פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

סיכום

הנפוץ ביותר ניתוח תוכן הבטן של macroinvertebrates הם חזותיים. הדורשים ידע אינטנסיבי ונעשית מורפולוגי של אורגניזמים טרף, הם מתגעגעים טרף גוף רך, בשל comminution חזקה של טרף, הם כמעט בלתי אפשרית עבור אורגניזמים מסוימים, כולל amphipods. אנו מספקים נתונים היסטוריים, רומן גישות גנטיות עבור macroinvertebrate טרף זיהוי בתזונה של amphipods.

תקציר

ניתוח במארג המזון חיוני לצורך הבנה טובה יותר של מערכות אקולוגיות. לדוגמה, אינטראקציות מארג מזון יכול עוברים שינויים חמורה נגרמת על ידי הפלישה של מינים-ילידים. עם זאת, זיהוי מדויק של שדה טורף-טרף אינטראקציות קשה במקרים רבים. ניתוחים אלה לעיתים קרובות מבוססות על בדיקה חזותית של תוכן הבטן או הניתוח של יחסי איזוטופ יציב (אלפא¹⁵N ואלפא¹³ג). שיטות כאלה דורשים ידע מקיף, בהתאמה, גיוון מורפולוגיות או חתימה איזוטרופי של אורגניזמים טרף בודדים, שמוביל מכשולים הזיהוי המדויק של אורגניזמים טרף. ניתוח תוכן ויזואלי הבטן במיוחד לזלזל אורגניזמים טרף גוף רך, כי השרייה, שאורכה, בליעה, העיכול של אורגניזמים טרף להקשות זיהוי של מין מסוים. לפיכך, פולימראז תגובת שרשרת (PCR) המבוסס על אסטרטגיות, למשל השימוש של קבוצה ספציפית פריימר מגדיר, לספק כלי רב עוצמה עבור החקירה של אינטראקציות מארג מזון. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לחקור את תכולת הבטן הצרכנים macroinvertebrate מן השדה באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני חומצה deoxyribonucleic 30s ריבוזומלי (rDNA). דנ א יכול להיות חילוץ או כל דגימות (במקרה של taxa קטנה) או מתוך הבטן התוכן של דגימות שנאספו בשטח. נוכחות ויעילות פונקציונלי של תבניות DNA צריך לאשר ישירות מן הפרט נבדק באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר פילוח של יחידת משנה בהתאמה של ה-DNA. אנחנו גם להוכיח כי טרף נצרך יכול להיקבע נוספת לרמה מינים באמצעות PCR עם תחל המיועדות לקבוצות שלא שונתה בשילוב עם גדיל אחד העוקבים קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים באמצעות ג'ל לזיהוי. יתר על כן, אנו מראים כי השימוש שונים צבעי פלורסנט כתוויות מאפשר הקרנה מקבילים של שברי DNA של קבוצות שונות טרף מדגימות מרובים בטן תוכן באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס.

מבוא

אינטראקציות טורף-טרף, המהווים את רוב האינטראקציות עם מחלות ואת הדינמיקה מארג מזון, הם היבטים מרכזיים כדי לאפיין את פלקסים של חומר ואנרגיה ברחבי במארג המזון בתוך ובין מערכות אקולוגיות, אשר אחת ממטרותיה העיקריות של אקולוגיה ¹. קביעת מקור וזרימה של פחמן וחומרים מזינים היא בהבנה של קישוריות אקולוגית בין מערכות אקולוגיות². עם זאת, מערכות אקולוגיות, כגון נהרות, catchments שלהם, לא רק מקושרים על ידי פלקסים של חומר אורגני וחומרים מזינים, אלא גם על ידי התנועות של אורגניזמים³. לפיכך, שינויים הגידול מפריע לזרם של משאבים לקשר מערכות אלה יכול בחום לשנות מזון באתרי אינטרנט של שתי מערכות אקולוגיות, לא רק ישירות אלא בעקיפין גם על-ידי שינוי ההרכב בהתאמה של קהילות טורף-טרף. למשל, שינויים של במארג המזון הוכחו להיות מקושר התנועות של מינים (למשל, פורל הקשת בענן) טורף יחיד⁴. שינויים כאלה שעלולים לאיים על המגוון הביולוגי לבין תפקוד המערכת האקולוגית הימית. לפיכך, ניתוח אינטראקציות טורף-טרף בשדה חיונית כדי לקבוע את ההשפעה של האדם-induced שינויים סביבתיים, כגון שיטות ניהול מים, על המגוון הביולוגי מקורית של המערכת האקולוגית הימית.

מאחר מעקב אחר קישורים עם מחלות קשות במערכות מורכבות, מספר גישות הוקמו המאפשרים את ההערכה של האכלה אינטראקציות שדה⁵. באופן מסורתי, חקירות של האכלה אינטראקציות בשדה מבוססים על זיהוי חזותי שרידי טרף במעיים ביתור ודורשים ידע נרחב על הטרף מורפולוגיות הגיוון. ניתוח תוכן ויזואלי בטן סיפקו תובנות על השימוש במשאבים של מספר קבוצות של צרכנים (למשל, וריאציה עונתיים בתזונה של לובסטר⁶ דגים^7,8 או האכלה והעדפות של משטרגליים). עם זאת, התהליך הפיזי של מערכת העיכול מקשה על ניתוח תוכן ויזואלי בטן ומתגעגעת בדרך כלל גוף רך טרף-אורגניזמים⁹. עבור מינים האכלה דרך בליעה נוזלי או כמה צרכני הגעה באופן אינטנסיבי comminute את האוכל שלהם לפני בליעה, כמו amphipods, זיהוי חזותי של הטרף מינים בתוכן הבטן הוא בלתי אפשרי¹⁰. בשל מגבלות אלו, אנליזה מולקולרית מספק אלטרנטיבה מבטיחה.

ניתוחים מולקולריים הפכו עתה כלי משותף המאפשר זיהוי מהיר ומדויק טרף בתכולת מעיים. מגוון טכניקות אלה הוא מגוונים: אסטרטגיות בהתבסס על נוגדנים חד-שבטיים או תגובות שרשרת של פולימראז (PCR) משמשים לעתים קרובות, בגלל שלהם גבוהה ירידה לפרטים ורגישות¹¹. הפיתוח של נוגדנים חד-שבטיים החדש ואת עלות-אינטנסיבית, לכן, היישום של טכניקות מולקולריות אחרות הוא יותר שימושי כאשר נוגדנים אינם קיימים כבר¹¹. גישה נפוצה אחרת היא ההגברה של מחוזות חומצה deoxyribonucleic (DNA), כמו חומצה ריבונוקלאית 30s ריבוזומלי (RNA) גנים נוכח רוב המינים, באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר^12,13. בעת שימוש בטכניקה זו, הוא לעתים קרובות לא ניתן לזהות מגוון רחב של אורגניזמים טרף בתוך מקורות מעורבות של הדנ א¹⁴. גישה יעילה כדי להימנע כזה חיסרון הוא להשתמש המיועדות לקבוצות פריימר מגדיר עבור ניתוח תוכן הבטן גנטי. שנועד להגביר רק DNA אזורים של קבוצות יעד מסוים או לא לכלול כל שאר המינים^15,16, המיועדות לקבוצות תחל להפעיל זיהוי של אורגניזמים טרף ברמה טקסונומי של הקבוצות שצוין ללא ניתוחים משניים של עלות-אינטנסיבית. עם זאת, כמו כל בטן ניתוח תוכן, ניתוח כזה מספקים רק תמונה של האכלה התנהגות. לכן, שילוב של ניתוח תוכן הבטן מולקולרית עם ניתוחים של שילוב זמן המשדרים טבעי (למשל, איזוטופים היציבים) נחשב מועיל^1,2.

