מעלות צלזיוס לפני חיבור.
    8. דגירה התאים ב-27 º c בדוק את בארות מעת לעת בכל ~ 12 h סימנים של זיהום ויראלי. לבצע את כל Sf9 תחזוקה, ביטוי ב-27 º c
    9. יום 5: להוציא את המדיום המכיל תאים 60-72 h פוסט זיהום. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. להציל את תגובת שיקוע; זה המניה P1-וירוס. להקפיא aliquots קטן ב- 80 ° c
  2. בחירת הטוב ביותר להביע P1 וירוס שיבוט.
    1. צלחת תאים באופן דומה כפי שמתואר בשלב 1.1.
    2. פוסט יום או h ~ 6 הבא יופיצ, מוסיפים 20 µL µL 50 מניות שיבוט וירוס P1 שונה על גבי התאים בבארות שונים.
    3. לסלק את תאים חסיד מאת pipetting עדין ולקצור הזיהום פוסט 60-72 h תאים נגועים על ידי צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. שמור את תגובת שיקוע. זהו וירוס P2 המניה. Aliquots חנות קטנה של המניה ב- 80 ° c
    4. להוסיף 100 µL 2 x Laemmli מרחביות מאגר בגדר תא שנקטפו. מחממים > 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות צנטריפוגה (בדרך כלל > 10,000 x g) במשך 5 דקות.
    5. לרוץ 10-15 µL של כל מדגם מרחביות-עמוד 8-10%-V 120-160 עד לחזית צבע מגיע התחתון של הג'ל.
    6. אלקטרו-העברת החלבונים נפתרה על ידי תקן יבש למחצה להעביר פרוטוקול (20 V, 30-45 דקות) על קרום ניטרוצלולוזה/PVDF.
    7. כתם עם נוגדן anti-IKK1 (דילול ~ 1:2, 000, חייב להיות מותאם) או נוגדן anti-PentaHis (דילול ~ 1:3, 000, חייב להיות מותאם) לביטוי.
    8. לבחור השיבוט וירוס P1 הטוב ביותר על-ידי השוואת הביטוי של IKK1 רקומביננטי.
  3. הכנת בקנה מידה גדול P3 וירוס מניות.
    1. צלחת תאים באופן דומה כפי שמתואר בשלב 1.1 לתוך צלחת 15 ס מ המכיל 25-30 מ של Sf900 השלישי בינוני.
    2. ~ 6 h פוסט יופיצ, להוסיף 150-300 µL של המניה ביותר לביטוי של וירוס P1 אל התאים.
    3. לאחר 72 h פוסט זיהום, תשאף האמצעי בזהירות לצלחת בשפופרת המתאים (סטרילי), centrifuge את הצינור ב 500-1000 g X 10 דקות ב 4 º C. למחוק בגדר תא (אם אחד נוצר) ולשמור את תגובת שיקוע. זה מניות וירוס P3.
  4. לקבוע את titre וירוס האופטימלי עבור ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול
    1. צלחת תאים ב- 2 מ של Sf900 השלישי בינוני, כפי שמתואר ב 1.1, בצלחת 6-. טוב.
    2. הוסף 20, 30, 40 ו- 50 µL של P3 וירוס מניות נפרדים בארות ~ 6 h פוסט ציפוי. כוללות פקד נגוע.
    3. קציר תאים מפני הידבקות פוסט כל טוב h 48-60.
    4. להוסיף 100 µL 2 X Laemmli מרחביות המאגר. מחממים > 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות צנטריפוגה (בדרך כלל ב 14,000 x g) במשך 5 דקות.
    5. לפתור 10-15 µL של כל מדגם ג'ל מרחביות-דף 8-10%.
    6. העברה נפתרה חלבון קרום ניטרוצלולוזה/PVDF כאמור 1.2.6.
    7. כתם עם נוגדן anti-IKK1 (דילול ~ 1:2000, חייב להיות מותאם) או נוגדן anti-PentaHis (דילול ~ 1: 3000, חייב להיות מותאם).
    8. השתמש הנגיף עם הטוב ביותר להביע titre עבור ביטויים בקנה מידה גדול.

