הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56169

⸱

9 באפריל 2018

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מפורט של דגם העכבר עבור enterohemorrhagic e. coli (EHEC) מושבת באמצעות חיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה מוצג. זיהוי חיידקים זוהרים אלו באמצעות פולשני ויוו מערכת בבעלי חיים הדמיה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של EHEC קולוניזציה.

תקציר

Enterohemorrhagic e. coli (EHEC) O157:H7, אשר הוא. חיידק והקאה causesdiarrhea הזה, מדמם קוליטיס (HS), ו תסמונת אורמיה hemolytic (HUS), ליישב את העיכול של בני אדם. ללמוד מנגנון מפורט של EHEC קולוניזציה ויוו, זה חיוני כדי להיות מודלים בעלי חיים כדי לפקח ולכמת EHEC קולוניזציה. נדגים כאן מודל קולוניזציה העכבר-EHEC בהפיכת את פלסמיד לביטוי זוהרים כדי EHEC כדי לפקח ולכמת כיבוש EHEC חי המארחים. בעלי חיים מחוסן עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC להציג אותות ביולומנאסן אינטנסיבי בעכברים על-ידי זיהוי עם יישום לא פולשנית ויוו מערכת הדמיה. לאחר ימים 1 ו-2 פוסט זיהום, אותות ביולומנאסן יכול עדיין ניתן לאתר חיות נגועות, מה שמרמז כי EHEC לישוב ב hosts לפחות 2 ימים. אנחנו גם להוכיח כי אלה EHEC ביולומנאסן לאתר כדי העכבר המעי, בפרט המעי האטום ואת המעי הגס, מתמונות vivo לשעבר . מודל מושבת זה עכבר-EHEC עשוי לשמש כלי לקידום הידע הנוכחי של מנגנון קולוניזציה EHEC.

מבוא

EHEC O157:H7 הוא. חיידק הגורם לשלשול1, HS2, הוס3ואי ספיקת כליות חריפה אפילו4 דרך מזון או מים מזוהמים. EHEC enterobacterium פתוגניים, והצנרות מערכת העיכול של בני אדם1. כאשר EHEC לדבוק קודם אפיתל המעי המארח, הם מזריקים את הגורמים קולוניזציה לתוך התאים המארחים דרך סוג III הפרשת מערכת (T3SS) כי פונקציות כמו מזרק מולקולרית בתדר של הצמדת ו effacing (A/E) הנגע לאחר מכן כדי לאכוף אדהזיה (מושבת)5. אלה גנים המעורבים במערך A/E הנגע מקודדים על ידי מיקומה של האי פתוגניות הצטנעות (לי) enterocyte5.

הארה ביולוגית היא לייצר אור תגובה כימית, ב לוציפראז אשר מזרז luciferin המצע שלה כדי ליצור אור גלוי6. תהליך אנזימטי זה לעיתים קרובות דורשת הנוכחות של חמצן או אדנוזין טריפוספט (ATP)6. ביולומינסנציה הדמיה (בלי) מאפשר חוקרים את הפריט החזותי ו קוונטיזציה של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות ב בעלי חיים7. מתה על ניתן לאפיין את מחזור זיהום חיידקי בבעלי חיים על ידי ביצוע חיידקים זוהרים כמו שהם להגר לפלוש לרקמות שונות7; זה מגלה שינוי דינמי של זיהום. יתר על כן, העומס חיידקי בבעלי חיים קשורה האות ביולומנאסן8; לכן, יש חיווי נוח כדי להעריך את התנאים פתולוגי של חיות ניסוי באופן פשוט וישיר.

פלסמיד המשמש כאן הכיל את אופרון לוציפראז, luxCDABE, שבו הוא מן החיידק Photorhabdus luminescens מקודד משלו לוציפראז המצע7,9. על-ידי שינוי צורה זו פלסמיד לבטא לוציפראז לתוך חיידקים, ניתן לנטר את התהליכים קולוניזציה ולדלקת על ידי התבוננות חיידקים זוהרים אלו בבעלי חיים. בסך הכל, בלי וחיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה לאפשר לחוקרים לעקוב אחר המספרים חיידקי, למיקום, הכדאיות חיידקי עם אנטיביוטיקה/טיפול, ביטוי גנים חיידקיים זיהום/מושבת6, 7. חיידקים פתוגניים רבים דווחו כי לבטא את אופרון luxCDABE לבחון זיהום מחזור ו/או גנים ביטוי במעשים זיהום. חיידקים אלה, כולל e. coliuropathogenic10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic e. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, סלמונלה typhimurium16, ליסטריה17,18, Yersinia enterocolitica19, , ויבריו cholerae20, תועדו.

מספר גרסאות ניסיוניות פותחו כדי להקל על המחקר של EHEC קולוניזציה במבחנה , ויוו21,22,23. עם זאת, יש חוסר מודלים מתאימים ללמוד את EHEC קולוניזציה ויוו, ובכך וכתוצאה מכך במחסור של פרטים. כדי להקל על המחקר של ה EHEC קולוניזציה מנגנון ויוו, זה חשוב כדי לבנות מודלים בעלי חיים כדי להתבונן ולכמת EHEC קולוניזציה בבעלי חיים בשיטה לא פולשנית.