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת חקירות מבוסס ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני ribosomal DNA (rDNA) אזורים להיות משולבת עם איזוטופ יציב ניתוחים של הדגימה זהה. אנו מתארים את הגילוי של ה-DNA של קבוצות טרף יחיד באמצעות agarose בג'ל. בנוסף, אנו מציגים הזדמנות נוספת במורד הזרם ניתוחים של מוצרי ה-PCR תחל המיועדות לקבוצות כזה ישים בכל פעם בטקסונומיה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר ירידה לפרטים תחל נדרש. כי הדנ א נטושים יחיד (ssDNA) קטעים טופס שלישוני הייצורים החיים שנקבעות על-ידי רצף העיקרי שלהם¹⁷, וריאציות קטנות בתוך שברי מוגבר על ידי תחל המיועדות לקבוצות כאלה להוביל שינויים הסתגלותי. שינויים כאלה יכולים יזוהו על-ידי צירוף יחיד קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים עם ג'לים לזיהוי^17,18, מתן אפשרות של זיהוי מדויק יותר של הטרף אורגניזמים (עד לרמת מינים).

בעוד agarose בג'ל הוא כלי נפוץ וזול כדי להמחיש שברי DNA ולקבוע שלהם אורך משוער¹⁹, הרזולוציה תלוי בכמות ה-DNA ומשמש לצבוע מכתימים²⁰. בדרך כלל, הפריט החזותי הוא ישר קדימה בעת עבודה עם דגימות דנ א טהור, אבל כמויות נמוכות באופן פוטנציאלי של הטרף DNA בתוכן הבטן של הצרכנים יכול לסבך על מניה של agarose ג'ל אלקטרופורזה תוצאות. עדיין, זיהוי שיטה זו אפשרית על המסך מספר נמוך של הצרכן דגימות מן השדה עבור אחד או כמה טרף קבוצות, אך סיבוך על מניה גורם ההקרנה של מספר רב של דוגמאות taxa טרף מרובות מאוד זמן אינטנסיבית ובכך אכן. שיטת זיהוי רגיש יותר הוא ניתוח אוטומטיות של קטעים באמצעות אלקטרופורזה נימי, אשר בנוסף מאפשר קביעת האורך המדויק של שברי²¹. מספר microsatellite המבוסס על מחקרים הראו כי באמצעות צבעי פלורסנט שונים כמו תוויות, זה אפשרי ויוכל לקבוע שברים שונים של אורך דומות על ידי אוטומטיות רסיס ניתוח^{22,23, 24}. לכן, אנו מציגים גם פרוטוקול מפורט לצורך זיהוי מקבילים של ה-DNA של הטרף מרובים באמצעות PCR עם תוויות ייחודיות לקבוצה פריימר ערכות זיהוי באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס עם ברצף אוטומטיות קבוצות. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של חקר מקרה הממחיש זיהוי ה-DNA טרף באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס היא גישה המאפשרת גם על כימות היחסי של הטרף בלע.

פרוטוקול

1. לאסוף Macroinvertebrates מהשדה ולהכין את הדגימות ניתוח תוכן הבטן גנטי.