2. בקנה מידה גדול ביטוי של 6 x-שלו מתויג האנושי IKK129,33

  1. לבצע את הביטוי בקנה מידה גדול בתרבות ההשעיה. פצל תאים 1 ליטר של Sf900 השלישי בינוני בבקבוקון Erlenmeyer L 2 עם כובע פרקו. צפיפות התא צריך להיות ~ 5 x5 10 תאים/מ.
  2. לגדל תאים אלה ההשעיה-~ 100 סל ד ב 27 ° C ב שייקר ~ 2 ימים עד שיגיע צפיפות של 1-2 x 106/mL. צפיפות התא אינו יכול לחרוג 2 x 106/mL.
  3. להוסיף את הכמות הרצויה של וירוס P3, כפי מוערך ב- 1.4.
  4. לגדול התרבות הנגועים במשך 48-60 h-~ 100 סל ד ב 27 ° C ב שייקר.
  5. קציר תאים על ידי צנטריפוגה-< 1,500 x ג'י ב- 4 מעלות צלזיוס.
  6. להציל את צניפה תא ולמחוק את המדיום.
  7. המשך חלבון טיהור ישירות. פלאש להקפיא בגדר תא חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

3. טיהור של שלו-IKK133

  1. יום 1, resuspend בגדר תא ב- 40 מ של פירוק מאגר (25 מ מ טריס pH 8.0, 0.2% NP-40, 200 מ"מ NaCl, imidazole 10 מ מ, 10% גליצרול, 5 מ מ β-mercaptoethanol ומעכב פרוטאז קוקטייל).
    הערה: בגדר רטובים מסה לא נקבע. בדרך כלל, ~ 2 L של תרבות שימשה בשלב זה.
  2. Lyse התאים על ידי sonication-60-70% מחזורי, 5-10 פולסים של משך s 30 במרווח של > 1 דקות, שמירה על התליה תא מקורר על קרח.
    הערה: שלב זה דורש אופטימיזציה עם כל דגם של sonicator. אל תתנו את הדגימה לחמם מעל 10 מעלות צלזיוס.
  3. להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה ב g 28,000 x ≥ למשך 45 דקות ב 4 º C.
  4. Equilibrate 4 מ"ל של ני-נ Agarose שרף עם פירוק מאגר, לערבב שקופה lysate (תגובת שיקוע) ע פ הפרוטוקול של היצרן.
  5. לאפשר החלבון לאגד השרף על-ידי המקננת כבר שעתיים על מערבל רוטרי בחדר 4 ° C.
  6. לשטוף ביסודיות השרף עם המאגר פירוק המכיל 30 מ מ imidazole. בדוק ריכוז חלבון השבר שטיפת מעת לעת באמצעות שיטת ברדפורד. לשטוף עד זה ריכוז חלבון השבר שטיפת מגיע 0.1 מ"ג/מ"ל. בדרך כלל מיטה > 20 נפח מאגר שטיפת נדרש כדי להגיע לנקודה זו.
  7. Elute חלבון IKK1/α שלו מתויג תחת זרימת הכבידה, באמצעות 20 מ"ל • תנאי מאגר (המאגר פירוק המכיל 250 מ מ imidazole). לאסוף את השברים 1-1.5 מ.
  8. בדוק את הטוהר של חלבון eluted על ג'ל מרחביות דף 8 או 10% על-ידי טעינת μL 5-10 מדגם של שברים כל מעורבב עם מאגר Laemmli.
  9. בריכה שיא שברים (ריכוז ≥ 2 מ"ג/מ"ל), למדוד ריכוז חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד.
  10. לעכל עם אס (1:30-50 (אס פרוטאז: IKK1)) פרוטאז בן לילה (≥12 h) ב 4 º C.
    הערה: למטב את כמות אס פרוטאז נדרש להשלים עיכול (≥ 95%) התג שלו-X 6 א-פריורי. פרוטאז אס היה טהור בבית.
  11. בבוקרו של יום 2, דגירה החלבון עם 1 מ מ ATP בנוכחות 20 מ מ MgCl2, β-glycerophosphate 20 מ מ, 10 מ מ NaF 1 מ"מ orthovanadate נתרן עבור h 1 ב-27 º c
  12. לסנן את הפתרון חלבון דרך מסנן μm 0.45 או 0.22.
  13. לטעון 6 מ של המדגם אל ~ 120 מ"ל מפוח הוצאת גודל עמודה מחוברת מערכת ממוכנת כרומטוגרפיה נוזלית. Equilibrate את העמודה עם מאגר A (20 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 150 מ מ NaCl, 5 מ מ DTT, 5% גליצרול), לפני החלת המדגם חלבון.
    הערה: עמודה קטנים יותר ניתן להשתמש בהתאם התשואה של חלבון לאחר השלב טיהור זיקה Ni-נ. ת. התאם/לחשב נפח 5% נפח עמודה).
  14. להפעיל את גודל-הדרה כרומטוגרפיה בספיקה של 1 מ"ל/min, ולעקוב אחר • תנאי-280, 254 ננומטר. לאסוף את השברים בגודל 2 מ.
  15. לבדוק את טוהר שברים שיא (בדרך כלל סביב ~ 60-70 מ ל) על ג'ל מרחביות-דף 8-10%.
  16. בריכה שברים טהור (טוהר ≥95% עם ריכוז של ≥0.5 מ"ג/מ"ל) ותתרכזו 10 kDa או 30 kDa משקל מולקולרי ניתוק החלבון צנטריפוגלי רכז ההוראות של היצרן.
  17. מפעם לפעם לבדוק ריכוז חלבון מרוכז שיטת ברדפורד, ותתרכזי הדגימה עד 8-12 מ"ג/מ"ל
  18. לוותר על 25 μL aliquots, הקפאת פלאש בחנקן נוזלי. חנות הדגימות פלאש קפואים במקפיא-80 ° C.

