Method Article

ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

DOI:

10.3791/56122

⸱

July 19th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 2Diagnostic Systems Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID), 3Microscopy Innovations LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק הוראה עבור דגימות וירוס מכתים שלילי אשר יכול בקלות לשמש במעבדות BSL-2, -3, -4 או -4. הוא כולל את השימוש בקפסולה עיבוד חדשנית, אשר מגן על רשת אלקטרונים שידור מיקרוסקופיה ומספק למשתמש טיפול קל יותר בסביבות סוערות יותר בתוך biocontainment.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) משמש כדי לבחון את התשתית של וירוסים ופתוגנים פתולוגיים אחרים עם רזולוציה ננומטר. רוב החומרים הביולוגיים אינם מכילים אלמנטים צפופים המסוגלים לפזר אלקטרונים כדי ליצור תמונה; לכן, כתם שלילי, אשר מציב מלחי מתכת כבדים צפופים סביב המדגם, נדרש. כדי לדמיין וירוסים ההשעיה תחת TEM הם חייבים להיות מיושמים על רשתות קטנות מצופה משטח שקוף רק ננומטר עבה. בשל גודלם הקטן שבריריות, רשתות אלה קשה להתמודד בקלות עברו זרמי אוויר. משטח דק פגום בקלות, משאיר את המדגם קשה או בלתי אפשרי התמונה. וירוסים זיהומיים חייבים להיות מטופלים בארון biosafety (BSC) וחלקם דורשים סביבה מעבדה biocontainment. וירוסים מכתים ברמות biosafety (BSL) -3 ו -4 הוא מאתגר במיוחד כי סביבות אלה הם יותר סוערים טכנאים נדרשיםO ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), אשר מקטין מיומנות.

במחקר זה, הערכנו מכשיר חדש כדי לסייע בוירוס מכתים שלילי biocontainment. המכשיר הוא כמוסה שפועלת כמו טיפ פיפטה מיוחדים. לאחר הרשתות נטענות לתוך הקפסולה, המשתמש פשוט שואף ריאגנטים לתוך הקפסולה כדי לספק את הנגיף ואת הכתמים לרשת encapsulated, ובכך ביטול טיפול המשתמש של רשתות. למרות טכניקה זו תוכננה במיוחד לשימוש BSL-3 או -4 biocontainment, זה יכול להקל על הכנת המדגם בכל סביבת מעבדה על ידי הפעלת מכתים שלילי קל של הנגיף. שיטה זו יכולה גם להיות מיושם להכין דגימות TEM שלילי מוכתם של חלקיקים, מקרומולקולות ודגימות דומות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הוא כלי יעיל לצפייה מורפולוגיה ו ultrastructure של דגימות ביולוגיות כי הם קטנים מדי כדי להיראות עם מיקרוסקופ אור מסורתי 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs לירות electrons דרך דגימה דקה מאוד לייצר תמונה ברזולוציה גבוהה כמו האלקטרונים יש אורך גל קצר בהרבה מאשר אור. אזורים של המדגם כי לכופף או לחסום אלקטרונים מופיעים כהה, ואילו אזורים כי הם אלקטרונים lucent מופיעים לבן.

חוסר חומר צפוף אלקטרונים עושה וירוסים קשה להציג....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניסוי הכנה בסביבת BSL-2 לפני עבודה עם דוגמאות וירוסים

  1. הכן או לרכוש Formvar ופחמן מצופים TEM רשתות נחושת, בדרך כלל 200-400 רשת.
  2. הכנס את רשתות TEM מצופה לתוך כמוסות.
    1. השתמש בעדשה מוגדלת כדי להפוך את התהליך הזה קל לביצוע. רשת אחת או שתיים ניתן להכניס לתוך כל כמוסה. טרום טעון קפסולות ניתן לרכוש כדי לבטל את שלב זה אם תרצה.
  3. מעבירי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת הקפסולה לייצר מכתים שלילי באיכות טובה עבור הדמיה TEM:

ראשית, הערכנו את איכות התמונות שנוצרו על ידי שימוש הן שיטת טיפה ידני ושיטות כמוסה עבור מכתים שלילי ebolavirus זאיר. Ebolaviruses הם חברים של Filoviridae המשפחה, יחד עם וירוס Marburg. Ebolavirus הוא בדרך כלל 80-100 ננומטר בקוטר יכול להיות מעל 1000 ננומטר אורך. Ebolavirus חייב להיות מטו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכתים שלילית היא טכניקה TEM יקר להערכת ו אומדת וירוסים, קומפלקסים חלבונים וחלקיקים. הכנה דגימה של דגימות אלה על ידי הזזת ידני של רשתות מגיב לכתמים שליליים כבר פרוטוקול קלאסי במשך יותר מחצי מאה. זהו תהליך פשוט, אך דורש מומחיות שנרכשו באמצעות הכשרה להשלמה מוצלחת. מכתים שלילי מעולה נחשב עדיין המדינה- of-the-art מיומנות להגדיר הרצוי ביותר במעבדות TEM רבים. השיטה הקפסולה יש יתרונות ברורים על פני שיטת טיפות ידני, במיוחד במעבדות biocontainment. ראשית, שיטת טיפה ידנית דורש הכשרה משמעותית .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות המופיעות במאמר הן אלה של המחברים ואינן נתמכות בהכרח על ידי צבא ארצות הברית או משרד ההגנה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ולהודות לד"ר ג'ון קארה ולרוואנה שוקמן על מתן ננו-אבולה ננו-VLP, ד"ר רג'יני מודסני על מתן וירוס צ'יקונגוניה, וד"ר צ'ארלס (ג'ייסון) סנדלר על מתן מורלין לוקמיה VLPs המבטאים גליקופרוטאינים של Ebolavirus. כמו כן, ברצוננו להודות ל- MAJ Carl Carl Soffler על הקלת תכנית ההתמחות של הקיץ (SIP) ועל תכנית החניכות למדע והנדסה (SEAP) ולד"ר קתרין וילהלמן על אימון בטיחות המעבדה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
רשתות TEM מצופות פחמןSPI3420C-MB200 רשת Cu Pk/100
mPrep/g קפסולותEMS85010-01קופסה
mPrep/f מצמדיםEMS85010-11סטנדרטי 16/Pk
glutaraldehdydeEMS1632050% תמיסה, EM כיתה
אוסמיום טטרוקסידEMS191904% תמיסה
אורניל אצטטEMS22400אבקת
אשלגן פוספוטונגסטי חומצהEMS19500אבקת
נייר סינוןWhatman1450-090גודל 50
העברת אלקטרונים מיקרוסקופJEOLJEM-1011TEM
מימית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Negative StainingTEM GridsBiocontainmentVirus TEMCapsule MethodElectron MicroscopyGlutaraldehyde FixativeUranyl AcetatePhosphotungstic AcidOsmium Tetroxide

Related Articles