Macroinvertebrates

1. לאסוף בכל אתר, למיין ליחידים של הצרכן מין עניין לתוך צינורות יחיד, ומקפיאים ישירות חנקן נוזלי או קרח יבש כדי למנוע בטן סיווג והשפלה של דנ א.
   הערה: הימנע משמירת דגימות של האלכוהול, macroinvertebrates מסוימים נוטים להקיא לפני האלכוהול יהרוג אותם.
2. להשתמש רק את מערכת העיכול של בינוניים וגדולים (כ > 3 מ מ) macroinvertebrate מינים עבור ניתוח תוכן הבטן גנטי כך העניין הנותרים של הדגימה יכול לשמש עבור הליכים אחרים (למשל, יציב איזוטופ ניתוח). שים לב כי זה לא רלוונטי כאשר חוקרים taxa קטן מאד כמו קרדית מים. לכן, ניתן לדלג שלבים 1.2.1 ו- 1.2.2.
   1. להפשיר מעט הפרט ומנתחים בקפידה את מערכת העיכול שלה תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים נירוסטה משובחים. הקפד לא לנקב את מערכת העיכול כדי למנוע אובדן של חומר.
   מלקחיים
   2. נקיים באמצעות פתרון טיהור להסיר מציג DNA ו- RNA לאחר הכנת כל מערכת העיכול. לכן, דגירה מלקחיים 10 דקות בפתרון טיהור. לאחר מכן, לשטוף אותם במים סטריליים כדי להסיר שאריות עקבות ולמחוק אותם עם מגבת נייר נטולת מוך.
   3. העברה מערכת העיכול ביתור ריאקציה מנעול כספת 2.0 mL צינור המכיל מאגר הפקת מלח µL (450 µL אפשרי לשימוש של פיפטה חוזרות) 440 [SEB; 0.4 מ' נתרן כלורי (NaCl), 10 מ מ טריס (hydroxymethyl)-aminomethane הידרוכלוריד (טריס-HCl) pH 8.0, ו- 2 מ מ ethylenediaminetetraacetic ניתרן חומצת מלח מייבשים (EDTA) pH 8.0]. חנות הכין דגימות-− 20 ° C מיד עד החילוץ של ה-DNA. ודא כי ה-DNA יחולצו בתוך כמה ימים.
3. להשתמש של פרוטוקול ששונה הפקת מלח גבוהה ²⁵ כדי לחלץ את הדנ א.
   1. לקחת דגימות מהמקפיא. להשתמש מלקחיים להוספת חרוז אחד של נירוסטה 5 מ מ כל שפופרת מדגם והשאר דגימות קפוא על הספסל בטמפרטורת החדר (RT) להפשיר. להשתמש טחנת חרוז homogenize דוגמאות עבור 1 דקות בהרץ 15.
   2. ספין למטה דגימות עם ריצה קצרה של צנטריפוגה. השתמש microliter פיפטות כדי להוסיף 90 µL (100 µL אפשרי לשימוש של פיפטה חוזרות) 10% נתרן dodecyl סולפט הפתרון (מרחביות) ו- 5 µL של 10 מ"ג/מ"ל proteinase ק
   3. מערבולת דגימות ביסודיות, דגירה תערובות h 1 ב 60 מעלות צלזיוס ברעידות קבוע ב 400 סל ד ב thermomixer. בנוסף, ביסודיות מערבולת דגימות בכל 10 דקות כדי לקדם פירוק.
   4. ספין למטה דגימות עם ריצה קצרה של צנטריפוגה, להוסיף 350 µL של NaCl 5 מ' עם microliter פיפטה, מערבולת ביסודיות לדוגמאות כ 0.5 - 1 דקות צנטריפוגה למשך 40 דקות ב g x והוא מעסיק 16,200-5 מעלות צלזיוס
      הערה: אם קבוצות מרובות בשורה צריכים להיעשות, הגדרת טמפרטורה לצנטריפוגה צריך להיות מעט העלו (לא יותר גבוה מ- 10 ° C) כי מרחביות נוטה flocculate אם הטמפרטורה נמוכה מדי.
   5. שימוש microliter סיליקון להעביר כ 600 µL supernatant לתוך צינור 1.5 mL התגובה. להיזהר לא להסיר משהו בגדר.
   6. פלדת אל-חלד עצה חרוזים מתוך הצינורות התגובה לתוך מסננת תה פלדת אל-חלד, לנקות אותם עם מים זורמים, דגירה אותם בצלחת פטרי עם הפתרון טיהור עבור 10 דקות לשטוף ביסודיות הפתרון טיהור עם סטרילי מים ולאחסן חרוזים נקי אתנול (> 99%, כריזה כיתה) או יבש עד חוזר.
      הערה: ניקוי של חרוזים אינו צריך להיעשות בשלב זה ישירות, אך מעדיפה יכול להיעשות בכל פעם שיש זמן ההמתנה בשלבים הבאים-
   7. 600 להוסיף µL של קרח אלכוהול איזופרופיל (כיתה כריזה) תגובת שיקוע עם microliter פיפטה, להפוך בזהירות הצינור כמה פעמים. לאחסן דגימות בן לילה ב-20 מעלות צלזיוס
   8. לקחת דגימות מהמקפיא, centrifuge אותם עבור 20 דקות והוא מעסיק 16,200 × g, בטמפרטורת החדר. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע ויבש ברכבת התחתית היטב עם נייר טישו נטולת מוך. שימו לב כי אם טמפרטורת הסביבה גבוהה (יותר מ 25 ° C), צנטריפוגה ב 5 ° C כדי להימנע כדורי גולשות תוך השמטת את תגובת שיקוע.
   9. שטיפת גללים המכילה DNA עם 70% אתנול. כדי לבצע זאת, הוסף 200 µL קר כקרח אתנול (70%, כריזה כיתה) באמצעות פיפטה microliter צנטריפוגה דגימות 10 דקות ב 16,200 x g ו בטמפרטורת החדר (או 5 ° C, במידת הצורך). בזהירות למחוק את תגובת שיקוע ויבש ברכבת התחתית היטב עם נייר טישו נטולת מוך. שימוש פיפטה µL 10 להתאים ל- µL כ 8 כדי בקפידה פיפטה הנחה תגובת שיקוע הנותרים. ודא שלא להפריע בגדר.
   10. יבש בגדר במשך כ 5-20 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, או בטמפרטורת החדר הספסל עד כל האתנול הוא התאדה.
   11. צנפה התמוססות ב- 50-100 µL נטולת נוקלאז (אדים מחוטא, DEPC התייחסו) מים (ddH ₂ O), להמתין לפחות 1 h (אם כי ניתן להשיג תוצאות טובות יותר ללון ב 4 ° C).
   12. למדוד את כמות הדנ א הכלולות בכל מדגם עם ספקטרופוטומטרים מיקרו נפח, על פי היצרן ' s הוראות. לגרום לדילול לעבוד כל מדגם המכיל כ 2-10 ng DNA / µL. לשמור את הפתרון מניות במקפיא. לשמור את הפתרון עובד במקרר ולהבטיח הדגימה נוספת העיבוד נעשה זמן קצר.

2. ודא יעילות תפקודית של ה-DNA-תמציות לגילוי עוקבות של טרף בלע לאחרונה.

