התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

Nan Zhang; Edward Membreno; Susan Raj; Hongjie Zhang; Liakot A Khan; Verena Gobel

doi:10.3791/56101

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

9.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56101

⸱

3 באוקטובר 2017

Nan Zhang¹^,² , Edward Membreno¹ , Susan Raj¹ , Hongjie Zhang¹^,³ , Liakot A Khan¹ , Verena Gobel¹

¹Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, ²College of Life Sciences, Jilin University, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau

במאמר זה

סיכום

התעלה excretory C. elegans הוא מודל תא בודד ייחודית לניתוח חזותי ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן. פרוטוקול זה מתאר שילוב של גישות, וישימה זיהוי ואפיון של מולקולות בימוי חד־תאיות tubulogenesis, הפסגה להן קרום ו לומן סטנדרטי גנטי/RNAi והדמיה.

תקציר

התעלות excretory 4 C. elegans הינם צינורות צרים מורחב לכל אורך החיה של תא בודד, עם endotubes תאיים כמעט באותה מידה רחוק מורחב זה לבנות ולייצב את לומן עם קרום, submembraneous שלד התא אופי הפסגה. התא excretory מרחיבה את אורכו כ 2000 פעמים ליצירת תעלות אלו, מכין מודל זה ייחודי להערכה ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן, מורפוגנזה לומן תאיים ו חד־תאיות tubulogenesis. פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד לשלב תקן תיוג, רווח, הפסד-של-פונקציה גנטית או התערבות ב RNA (RNAi)-, וגישות מיקרוסקופיים לשימוש מודל זה כדי לנתח באופן חזותי ולנתח באופן פונקציונלי תהליכים אלה ברמה המולקולרית. כדוגמה של גישה תיוג, הפרוטוקול מתאר את הדור של חיות הטרנסגניים עם חלבונים פיוז'ן פלורסנט לניתוח בשידור חי של tubulogenesis. כדוגמה של גישה גנטיים, זה מדגיש את נקודות המפתח של חזותי מבוסס-RNAi אינטראקציה מסך המיועד לשינוי הפנוטיפ רווח-של-הפונקציה לתעלה פיברוזיס. הן השיטות הספציפיות תיאר כיצד: תווית והמחש התעלות בהבעת פלורסנט חלבונים; לבנות ספרייה RNAi יישוב ו אסטרטגיה RNAi הקרנת לניתוח מולקולרית של תעלת מורפוגנזה; מבחינה ויזואלית להעריך שינויים של תעלת פנוטיפים; ציון אותם על ידי לנתח פלורסצנטיות מיקרוסקופ; לאפיין את תעלת subcellular הרכיבים ברזולוציה גבוהה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית; ולכמת פרמטרים חזותי. הגישה היא שימושית עבור החוקר מעוניין ניצול תעלת excretory C. elegans עבור זיהוי ואפיון גנים המעורבים בתהליכי phylogenetically שנשמרת לומן תאיים ו חד־תאיות מורפוגנזה שפופרת.

מבוא

כל האיברים הפנימיים מורכבים של צינורות, חיונית עבור שלהם פונקציות שונות, כגון תחבורה, חילופי גזים, נוזלים וחומרים מזינים, את הפרשת פסולת מטבולית. אופיים מקוטב, עם ממברנות הפסגה, lumenal ברורים, מותאמת עבור פונקציות ספציפיות אלה, ויש פגמים להן המערכות שלהם אנדו - ואת קרום פלזמה הגורם השכיח של מחלות אנושיות¹^,². הרוב המכריע של צינורות של להערכת ושל האיברים הפנימיים הם multicellular ויוצרים לומן intercellularly; עם זאת, חד־תאיות צינורות, היוצרים לומן intracellularly, ניתן, לדוגמה, לייצג בדיוק כמו 30%-50% של מיטות נימי האנושי². הממברנות מקוטב של רב - וצינורות חד־תאיות דומים בהרכב, למרות micr....