4. מסך עבור תנאי התגבשות של IKK1

  1. לחשב את הסכום הכולל (לפי נפח) של חלבון הדרוש על המסך עבור גבישים הבאים השיטות המתוארות להלן.
  2. נסה מעכבי שונים (מעכבי קינאז כלליים: AMPPNP, Staurosporine; IKK-specific מעכבי: MLN120B, מתחם A ו- IKK-מעכב XII) לבצע סינון עבור התגבשות. להפוך פתרונות מניות של תרכובות אלו ההוראות של היצרן. ודא כי הריכוז המרבי של המתחם בפתרון מניות שלה לא יעלה על 20 μM.
  3. להכין את IKK:inhibitor מורכבים עבור מסך התגבשות על ידי ערבוב 100 μM של IKK1 עם 200 μM מעכב, דגירה ב 18-20 מעלות צלזיוס במשך 30-40 דקות Centrifuge תערובת זו-> g 15,000 x למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. שמור את תגובת שיקוע התגבשות למסך.
  4. השתמש המסכים התגבשות זמינים מסחרית (ראה את הטבלה של חומרים).
  5. Pipette μL 80-100 של כל ריאגנט התגבשות (מאגר פתרונות), באמצעות פיפטה רב-ערוצי או רובוט, לתוך המאגר של צלחת 96-ובכן. הצלחת עכשיו הוא מוכן להגדיר טיפות. ודא כי הצלחת להכיל התגבשות 2-3 טיפות כך מעכבי 2-3 יכול להיות מוקרן בצלחת אחת.
  6. באמצעות רובוט התגבשות, לוותר על ומערבבים 0.2 – 0.25 μL של IKK1:inhibitor מורכבים באותו אמצעי אחסון של מאגר פתרון.
    הערה: הקרנה יכול להתבצע באופן ידני באמצעות אחסון טיפה גדולים יותר (0.5-1.0 μL של IKK1:inhibitor מורכבים באותו אמצעי אחסון של מאגר פתרון). עם זאת, השימוש רובוט יעזור להציל ריאגנטים יקרי ערך.
  7. חותם את הצלחות מיד לאחר הגדרת את הטיפות עם סרטים ברור שטיחות כדי למנוע התאיידות. חותם כראוי באמצעות המוליך המתאים. לעשות צלחות משוכפל עבור כל ערכת מעכב. דגירה לוח אחד 18 ° C, והשני בחדר הקר (טמפרטורה טווח ~ 4-6 ° C). ודא כי חממות אינם מושפעים רטט.
  8. השתמש stereomicroscope עם מקטב כדי לבדוק אם המראה של גבישים כל טיפה כל יום במשך שבעת הימים הראשונים, ולאחר מכן במרווחי זמן ארוך יותר. באופן שיטתי הערה וציון תצפיות אלה.
    הערה: השתמש של stereomicroscope עם מקטב כך יכול להיות מוערך באופן חזותי הצמיחה פגמים בגבישים. כאן, קריסטלים הופיע במצב שבו הפתרון מאגר הכילה 3% w/v לתוספי סולפט נתרן מלח Mr 5,000, 0.1 M BICINE pH 8.5, 15% w/v פוליאתילן גליקול 20,000. גבישים של IKK1 גדל רק בנוכחות XII IKK-מעכב.