1. על מנת להבטיח הנוכחות ואת יעילות תפקודית של תבניות, לבחון כל תמצית ה-DNA (שלבים 1.1 כדי 1.3.11) באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר מתאים למקור המזון המתאימים (למשל, חסרי חוליות ^{16 , 26}) כי הם המיקוד של יחידת משנה גרעיני אותו בתור פריימר קבוצה ספציפית, המשמש לצורך זיהוי עוקבות של הטרף ^{25 , 27}. השלבים הבאים מתייחסים לשימוש של ערכות פריימר אוניברסלי NSF1419/20 ו- NSR1642/16 ¹⁶ ו LSU D1, D2 fw1 ו LSU D1, D2 rev2 או LSU D1, D2 rev4 ²⁶. כדי להוכיח כי התגובה PCR הייתה מוצלחת, כי אין חשש לזיהום התרחשה, להשתמש בקרה חיובית המכיל DNA זה היה כבר היה מוגבר בהצלחה ודגימת פקד אחד המכיל ddH ₂ O במקום DNA בתוך כל PCR לרוץ.
   1. להכין פריימר פתרונות עבודה מכילים של הריכוז הסופי 10 מיקרומטר של מאיץ, pipette את הכמות המתאימה של פריימר בהתאמה המניות פתרון ו- ddH ₂ O (בהתאם הריכוז של הפתרון מניות) לתוך mL 1.5 טריים תגובת הצינור באמצעות micropipettes.
   2. להוסיף תערובת זו תחל, deoxynucleotide מיקס (dNTPs), תגובת מאגר, Taq DNA פולימראז ו ddH צינור תגובה ₂ O mL 1.5 או 2.0 (תלוי במספר הדגימות להיות מעובד), ואז מערבולת. אמצעי אחסון נתונים היסטוריים עבור תערובת התגובה לתגובה PCR 10 µL מקבלים טבלה 1 (עבור פרטים של כימיקלים בשימוש, ראו טבלה של חומרים).
   פיפטות
   3. שימוש microliter להעביר כל µL 1 של ה-DNA לחלץ לתוך µL 9 של thתערובת התגובה השגרתית e בתוך צינור ה-PCR (או טוב של צלחת PCR). סגירת הצינור התגובה או הבארות התגובה של הצלחת (עם כובע פסים).
   4. לתכנת את thermocycler: הוא הפרוטוקול הסטנדרטי עבור ערכת פריימר ¹⁶ NSF1419/20 ו- NSR1642/16: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות (דנטורציה), ואחריו מחזורים של 94 ° C ל 30 s, 50 ° C (חישול טמפרטורה) ב-30 s, 72 ° C 90 s, ואת סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות. עבור ומהצמיגים LSU מגדיר ²⁶, השתמש בהבא: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואחריו 45 מחזורי 94 ° C עבור 20 s, 52.5 ° C עבור 20 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 90 s, ועם סיומת הסופי ב 72 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות
   5. המבחנות המקום או צלחות לתוך thermocycler, סגור את המכסה של הצנטרפוגה ולאחר הפעלת התוכנית בהתאמה.
   6. הכנת agarose 1.5% ג'ל באמצעות של בופר טריס הבסיס המכיל חומצה בורית, EDTA (מאגר TBE), agarose. עבור הכנת ג'ל agarose 1.5%, באמצעות מגש הליהוק ג'ל עם הממדים הכולל של 10 ס"מ × 7.5 ס"מ × 3 ס"מ, שוקלת agarose 0.45 g לתוך בקבוקון חרוט, השתמש צילינדר מדידה לאמוד 30 מ של x TBE 1 מאגר (89 מ מ טריס pH 7.6, חומצה בורית 89 מ מ ו- 2 מ מ EDTA, pH 8.0) וממלא הבקבוקון חרוט. מחממים את התערובת בעזרת מיקרוגל. להפסיק את המיקרוגל מתי יש בועות אוויר גדולים ו מערבולת בקפידה את הבקבוק עד הפתרון יש שלב אחד בלבד-
   7. להתקרר לפתרון כ 60 ° C, מערבולת את הבקבוק בתוך אמבט מים. במהירות שופכים את הפתרון לתוך מגש הליהוק ג'ל, להסיר בועות אוויר, והכנס מסרקים. המתן כ- 20 דקות עד ג'ל הוא התקשה.
   8. מילוי אלקטרופורזה יחידה עם 0.5 x TBE, הוסף ג'ל הליהוק מגש המכיל את הג'ל agarose. ודא החריצים ג'ל ללא בועות אוויר.
   9. ספין למטה המוצרים PCR באמצעות האפשרות ריצה קצרה של צנטריפוגה מיני (צלחת). להשתמש על פיפטה microliter כדי לערבב כל µL 3 של מוצר ה-PCR עם µL 1 של 6 x טוען צבען (40% סוכרוז ו- 0.25% bromophenol כחול) לטעון אותו לתוך החריצים ג'ל של הג'ל agarose. פיפטה 1.5 µL של סולם הדנ א bp 100 לתוך חריץ אחד בכל שורה עם פיפטה microliter כמו גודל סטנדרטי. להחליף את המכסה של היחידה אלקטרופורזה כראוי וחבר מוביל ספק כוח. להפעיל את הג'ל 100 V/cm מינימלית 35
   10. להכין אמבט מוכתמים, יוצקים 1,000 מ של 1 x TBE לתוך מרובע בצורת קופסת פלסטיק אטום לאור. להוסיף 50 µL של אתידיום ברומיד עם פיפטה microliter, סגור את המכסה של תיבת פלסטיק ולנער אותו כדי להבטיח חלוקה שוויונית של אתידיום ברומיד.
   11. להסיר את הג'ל מיחידת אלקטרופורזה ולמקם אותו לאמבטיה מכתימים כ 10 דקות. . ואז, בג'ל מהאמבטיה מוכתמים, להניחה על גבי מערכת תיעוד ג'ל, לדמיין. את זה לפי ספר ההוראות.
   12. לנתח דגימות היחידה שהראו תוצאות חיוביות (שברים בגודל הולם חזותית ב agarose ג'ל) מבחינת נוכחות, יעילות תפקודית של תבניות לגילוי עוקבות של טרף בלע לאחרונה.

< t d > 0.25 μl

ה-PCR-מיקס	הפתרון עובד ריכוז	מיקס 10 התגובה PCR µl	הריכוז הסופי ב- PCR
תחל FW	10 מיקרומטר	0.5 μl	0.5 מיקרומטר
RW תחל	10 מיקרומטר	0.5 & #956 ; l	0.5 מיקרומטר
התגובה מאגר (20 מ מ טריס-HCl, pH 8.55, 16 מ מ (NH4) 2SO4 וריכוזי 2 מ מ MgCl2 הסופי)	מיקרומטר 1	1 μl	1 מיקרומטר
dNTP	10 מ מ	0.25 mM
אנזימים	5 U	0.1 μl	0.05 U
ddH 2 0		6.65 μl
< לתזמורת כלי קשת ng > סה כ כמות תערובת התגובה		9 μl
דנ א		1 μl

טבלה 1: מפורט פרוטוקול עבור הכנת התערובת התגובה לתגובה PCR 10 µL-

3. לזהות טרף בלע לאחרונה/מזון פריטים עם פריימר המיועדות לקבוצות קובע באמצעות אלקטרופורזה בג'ל.

1. PCR לנהל באמצעות שהפתרון העבודה של ה-DNA תמציות (המוכנים לפי השלבים 1.1 כדי 1.3.11) ולהגדיר את ייחודיות לקבוצה פריימר (ללא תווית, קרי, ללא שינוי) המתאימות עבור הקבוצה טרף ממוקד כמו שמתואר צעדים 2.1.1 כדי 2.1.3 (וריאציות בתערובת תגובה עבור ערכת פריימר בהתאמה, ראה טבלה 2). להפעיל את ה-PCR באמצעות פרוטוקול סטנדרטי בהתחשב בשלב 2.1.4 (עבור חישול טמפרטורות עבור ערכת פריימר בהתאמה, ראה טבלה 2).
   1. השתמש בפקד אחד עם דנ א טהור מאחד השייכים אוכלוסיית היעד המתאים (בקרה חיובית) ושליטה שלילי אחד עם דנ א טהור מן המינים לצרכן ב- PCR כל לרוץ.
2. לבדוק את ההצלחה של התגובה PCR שימוש בג'ל agarose תיאר בשלבים 2.1.6 כדי 2.1.11. התגובה PCR היה מוצלח אם קטע באורך המתאים (ראה טבלה 2) גלוי עבור הפקד חיובי אך לא עבור הפקד שלילי. אם אחד או שני קריטריונים אלה לא התגשמו, חזור על ה-PCR-
3. שימוש agarose ג'ל אלקטרופורזה, כמתואר בצעדים 2.1.6 כדי 2.1.11, כדי לזהות הקבוצה טרף ממוקד היה כבר מעוכל על ידי דגימות ביתיים שונים שנבדקו (דרך לשפוט אם הרסיס של אורך המתאים הוא גלוי או לא). ודא לא לפספס שברים עם רזולוציה נמוכה חזותי.
4. מוצרי החנות PCR ב 4 ° C, אם עוד ניתוחים תהיה מוכנה בתוך ה 24 הבא, או ב-20 ° C, אם הבדיקות שיבוצעו מאוחר יותר.

