חלבונים משפחתי קטן הקשורות אוביקוויטין צירוף (סומו) הם מצומדת ל ליזין שאריות לחלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור רטינובלסטומה (Rb) חלבון SUMOylation בתנאים אנדוגני, אקסוגני בתאים אנושיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אין ויוו זיהוי וניתוח של SUMOylation חלבון Rb בתאי אדם
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
השינויים post-translational של חלבונים חיוניים לוויסות תקין של אותות תאיים. בין השינויים האלה, צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו) הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently שאריות ליזין מגוון רחב של חלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים, שעתוק גנים, תיקון ה-DNA, חלבונים האינטראקציה השפלה, תחבורה subcellular ו מעבר אותות. הגישה הנפוצה ביותר כדי זיהוי חלבונים SUMOylation מבוסס על הביטוי ולטיהור מתויג חומרים של חיידקים, המאפשרות במבחנה הביוכימי לתגובה וזה פשוט מתאימים למיעון מכניסטית שאלות. עם זאת, בשל המורכבות של התהליך של SUMOylation ויוו, זה יותר מאתגר כדי לזהות ולנתח חלבון SUMOylation בתאים, במיוחד כאשר תחת תנאים אנדוגני. מחקר שנערך לאחרונה על ידי מחברי המאמר חשף רטינובלסטומה אנדוגני (רובידיום) חלבון, מדכאי מהווה מרכיב ברגולציה השלילית של ההתקדמות מחזור התא, הוא במיוחד SUMOylated בשלב G1 מוקדם. מאמר זה מתאר פרוטוקול זיהוי, ניתוח של Rb SUMOylation בתנאים אנדוגני והן אקסוגני בתאים אנושיים. פרוטוקול זה מתאים החקירה פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של הסומו-השינוי של Rb, כמו גם רבים אחרים, ממוקדות סומו חלבונים, בתאים אנושיים.
מבוא
שליטה מדויקת של מחזור התא. להתקדם בתוך התאים האיקריוטים מבוסס על רשת רגולציה הדוקה, אשר מבטיח כי האירועים מתקיימים בצורה מסודרת1,2. אחד השחקנים מפתח רשת זו הוא החלבון רטינובלסטומה (Rb), הראשון משובטים הגידול משתיק קול1,3. חלבון Rb נחשב מווסת שלילי של התקדמות מחזור התא, במיוחד עבור ה-G0/G1 מעבר פאזה S ולאחר גידול צמיחה4,5. כישלון של פונקציה Rb גם ישירות מוביל גידול ממאיר תוך-עיני הנפוצות ביותר אצל ילדים, רטינובלסטומה, או תורם להתפתחות של סוגים רבים אחרים של סרטן5. יתר על ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1-זיהוי של אנדוגני Rb SUMOylation בשלב G1 מוקדם
- תא סינכרון תרבות, מחזור התא.
- HEK293 לשמור על תאים מדיום הגידול המכיל Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1% עט-דלקת ו-10% עוברית שור סרום (FBS)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 בתוך אינקובטור.
- לסנכרן את התאים HEK293 בשלב G0.
- ספירת התאים HEK293 משתמש של hemocytometer וזרע ~1.5 x 10 7 תאים 15 ס מ צלחת עם 25 מ ל מדיום הגידול עבור 24 שעות לפני הטיפול. כשמגיעים זרימה של 70% - 80%, לשאוב את המדיום ואת שטיפת התאים פעמיים עם 5 מ"ל prewarmed באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- להוסיף 25 מ ל DMEM המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין דגירה התאים ב 3....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לזיהוי SUMOylation Rb אנדוגני במהלך מחזור התא התקדמות, מחקר זה קודם מסונכרנים תאים HEK293-חמישה שלבים שונים של מחזור התא (G0, מוקדם G1, G1, S ו- G2/M) כמתואר בסעיף פרוטוקול של מאמר זה. האיכות של סינכרון אושר באמצעות חומצות גרעין הכתם עם יודיד propidium שלאחריה יבוא ניתוח cytometry זרימה (איור 1). בשלב הבא, התאים שנאספו, lysed על ידי denaturing ריפה מאגר. מעכבי פרוטאזות סומו, N-Ethylmaleimide, נוספה ריכוז סופי של 20 מ מ כדי לשמר את האות סומו יליד במהלך הניסויי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מתאר פרוטוקול לזהות ולנתח SUMOylation אנדוגני של Rb בתאים אנושיים. כפי בשיטה זו מתמקדת באופן ספציפי חלבון Rb אנדוגני ללא כל ההתחלפות של האות הגלובלית הקשורות סומו, זה כלי חשוב עבור חוקרים Rb-סומו שינוי בנסיבות הפיזיולוגיות טבעי לחלוטין.
כדי להשיג מטרה זו, חשוב לזכור כי: 1) למרות סומו כוללת ארבעה איזופורמים (SUMO1-4, אחד מקודד על ידי גנים שונים) בהשוואה ubiquitination, כל המינים סומו נפוצים הרבה פחות; 2) עבור רוב חלבונים היעד סומו, רק חלק קטן של חלבון נתון הוא SUMOylated על מצב יציב, אש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי (מענק מס 14411961800) הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 81300805).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| מלח חוצץ פוספט (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| תימידין | סיגמא | T9250 | |
| נוקודאזול | סיגמא | M1404 | |
| פרופידיום יודיד | תרמו פישר סיינטיפיק | P3566 | |
| טריטון X-100 | אמרסקו | 694 | |
| RNase A | תרמו פישר סיינטיפיק | EN0531 | |
| N-אתילמלימיד | סיגמא | E3876 | |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | תחליף AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | מעכב פרוטאז AMRESCO | M158 | |
| אימונוגלובולין עכבר | |||
| Rb נוגדנים | איתות תאים | #9309 | |
| חלבון A/G-חרוזי ספרוז | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | SC-2003 | |
| ליפופקטמין-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| חומצה ניטרילוטריאצטית ניקל (Ni-NTA) חרוזי אגרוז | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% שיפוע SDS-PAGE ג'ל | BIO-RAD | 4561096 | |
| פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ממברנה | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | נוגדן M147 | |
| טובולין | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 נוגדן | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| נוגדן GFP | Abmart | M20004 | |
| חזרת פרוקסידאז (HRP) נוגדן משני | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| ערכת כימילומינסנציה משופרת (ECL) | תרמו פישר מדעי | 32106 |
מקורות
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