5. קריסטל צמיחה אופטימיזציה29,33

  1. הכנת מלאי פתרונות.
    1. הכנת 30% פתרונות w/v של סולפט לתוספי משקל מולקולרי שונה (ממוצע MW 5,000, 8,000, 15,000, דא כ-40,000) יונים H2פתרון סינון או באמצעות מסננים μm 0.22.
    2. להכין את מניות 1 מ' או 0.5 M של מאגרים שונים בטווח ה-pH של 6.5 עד 9. סנן פתרונות באמצעות מסננים μm 0.22.
    3. להכין 25% או 50% (w/v) יתד פתרונות משקל מולקולרי שונה (ממוצעת של MW:1000, 1,500, 3,350, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000, 12,000, 20,000 Da). סנן פתרונות באמצעות מסננים μm 0.22.
    4. לבצע מסך רשת על ידי באופן שיטתי שינוי pH, מאגר, ריכוז, וסוג של פג והן לתוספי סולפט.
  2. למטב את ההקרנה ב 18 ° C, והן בחדר הקר (טמפרטורה טווח ~ 4-6 ° C).
  3. מערבבים כמות שווה IKK1:Inhibitor מורכבים עם פתרון טוב, דגירה על הפתרון טוב בסביבת אטום. שלב זה יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות רובוט שחולק.
    הערה: כאן, הקריסטלים הגדולה, מוגדרים היטב (כפי מוערך על ידי צבע אחיד מתחת מקטב אשר ציין צמיחה אחידה) התקבלו בתנאים הבאים: 100 מ מ BisTris pH 7.0, 2.8-3.5% לתוספי סולפט (kDa ממוצע של 15 מגוואט), 8.5-10% יתד 20 kDa בחדר הקר.

6. גידול גבישים במספרים גדולים

  1. להכין את הפתרונות הבאים מניות ולסנן אותם דרך מסנן μm 0.22.
    1. להכין 0.5M BisTris pH 7.0, ו BisTris פרופאן pH 7.0 ו- 7.5.
    2. הכנת 30% (w/v) לתוספי סולפט (ממוצע MW ~ 15 kDa). חנות ב 4 º C.
    3. הכנת 50% פג (ממוצע MW ~ 12 kDa).
  2. שימוש 24 טוב תלוי טיפה צלחות.
  3. למרוח משחה איטום בטבעות מורמות של כל טוב.
  4. להכין את הפתרון טוב כדלקמן (ריכוז סופי): 100 מ מ BisTris pH 7.0-7.5, 2.8-3.5% לתוספי סולפט ~ 15 kDa, 8.5-10% יתד ~ 12 kDa. להכין פתרון טוב 1 מ"ל ב 1.5 mL צינורות.
    הערה: וריאציה משנית במצב התגבשות נצפתה בהתאם האצווה של חלבון, ו/או לתוספי סולפט, לכן גירסת ניסיון של טווח קצר מומלץ. הן BisTris והן BisTris פרופאן מאגרים של אותו טווח pH תשואות קריסטלים יחיד.
  5. לשמור על צלחות שמנונית והפתרונות טוב בחדר קר לפחות שעה.
  6. להכין IKK1:Inhibitor מורכבים כמתואר ב- 4.3. העבר את הפתרונות טוב משפופרות 1.5 mL הבארות בודדים של צלחת טוב 24.
  7. נקי siliconized (מסחרי או ללא צורך במיקור חוץ (siliconization/silanization)) זכוכית שער גולשת באמצעות מגבונים נטולת ולהחיל סילוני אוויר בלחץ גבוה הצביעו באמצעות מטלית תרסיס זמינים מסחרית.
  8. מקום 1 – 1.5 μL של פתרון טוב על דף שער נקי. פיפטה שווה נפח IKK1:inhibitor מורכבים, לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 3 - 4 פעמים. להפוך את תלוש כיסוי זכוכית במקום על בהתאמה עם מלקחיים, לאטום היטב על-ידי לחיצה על השמן.
  9. לאחר הגדרת כל הטיפות של צלחת 24-ובכן, דגירה הלוח בחדר הקר בחושך. בדוק מדי פעם את טיפות תחת מיקרוסקופ על המראה ועל התפתחות הגבישים.
    הערה: זה לא נבדק אם המקננת קריסטל צלחות תחת האור לשנות את התוצאה. . זה קריטי, עם זאת, כי הצלחות מודגרת סביבה בעלת מינימום/לא רטט