4. לאחר מכן לקבוע נצרך הטרף נוסף במורד הזרם באמצעות ניתוח SSCP באמצעות ג'ל לזיהוי.

1. להתכונן אקרילאמיד 9% ג'ל אלקטרופורזה SSCP. להכין את הפתרונות עובדים בשכונה מעבדה.
   1. כדי להכין הפתרון עובד אקרילאמיד 200 מ ל, מילוי גליל מדידה עם 20 מיליליטר 10 x TBE (109 גרם של בסיס טריס, 55 גרם של חומצה בורית, 40 מ של 0.50 מ' EDTA, pH 8.0 מומס 1000 מ ל- ddH ₂ O) ועוד אחת עם 45 מ של 40% (29:1) שילוב אקרילאמיד. למזוג TBE, אקרילאמיד לערבב לתוך בקבוקון בוגר (בקבוק זכוכית בוגר עם סימן 200 מ ל, היא מתאימה גם כאן) ולהוסיף ddH ₂ O עד כדי לסמן 200 מ. . פתרון במקרר (4 ° C) עד הצורך. אל תשתמש הפתרון עובד מבוגר יותר שבוע אחד.
   2. שוקל 0.1 גר' קירור (APS; שימוש באיזון לפחות 0.01 גרם דיוק) לתוך 1 מ"ל סטריליות להמיס אותו על ידי הוספת ddH ₂ O עד טקס הסיום לסמן להכין פתרון מניות של APS 10%. להעביר aliquots (כ-350 µL) לתוך צינורות התגובה טריים.
      הערה: אחד aliquot נדרש עבור כל ג'ל לזיהוי. חנות aliqu הנותריםפאלו ורדה ב-20 ° C, רק להפשיר aliquots זמן קצר לפני הם נדרשים.
   3. להרכיב קלטת ג'ל בסכנה של שתי צלחות זכוכית, ריק אחד לוח הזכוכית מחורץ אחד (כל 20 ס"מ על 20 ס"מ), עם מפרידי (1.5 מ מ עבה) ביניהם מפעיל את הצדדים של הזכוכית. להשתמש בכל קיפול גב 3 קליפים (32 מ מ) בצד שמאלה וימינה להתקבע ג'ל קלטת ( איור 1).
   4. מיקס 5 גרם של agarose, 250 מ של מאגר x TBE 1 בבקבוקון חרוט להכין פתרון agarose 2% ג'ל. חום, לאחר מכן לקרר תערובת כפי שתואר בשלבים 2.1.6 ו 2.1.7. שופכים את הפתרון במהירות לתוך קופסת פלסטיק מרובע בצורת (21 ס"מ x 6.5 ס"מ x 5 ס מ), למקם את הקצה התחתון של קלטת ג'ל (שלב 4.1.3) הפתרון agarose. להתאים את הקליפים קיפול-בחזרה בסוף הקלטת ג'ל לגובה נמוך יותר כך הם יושבים על שפת בתיבת פלסטיק בצורת ריבוע ( איור 1). המתן כ- 20-30 דקות עד התקע agarose לחלוטין שנוקשה.
   5. מילוי של 100 מ ל מדידת גליל עם הפתרון עובד אקרילאמיד (שלב 4.1.1) עד הסימן 60 מ ל ויוצקים פתרון לתוך גביע. השתמש micropipette כדי להוסיף 300 µL של aliquot אחד של הפתרון מניות APS (שלב 4.1.2) וכדי להוסיף לאחר מכן 37.5 µL של tetramethylethylenediamine (TEMED). במהירות, שופכים את הפתרון בין צלחות זכוכית בקלטת ג'ל. לחלופין, להזריק את הפתרון בין צלחות זכוכית עם מזרק חד פעמיות 100 מ עם טיפ פיפטה 1,000 µL מותאם לראש הזרקה במזרק.
   6. להוסיף בזהירות מסרק סטנדרטיים בעובי 1.5 מ מ בקצה העליון בין הזכוכיות. המסרק חייב להיות מוקף הפתרון לזיהוי. המתן כ 1 h עד לזיהוי הג'ל הוא polymerized. להימנע אוורור בזמן הפילמור ככל האפשר כי זה מגדיל את הזמן הדרוש עבור הג'ל פולימריזציה.
      הערה: זה אפשרי לאחסן ג'לים casted בתוך שקיות אטומות עם ממחטה רטובה במקרר עד 3 ימים.

איור 1: התמונות המדגימה בנייה לשפוך ג'ל לזיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. מקום בקלטת ג'ל, המכיל את הג'ל לזיהוי מוכן, לתוך יחידה אנכית אלקטרופורזה. מילוי יחידת אלקטרופורזה עם הסכום המתאים (בהתאם לסוג יחידת אלקטרופורזה) של 0.5 x TBE וקריר יחידת ל 10 ° C באמצעות סירקולטור בקירור של.
3. עבור ה-DNA דנטורציה, מחממים תרמי-לחסום /-הצנטרפוגה ל 96 ° C. הכן מאגר דנטורציה עם 95% formamide (99.5% כריזה כיתה), 5% תמיסה מימית המכילה bromophenol 0.25% כחול וסוכרוז 40% (w/v).
4. לקחת את המוצרים PCR על המקרר או המקפיא, להפשיר אותם. ספין למטה המוצרים PCR באמצעות האפשרות ריצה קצרה של צנטריפוגה מיני (צלחת). לאחר מכן, מערבבים כל µL 4 של מוצר ה-PCR עם 4 µL מאגר דנטורציה. מחממים תערובות 5 דקות ב 96 ° C ומיד אחריו צעד קירור במים קר למשך 10 דקות
   הערה: דוגמאות צריך לטעון את הג'ל לזיהוי (שלב 4.5) מיד אחרי זה.
5. המסרק להסיר הג'ל לזיהוי (שלב 4.1.6) ולהשתמש micropipette עם לגמרי לטעון כל מדגם לתוך חריץ ג'ל. הפעל אלקטרופורזה בשמונה W לכל ג'ל בזמן קירור ללא הרף את יחידת אלקטרופורזה 10 ° C. פועל הזמן הנדרש תלוי בגודל של קטע להפרידם. עבור קטע בגדלים כ 210 bp, זמן ריצה של-3.5 שעות נחשבת המתאים.
6. להכין אמבט מוכתמים, יוצקים 1,000 מ ל 1 x TBE לתוך פלסטיק מרובע בצורת תיבת אטום לאור, להוסיף 30 µL של צביעת צבע (מתאים כתם DNA נטושים יחיד) עם פיפטה microliter. סגור את המכסה של תיבת פלסטיק ומנערת כדי להבטיח חלוקה שוויונית של לצבוע מכתימים.
7. להסיר את הקלטת ג'ל מן החדר אלקטרופורזה, הפרד בזהירות את לוח הזכוכית מחורץ של הג'ל. החלק את הג'ל לזיהוי של לוח הזכוכית ריק לאמבטיה מוכתמים. במקום האמבטיה מכתימים על גבי ג'ל פלטפורמת ואת כתם חזק למשך 20-30 דקות עם טלטול מתמיד.
8. בג'ל בקפידה מהאמבטיה מכתימים ומניחים אותו על השולחן UV של מערכת תיעוד.
   הערה: עקב חוסר היציבות של הג'ל מומלץ להתמודד את צעד קודם עם שני אנשים. אדם אחד צריך להחזיק את האמבטיה מכתימים ליד השולחן UV, עוד אחד צריך להושיט יד אל מתחת הג'ל עם שתי הידיים, תוציא את זה, והחלק אותו על השולחן UV.
9. לסגור את המכסה או את הדלת של מערכת תיעוד ואני רוצה לצלם כמה תמונות על פי היצרן ' ההדרכה s.