7. הקפאה הגנה של גבישים

  1. הכנת פתרונות הקפאה.
    1. להכין הקפאה A (~ 2% לתוספי חומצה גופרתית, ~ 10% יתד 12000, 60 מ מ BisTris פרופאן (של אותו pH כפתרון טוב המיועד), 5 מ מ טריס pH 7.5, 40-50 מ מ NaCl, 2.5% גליצרול).
    2. להכין הקפאה B (~0.3% לתוספי סולפט, ~ 10% יתד 12000, 60 מ מ BisTris פרופאן (של אותו pH כפתרון טוב המיועד), 5 מ מ טריס pH 7.5, 40-50 מ מ NaCl, 20 או 25% גליצרול או 20 או 25% אתילן גליקול).
      הערה: הבדיקה הקפאה שונים-protectants בנוסף גליצרול ו אתילן גליקול (למשל, פג 200, 400 פג, 550 גברת פג, 1000 פג).
  2. בעדינות הסר תגית כיסוי זכוכית המכיל את הקריסטל והנח אותו על משטח יציב עם המרחק קריסטל כלפי מעלה. בעדינות מוסיפים 10 μL של פתרון A הקפאה על הירידה ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting כך הקריסטל לא נגע.
    הערה: זה מנקה את השטח קריסטל של פסולת, לעזור equilibrate את הקריסטל עם המאגר הקפאה ראשונית. למנוע מתח מכני, תרמי על הגביש. בצע את כל השלבים הבאים מתחת למיקרוסקופ כדי למנוע נזק הקריסטל.
  3. אט-אט להסיר נוזל מן הגביש ולשמור על 5-8 μL של הפתרון. למנוע התייבשות של הגביש. . תשמרי על קיצוניים כדי להימנע מכאניים והתייבשות של הקריסטל בתוך כל והשלבים הבאים
  4. בעדינות להוסיף 2.5 – 4 μL של הפתרון B הקפאה על הטיפה, לערבב בעדינות על ידי pipetting. מכסים עם צלחת פטרי קטן כדי למנוע זרימת אוויר ישירה מעל הקריסטל. מחכים 5 דק תמיד להיות זהיר שהקריסטל לא תסבול שינויים מהירים של לחץ אוסמוטי או התייבשות.
  5. חזור על שלב 7.4 ארבע פעמים להתאקלם לאט את הקריסטל בתוך תמיסת הקפאה.
  6. לשמור 10 – 20 μL של הפתרון הקפאה בשלב זה (כלומר, לאפשר את הקריסטל שאתה רוחץ בו כ- 20 – 25% הקפאה-תרכובת המכילה פתרון). משרים למשך תקופות שונות של זמן (5 דקות כדי 1 h) הקפאה-הפתרון הסופי.
  7. להקפיא ריבוי הגבישים בנקודות זמן שונות.
  8. לבחור בקפידה גביש יחיד מהמסירה בלולאה המתאים הקפאה-רכוב על בסיס נאות עם מים עמוקים-הקפאת נוזלי N2. יש לבצע פעולה זו בצורה חלקה ומהירה כדי למנוע היווצרות קרח על הגביש.
    הערה: לבחור את הקריסטל באמצעות לולאה בקוטר מעט גדול יותר מאשר הציר הארוך של הגביש כך זה שניתן להציב את מד זווית רובוטית בשימוש מתקדם הפוטון מקור, Argonne National Laboratory.
  9. אחסן את הקריסטל המכיל הקפאה-לולאות בדיסקיות שקוע בתוך נוזל N2. לאחסן דיסקיות אלו נוזלי N2 דיואר את הבקבוק עד שיהיו מוכנים למשלוח עבור רנטגן עקיפה-סינכרוטרון. המשך איסוף נתונים של קרני רנטגן ועיבוד (סעיפים 8 ו-9).
    הערה: הנתונים עקיפה של גבישים IKK1 ממקורות רנטגן הביתה היו לא ברזולוציה גבוהה מספיק עבור מבנה נחישות ניסויים, למרות אותו שצוינו. האיכות של גבישים כדי באולמות ההקרנה סינכרוטרון. כל נתוני דיפרקציה נאספו ב beamlines שונים (בעיקר 19ID) של מקור פוטון מראש, Argonne National Laboratory, ארה ב.

8. איסוף נתונים של רנטגן

  1. איסוף נתונים קרני רנטגן-הפרעות לקרן החלקיקים ID19 של מקור סינכרוטרון APS, באמצעות תוכנות אוסף נתונים מרחוק34.
    הערה: למעלה מ- 100 קריסטלים נבדקו עבור מאפייניהם עקיפה. הקריסטלים באופן שגרתי diffracted ברזולוציה של 7-11, רק לעתים רחוקות קריסטלים כי diffracted אל מעבר 5 Å היו שנצפו, ורק אחד גדול קריסטל diffracted מעבר 4.5 Å. מאז הקריסטלים מתנוונים במהירות במהלך איסוף הנתונים, נאספו נתונים (datasets) על חלקים שונים של אותו הגביש. זה היה אפשרי מאז הגבישים היו גדולים (גדול יותר מ 400 מיקרומטר), והיה קוטר הקרן משמש 100 מיקרומטר.

9. רנטגן עיבוד נתונים

  1. מיזוג כל datasets שנאסף על חלקים שונים קריסטל באותו34.
    הערה: datasets שבע מוזגו מן הגביש הטוב ביותר, תוצאות הנתונים היה 93% ביצוע. הכולל אני / σ היה ~ 6.8) והיה Rmerge 89% בסל ברזולוציה הגבוהה ביותר (5.4-4.5 Å).
  2. תהליך datasets עם HKL200034 כדי לקבל שטח הקבוצה, מידות תא יחידה, תוכן ממס ו הלחנה מתקבל על הדעת של היחידה אסימטרי.

10. מבנה הפתרון

  1. הכנת חיפוש דוגמניות
    1. מבוסס על מודלים מבניים זמין של hIKK2 (pdb מזהה 4E3C ו- 4KIK35), ליצור סדרה של הדימרים עם נטיות שונות של KD N-מסוף (זה הופך את הפתיחה של 30 ו-62, בין P578 של שני KD ב דיימר). אף אחד המודלים האלה הובאו פתרון חיפוש תחליף מולקולרית לאחר ניסויים נרחבים.
    2. ליצור מפה של IKK1 מתוך נתונים יחיד-חלקיקים הקפאה-EM33.
    3. ליצור מודל של האדם IKK1 מן המבנה ברזולוציה הגבוהה ביותר של IKK2 (4KIK מזהה pdb).
    4. עגן את התחומים הבודדים של המודל IKK1 האנושי לתוך הקפאה EM צפיפות מפת IKK1 האנושי באמצעות הנרגן36. זה לסובב את כיוון KD בערך 24 מעלות, ששינה את N-מסוף לפתיחת ~ 58 Å.
    5. כיוון KD של המודל הקפאה-EM מצויד (מונומר) חלות על כל הדימרים המופקים 10.1.1.
  2. החלפת מולקולרית
    1. השתמש הדימרים 10.1.1 ו 10.1.5 כמודלים חיפוש תוכניות הפייזר37, MOLREP38 , CNS39,40.
      הערה: כאן, באמצעות אחד הדימרים של 10.1.5 (פתיחה Å 52) כמודל חיפוש, הדימרים 6 (2 hexamers) היו ממוקמים בתוך היחידה אסימטרי באמצעות MOLREP. Å 52 פתיחת במודל חיפוש דומה 49-50 Å פתיחת הדימרים (הדימרים שש כל) במבנה מעודן.