5. לזהות מרובות בלע לאחרונה טרף קבוצות במקביל באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס.

1. ניתוח תוכן הבטן DNA תמציות באמצעות ומהצמיגים המיועדות לקבוצות 16 מגדיר נתון בטבלה מס ' 2, עם פריימר אחד של ערכת מתויג עקב שינוי עם צבע מכתימים (ראה עמודה בטבלה 2 שכותרתה השינוי), ולהשתמש בשיטות זיהוי מקבילי של הרצפים (sequencer) האוטומטי.
   1. שימוש הפתרון עובד של תמציות דנ א (המוכנים לפי השלבים 1.1 כדי 1.3.11) והתנהגות להפריד מותני עבור כל פריימר כמו שמתואר צעדים 2.1.1 כדי 2.1.5 (וריאציות של התערובת מקבלים טבלה 2). השתמש בפקד אחד לפחות עם דנ א טהור מאחד השייכים אוכלוסיית היעד המתאים (בקרה חיובית) ושליטה שלילי אחד עם דנ א טהור מן המינים לצרכן ב- PCR כל לרוץ.
   2. מותני לרוץ ב thermocycler באמצעות פרוטוקול ה-PCR סטנדרטי בהתחשב בשלב 2.1.4, התרגלו טמפרטורה מחזק בהתאמה (, מספר מחזורי) עבור כל פריימר להגדיר נתון בטבלה מס ' 2-
      הערה: השתמש בהקצאת דנ א באותה התגובה בארות PCR עם כל אחד 16 ערכות פריימר שונים כדי לפשט באגירת עוקבות של PCR מוצרים עבור לקישוט אוטומטיות רסיס ניתוחים.
   3. PCR חנות מוצרים ב-20 ° C עד מותני כל השייכים אצווה אחת עבור הניתוחים אוטומטיות רסיס (ראה טבלה 2) סיים. לשמור על מוצרי ה-PCR בחושך, אין לאחסן אותם יותר מ 1 שבוע לפני ניתוח שבר.

בטבלה 2: פרטים של 2 אצוות של 15 זוגות קבוצה ספציפית פריימר שנקבעו על-ידי. Koester et al. (2013), הזוג החדש תוכנן של פריימר Jae28S הגברה מחוזות rDNA 18S או 28S מקבוצות היעד 16 של macroinvertebrates הימית. f, תחל קדימה; r, תחל הפוכה; 18S, פריימר מטרות 18S rDNA יחידה משנית; 28S, פריימר מטרות 28S rDNA יחידה משנית. " Hydrobiologia, הוא Dikerogammarus villosus (צוות, Gammaridae) ' שרימפסים ' במערכת נהר הריין?, 768, 2016, טבלה S1, חומר משלים page 2, Koester Meike, בסטיאן באייר, רנה Gergs, (© ספרינגר הבינלאומי פרסום שוויץ 2015) " עם אישור של שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.

2. כדי לזהות הרסיסים מוגבר של כל ערכות פריימר 16 לערוך ניתוח אוטומטיות רסיס 2 אצוות נתון בטבלה מס ' 2. השתמש תקן גודל פנימי (דנ א גודל ערכה - 400 [אצווה B] ו- 600 [אצווה A], בהתאמה) כדי לקבוע את אורך קטע. להכין את צלחת רצף הרצפים (sequencer) אוטומטית כפי שתואר בשלבים הבאים. הערה הליך זה יתכן יותאם אם באמצעות פלטפורמה עוד יותר בהתחשב בטבלת חומרים.
   1. כדי להפעיל כל אצווה-דגימה, להכין תערובת המכילה פתרון טעינה הדגימה (SLS) ואת גודל בהתאמה סטנדרטי. פיפטה 21.6 µL של SLS ו- 0.4 µL של ה-DNA בגודל סטנדרטי ערכת - 600 לכל דגימה של אצווה A, בהתאמה, µL 21.7 של SLS ו- 0.3 µL של ה-DNA בגודל סטנדרטי ערכת- 400 לדגימה של אצווה בי
   2. לקחת את המוצרים ה-PCR של מותני 8 השייכים אצווה המתאימים מהמקפיא, להפשיר אותם. להבטיח כי הם נשמרים עדיין בחושך.
   3. השתמש על פיפטה microliter כדי לטעון את מספר בארות של צלחת רצף הצורך (מספר דוגמאות כדי להיות מנותח) עם כל µL 22 של תערובת בהתאמה שמתואר בשלב 5.2.1. ספין למטה המוצרים ה-PCR של כל אחד מותני 8 באמצעות האפשרות ריצה קצרה של צנטריפוגה מיני (צלחת). להעביר את כל µL 1 לכל מוצר ה-PCR של כל אחד מותני 8 לתוך הבארות בהתאמה של רצף לצלחת עם פיפטה microliter.
   4. בקפידה ספין למטה תערובת זו בתוך רצף לצלחת עם ריצה קצרה של צנטריפוגה צלחת מיני, כיסוי כל הבארות המשמשות עם טיפה אחת של שמן מינרלי. למלא את התגובה המתאימים בארות של צלחת מאגר 250-300 µL מאגר ההפרדה דנ א.
   5. להשתמש בתוכנה על נימי ברצף כדי ליצור מלכודת דגימה לפי היצרן ' s הוראות. הקצה את שיטות כדי לשלוט מדגם ערכות לקבוע את הרצף של שיטות כדי לשמש כדי לעבד נתונים (ראו טבלה 3 להפעלת תנאים נאותים לשימוש עם תקן גודל נתון בטבלה חומרים). שימו לב: חשוב כי ההקצאה של דגימות בתוך הגדרת מדגם תואם את הקצאת מדגם בצלחת רצף (כולל פקדים חיוביים ושליליים, ראה שלב 5.1.1) וניתוחים כי השיטה נאותה שבר עם בהתאמה גודל סטנדרטי נבחר.
   6. למלא מגש הרטבה במים יונים והכנס את רצף צלחת, צלחת מאגר ומגש הרטבה לתוך נימי ברצף. הכנס מחסנית ג'ל המכיל כמות מספקת של טרי ג'ל ההפרדה דנ א הנדרש עבור הדגימה להפעיל. הפעל את הצלחת רצף באמצעות הגדרת מדגם מוכן.