11. מבנה עידון

  1. מבנה עידון הליך
    1. לתקן את הכיוון ואת המיקום של המודל הראשוני הזה על-ידי עידון של גוף קשיח ב- CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. לחדד את מבנה נוסף באמצעות שיטות מינימיזציה וכסויים חישול מדומה עם פונקציה היעד נראות מקסימלית, תיקון במול בצובר ממיס בעזרת ה CNS מערכת39,40.
    3. לבנות את המודל מבוסס על 2FO-FC ומפות Fo-Fc באמצעות Xtalview41.
      הערה: החל בסיוע DEN עידון42 , רכיבי NC לרסן במהלך ליטושים דיוק טוב יותר של המודל. אכן, עידון DEN השתפרו באופן דרמטי ורשתות R-גורמים של המבנה, הגורם R היה 22.2%, גורם R חינם היה 27.8% עבור המודל הסופי. שיפור דרמטי של ה-R חינם חייב להיות בגלל המודל רמת דיוק גבוהה של תחומים IKK1 היינו שהפיק מן המודל IKK2 (4KIK).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיבוט וביטוי של מבנים שונים של IKK1/α
אורך מלא ש-ikk1 האנושי/α היה משובטים לתוך הביטוי baculovirus וקטור pFastBacHTa בתוך למושבכם ההגבלה EcoRI ו- NotI להשיג של N-מסוף hexa-היסטידין מתויגות IKK1. היתה אפשרות להסיר את התג על ידי אס פרוטאז עיכול. כיוון אורך מלא IKK1/α מכיל אזורים גמישים בשני הקצוות, אזורים גמישים בדרך כלל לעיבוד חלבון קשה להתגבש, שיבטנו שונים קטום שברי IKK1/α בתוך האתרים הנ של וקטור pFastBacHTa. מוטציות שונות לחיתוך של IKK1/α נוצרו עם פראי-סוג (wt) וגם S1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתרון ייצור, התגבשות, מבנה של שני חלבונים IKK קשורים
. יצאנו כדי לקבוע את המבנה של IKK1/α עם הרעיון שיהיה זה תרגיל פשוט למדי בהתחשב בניסיון שלנו עם ייצור החלבון IKK2/β, התגבשות ונחישות מבנה... עם זאת, היינו מאוד מופתעים כי אלה שני חלבונים הקשורים התנהגו אחרת לגבי הקלות של התגבשות. למרות המאמצים של מספר מעבדות פרופיל גבוה, הקביעה של מבנה IKK1 לקח כמעט שני עשורים. זה נבעה במידה רבה כמה צווארי בקבוק מפתח.

הקושי הראשון הוא לקבל טופס חלבון מסיס וטהור מאוד. מערכת ביטוי תא חרקים א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים הצוות beamlines 19ID, 24ID, ו 13ID מתקדם פוטון במקור, Lemont, איל, לתמיכה במהלך איסוף נתונים על קריסטלים שונים. אנחנו מודים דמיטרי Lyumkis, מכון סאלק להבאה אותנו על המפה הקפאה-EM ברזולוציה נמוכה בשלבים המוקדמים של EM מפה/דגם בניין, אשר שימש כדי לבנות את הדגם הראשוני של חיפוש תחליף מולקולרית IKK1. המחקר שהוביל את התוצאות הללו זכה למימון מענקים NIH AI064326, CA141722 ו- GM071862 כדי GG. SP הוא כעת Wellcome אמון DBT הודו ביניים עמית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin הופסק כעת, והוחלף על ידי Cellfectin II
Sf900 III מדיום תאי חרקיםThermo Fisher Scientific12658-027
תאי SF9Thermo Fisher Scientific12659017
נוגדן נגד IKK1Novus BiologicalsNB100-56704נמכר בעבר על ידי Imgenex
אנטי פנטהנוגדן שלוQiagen34460
PVDF ממברנהMilliporeIPVH00010ניטרוצלולוז ניתן להשתמש גם
Ni-NTA agaroseQiagen30210
ברדפורד מגיב בדיקהBioRad500001
Superdex 200 עמודהGE Healthcare28989335
רכז AmiconMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
תרכובת ABayer
Calbiochem מעכב IKK XIICalbiochem401491
StaurosporineSIGMAS4400
MLN120BMilleniumפריט
AMPPNPSIGMAA2647
דקסטרן סולפטSIGMA51227, 42867, 31404,Dextran
sulfateAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172חלקם חדשים Cat # בקטלוג SIGMA. מה שהיה לנו היה במקור מפלוקה שהיה לו חתול #.
התגבשות
מסך קריסטל I ו-II (מסך קריסטל HT)Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion ו-PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 ו-PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 ו- SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
תושבות קריסטל HamptonResearchHR8-188, 190, 192, 194
סינכרוטרוןמקור הפוטון המתקדם (APS) במשרד האנרגיה של ארה"ב s Argonne National LaboratoryBeamline 19 IDמקור הפוטון המתקדם (APS) במשרד האנרגיה של ארה"ב s המעבדה הלאומית ארגון מספקת קרני רנטגן בהירות במיוחד, בעלות אנרגיה גבוהה הנוצרות על ידי טבעת אחסון למחקר כמעט בכל הדיסציפלינות המדעיות.
מתנהמסכי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

מאמרים קשורים