	denature		נפרד		צינור קפילר	מזריקים
	טמפרטורה	בזמן	מתח	זמן		מתח	זמן
בגודל 600 רגיל	90 ° C	120 s	4.8 kV	60 דקות	50 מעלות ולחכות Temp: כן	2.0 kV	30 s
בגודל 400 רגיל	90 ° C	120 s	6 kV	45 min	50 מעלות ולחכות Temp: כן	2.0 kV	30 s

טבלה 3: תנאים מסוימים עבור ניתוח שבר על הרצפים (sequencer) אוטומטית באמצעות הסטנדרטים גודל נתון בטבלה חומרים.

3. לנתח את התוצאות לייצא נתונים גולמיים ולהעלות אותם נתונים לתוכנית ניתוח שבר. לבחור צבע רגיל במצוות צבע ליצרן המתאימים כדי להגדיר ערוצי צבע לצבוע.
   1. צור לוח חלוקה לרמות לטווח הצפוי של אורך קטע מוגבר על ידי ומהצמיגים ייחודיות לקבוצה אחת מגדיר בתוך אצווה על פי המדריך למשתמש של התוכנית.
   2. לעיבוד הנתונים, בחר את לוח בהתאמה, תקן בגודל המתאים, הצבע הרגיל ואת סוג של ניתוח, להפעיל שגרת. בחר באפשרות electropherogram להצגת אותות פלואורסצנט עוצמות של מכשירי אלקטרופורזה נימי עקבות שורה אחת עבור כל צבע לצבוע. סמני/פריימר ערכות יוצג המציין את הטווח פרגמנט בהתאמה, האורך המדויק של השבר זוהה המזוהים עם המרכז של כל שיא הנקרא יודגשו (רוב התוכניות על ידי צבע או פיזור ובועות) באופן אוטומטי.
   3. עבור כל דגימה, לחשב כמה קרוב הדגימה ' s פנימי בגודל סטנדרטי תואם התקן בגודל שנבחר כדי להרגיע את ההצלחה של דה קולינג גודל. רוב התוכניות ניתוחי שבר יש אפשרות לחשב והמחש במשחק הזה באופן אוטומטי. אם דה קולינג גודל נכשלה, חזור על מקטע ניתוח עבור הדגימות.
   4. חזותי לבדוק שוב את electropherogram של כל דגימה, לאשר/unconfirm כל שיא קרא כל סמן/פריימר להגדיר בנפרד. פסגות לא במקום להתאים את הקריטריונים של ערכת סמן/פריימר או למחוק הלא נכונות על פי המדריך למשתמש של התוכנה ששימשה הוספה ידנית. להחיל על זוג בסיסים גודל או סל השם ' אלל התווית '. לחישוב והצגה שיא במפרט ' שיא שולחן '.

תוצאות

השתמשנו בהצלחה את השלבים המתוארים בפרק זה פרוטוקול דיאטה ניתוחים במסגרת מחקרים שונים. בחלק זה, אנו מציגים דוגמאות המתארות את הישימות של הסעיפים השונים של הפרוטוקול.

לדוגמה, כדי להדגים את היעילות של קבוצות ייחודיות לקבוצה פריימר נוסדה על ידי מחברים²⁸ , הפוטנציאל של נוסף במורד הזרם ניתוחים של מוצרי ה-PCR על ידי ניתוחים SSCP, ניסוי האכלה נערך. יחידים של Dikerogammarus villosus כמו טורפים וזחלים spp....

דיון

כאן, אנו מציגים שיטה קלה וחסכונית עבור נחישות מבוססי ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות מדגימות שדה באמצעות תחל קבוצה ספציפית עבור אזורים rDNA, אשר יכול להיות משולב עם אחרים ניתוחים שאינם-מולקולרית של דגימות באותו. עם זאת, ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, שמבטיח יחודיות של תחל שימוש חיוני. שנית, זה הכרחי למנוע זיהום ואובדן של חומר תוכן הבטן במהלך ההכנה של דרכי העיכול, את מיצוי הבאים של ה-DNA. בזמן זיהום קרוס-sample יכול להוביל זיהוי חיובי כוזב של הטרף DNA, אובדן של הבטן תוכן החומר עלול להוביל חסר לעתים נדירות צר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חנקן נוזלי	כל	NA	להובלת דגימות שדה של חסרי חוליות למעבדה.
צינורות תגובה של 1.5 מ"ל - Safelock	כל	NA	לאיסוף דגימות צרכנים בשטח ושימור לאחר מכן בצינורות תגובת חנקן נוזלי לא בהכרח צריך להיות נקי PCR. כדי למנוע פיצוץ של הצינורות, יש לנקב את מכסה הצינורות בעזרת מחט.
סטריאומיקרוסקופ	כל	NA	ודא שההגדלה מתאימה להכנת מערכת העיכול בגודל הצרכן המעניין.
מנות פטרי	כל	NA	לנתח את מערכת העיכול של דגימות צרכנים תחת הסטריאומיקרוסקופ.
מלקחיים מנירוסטה: מלקחיים של דומונט מס' 7	Bioform	B40d	מלקחיים מעוקלים מנירוסטה יכולים לפעמים להיות מאוד חזקים להחזיק דגימה קבועה בין החלק המעוקל מבלי לנקב את מערכת העיכול.
מלקחיים מנירוסטה: מלקחיים אלקטרוניים של Dumont מס' 5	Bioform	B40b	מלקחיים נירוסטה עדינים אלה מתאימים באופן אידיאלי להכנת מערכת העיכול של דגימות צרכנים.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	פתרון טיהור להסרת זיהומי DNA ו-RNA
מגבת נייר נטולת ערפול	כל
Lab	כל		NA Precision צריך להיות לפחות 0.01 גרם.
פיפטות מיקרוליטר (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	כל	צינורות נעילה בטוחה של NA
2.0 מ"ל	VWR	211-2165	זה חיוני שצינורות הנעילה הללו יהיו נקיים ממעכבי DNA, DNase, RNase ו-PCR (PCR נקי)!
צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"ל	VWR	211-2164	זה חיוני שצינורות הפעולה הללו יהיו נקיים ממעכבי DNA, DNase, RNase ו-PCR (PCR clean)!
נתרן כלורי ≥ 99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	עבור מאגר מיצוי מלח (SEB) ותמיסת NaCl 5M הנדרשת למיצוי DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	עבור מאגר מיצוי מלח (SEB) ומאגר TBE
פיפטות מיקרוליטר (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	קרלרוט	8043.1	עבור מאגר מיצוי מלח (SEB) ומאגר TBE
חומצה בורית ≥ 99.8%, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	עבור מאגר TBE. אין צורך אם מתקבל מאגר TBE זמין מסחרי
נתרן דודציל סולפט (SDS)	קרלרוט	4360.1	למיצוי DNA
פרוטאינאז K ליופיל.	carlroth	7528.1	הכן תמיסת עבודה המכילה 10 מ"ג/מ"ל.
TissueLyser II	Quiagen	85300	טחנת חרוזים להומוגניזציה של הדגימות.
חרוזי נירוסטה, 5 מ"מ	Quiagen	69989	להומוגניזציה של דגימות.
חימום תרמושייקר	כל	מערבולת NA
	כל
HIMAC CT 15 RE	Hitachi	NA	המשמשת לצנטריפוגה במהלך מיצוי DNA (פרוטוקול 1).
איזופרופנול	קרלרוט	6752.5
אתנול 99.8%, p.a.	כל	של מים NA
(ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	מים נטולי נוקלאז (מעוקרים בזרם ומטופלים ב-DEPC) המשמשים להשעיה מחדש של ה-DNA ובכל פעם שהם מתייחסים ל-ddH2O בכתב היד
אולגונוקלאוטידים לא מותאמים	Eurofins MWG Operon	NA	פריימרים ללא תווית
אולגונוקלאוטידים מותאמים	Metabion International AG	NA	פריימרים עם תווית
peqGOLD Taq הכל כלול	VWR Peqlab	01-1000	Taq הכל כלול עבור תערובות תגובה PCR (מאגר תגובה Y ו-S, dNTPs ו-MgCl2)
פרימוס 96 תרמו-ציקלר שיפוע מתקדם או peqStar96x שיפוע אוניברסלי	Peqlab	NA	ערכות פריימר הוקמו במקור על תרמו-סייקלר שיפוע מתקדם של פרימוס 96. מכיוון שהמחזור הזה היה די ישן, בדקנו אם ערכות הפריימר שלנו יעילות וספציפיות באותם תנאים באמצעות peqSta96x (שגם יכול לדמות את הדגם הישן). עם זאת, בדיקות הראו שהפריימרים שלנו עובדים היטב ועדיין ספציפיים (ראו Koester et al. 2013) ללא שימוש בסימולציה של המכונה הישנה.
צלחות PCR סטנדרטיות 96 באר	VWR Peqlab	732-2879	משמשות לתגובות PCR.
פסי צינור בפרופיל נמוך 0.15 מ"ל עם פסי כובע שטוחים	VWR Peqlab	732-3223	המשמשים לסגירת לוחות ה-PCR.
אגרוז	פקלאב	35-1020	משמש לאלקטרופורזה של ג'ל.
מיקרוגל	כל	חרוטי NA
	כל
	כל	יחידת
ומסרקים בהתאמה עם שיניים	כל	NA	לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
ספק כוח אלקטרופורזה PS3002	Life Technologies	NA
תמיסת אתידיום ברומיד 1	carlroth	2218.1	משמש להכנת אמבט מכתים לג'ל אגרוז.
פורממיד	קרלרוט	6749.1	דרוש למאגר דנטורציה לניתוחי SSCP.
ברומפנול כחול	AppliChem	A3640.0010	נחוץ לצבע הטעינה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
סוכרוז	קרלרוט	4621.1	נחוץ לצבע הטעינה לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
100 bp-DNA-סולם מורחב	קרלרוט	T835.1	כתקן גודל לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
מערכת תיעוד UV	כל	NA	כדי לדמיין תוצאות אלקטרופורזה בג'ל.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40% (29:1)	carlroth	A121.1	להכנת ג'ל פוליאקרילמיד.
אמוניום פרוקסידיסולפט	קרלרוט	9592.2	להכנת ג'לים פוליאקרילמיד.
קליפסים מתקפלים (32 מ"מ)	כל	NA	להכנת ג'ל פוליאקרילמיד.
קופסת פלסטיק בצורת ריבוע (21 ופעמים; 6.5 ופעמים; 5 ס"מ)	כל	NA	להכנת ג'ל פוליאקרילמיד.
טטרמתילאתילנדיאמין (TEMED)	קרלרוט	23.67.1	להכנת ג'לים פוליאקרילמיד.
	כל	NA
RC 10 צ'ילר דיגיטלי	VWR	462-0138	לניתוחי SSCP באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
יחידת אלקטרופורזה אנכית P10DS (מערכות הפרדת ינשוף)	VWR	700-2361	לניתוחי SSCP באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
לוחית זכוכית מחורצת	VWR	730-0261	לניתוחי SSCP באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
לוחית זכוכית ריקה	VWR	730-0260	לניתוחי SSCP באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
מרווחים	VWR	730-0262	לניתוחי SSCP באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
מסרק עם 25 שיניים	VWR	730-0294	לניתוחי SSCP באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
פלטפורמת טלטול	כל	NA	לטלטול מתמיד של אמבט הצביעה.
כתם חומצת גרעין של GelStar (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	לצביעה של ג'לים פוליאקרילאמיד.
ערכת גודל DNA של GenomeLab 400bp	AB Sciex	608098	לניתוחי שברים אוטומטיים. גודל סטנרד עבור אצווה B.
ערכת גודל DNA של GenomeLab 600bp	AB Sciex	608095	לניתוחי שברים אוטומטיים. גודל סטנרד עבור אצווה A.
פתרון טעינת דוגמאות (SLS)	AB Sciex	608082	לניתוחי שברים אוטומטיים.
צלחת המשך - 96 באר פוליפרופילן PCR Microplate	Costar	6551	לניתוחי שברים אוטומטיים.
צנטריפוגת צלחות, צנטריפוגת צלחת מיני PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	המשמשת לסיבוב מוצרי PCR.
לוחית חיץ - 96 באר EIA/RIA פוליסטירן תחתון שטוח שקוף לא מטופל מיקרופלייט	קורנינג	9017	לניתוחי שברים אוטומטיים.
מאגר הפרדה של GenomeLab	AB Sciex	608012	לניתוחי שברים אוטומטיים.
ג'ל הפרדה - LPAI	AB Sciex	608010	לניתוחי שברים אוטומטיים.
Sequenzer - מערכת ניתוח גנטי CEQ8000	בקמן קולטר	NA	לניתוחי שברים אוטומטיים.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	לנתח תוצאות של ניתוחי שברים אוטומטיים.