כתב יד זה מתאר מודל קולוניזציה העכבר-EHEC משתמש במערכת לביטוי זוהרים כדי לפקח EHEC קולוניזציה לאורך זמן ב חי המארחים. עכברים intragastrically מחוסנים עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC ומתגלה האות ביולומנאסן בעכברים עם יישום לא פולשנית ויוו הדמיה מערכת13. עכברים נגועים עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC הראה אותות ביולומנאסן משמעותי במעי שלהם לאחר יומיים לפרסם זיהום, אשר הציע כי חיידקים אלה התנחלו במעי המארח לאחר יומיים לפרסם זיהום. Ex-vivo נתוני התמונה הראה כי קולוניזציה הזה הוא במיוחד ב המעי האטום ואת המעי הגס של עכברים. באמצעות מודל זה עכבר-EHEC, הקולוניזציה EHEC ביולומנאסן ניתן להבחין במארח החיים של ויוו מערכת, כדי לחקור את המנגנונים מפורט מושבת בה חיידק, אשר עשוי לקדם הבנה נוספת בהדמיה EHEC-induced פיזיולוגיים ופתולוגיים שינויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

זהירות: EHEC O157:H7 היא רמת אבטחה 2 (BSL-2) פתוגן לפי המרכז לבקרת הוראה אבטחה ובקרה מחלות ומניעתן (CDC) (https://www.cdc.gov/). לכן, יש לבצע בכל ההליכים ניסיוני מעורבים EHEC במתקן BSL-2. ללבוש חלוקי מעבדה וכפפות בעת ביצוע הניסוי. עובד מוסמך אבטחה cabinet (BSC). לחטא את הספסל ניסיוני לפני ואחרי ההליך ניסיוני עם 70% אתנול. כל מכשירים או ציוד EHEC קשר (או קשר פוטנציאלי) צריכים להיות נקיים עם 70% אתנול או אקונומיקה. פסולת מזוהמים (או שעשויות להיות מזוהמים) צריך להיות אטום בלוק בקפידה. ללבוש מסיכה, הגנה העין, כפפות כפול או סרבל, במידת הצורך. העכברים נקבה בת שבוע 6-C57BL/6 היו נרכש ומתוחזק באוניברסיטה מעבדה חיה מרכז של הלאומית צ'נג קונג (NCKU). הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של NCKU (אישור מס ' 104-039).

1. Bioluciferase-מתויג EHEC חיידקים דור

  1. חומצה deoxyribonucleic ng לערבב 50 (DNA), 1 μL כל של 10 μM קדימה ולהפוך תחל μL 2 2.5 מ מ deoxynucleotides (dNTPs), 2 μL 10 x מאגר, 0.2 μL DNA פולימראז ומים סטרילי מזוקק פעמיים (ddH2O) באמצעי אחסון הסופי של μL 20 כדי להגביר אנטי-kanamycin קלטת, ג'ין nptII 24. תבנית ה-DNA נמצא pBSL18024, אשר נרכש מן הפרויקט הלאומי BioResource (NBRP). PCR התנאים המפורטים בטבלה 1, הרצף פריימר זמין בטבלה מס ' 2.
  2. מאתרים ומפסיקים את המוצרים PCR וקטור שיבוט מסחרי בעקבות הערכה פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).
  3. בלו השבר ג'ין nptII מן הווקטור שיבוט NsiI , מרק פורטנוי ותשכפלי לתוך pBBR1MCS4, אשר הוא מתעכל על ידי NsiI ואת ScaI pAKlux29 כדי ליצור את פלסמיד kanamycin עמידים, pWF27813.
  4. לסלק את אופרון luxCDABE , מן לוציפראז לבטא פלסמיד9, pAKlux2, על-ידי SpeI-HF ו ScaI ו שיבוט SpeI-HF , מרק פורטנוי מתעכל pWF278 כדי להפיק kanamycin עמיד ו לוציפראז לבטא פלסמיד, pWF27913.
    הערה: את הקוד שיחולץ פלסמיד, את purifications פרגמנט נכרת, להשתמש החילוץ פלסמיד מסחרי ערכת חילוץ ג'ל, בהתאמה. עבור אנזים עיכול, לערבב 100 נג ה-DNA, מאגר 1 של 10 x μL, μL 1 של כל אנזים הגבלה שנבחר, ו- ddH סטרילי2O את הנפח הכולל של 10 μL, דגירה ב 37 ° C עבור 2.5-3 h.
  5. להפוך את פלסמיד pWF279 e. coli O157:H7 EDL933 תאים המוסמכת על ידי אלקטרופורציה עם 2,500 V עבור 4 ms.
  6. דגירה תאי חיידקים טרנספורמציה במדיום לוריא-Bertani (LB) 1 מ"ל ב 37 ° C עבור 1 h.
  7. צלחת את החיידקים על צלחת אגר LB בתוספת 50 µg/mL של kanamycin ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.
  8. בדוק את האות ביולומנאסן של הצלחת על ידי של ויוו הדמיה מכונת למחרת. לבחור מושבה בודדת מהצלחת, תרבות זה ב 3 מ ל LB בתוספת 50 µg/mL kanamycin ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.
  9. הכן חיידקי בינוני מניות על ידי דילול גליצרול 100% ב- ddH סטרילי2O כדי להפוך את הפתרון גליצרול 30%.
  10. הקפאת kanamycin עמיד חיידקים O157:H7 EDL933 e. coli מסתירים את פלסמיד לוציפראז כמו מניה חיידקי ב cryovial קאפ בורג כמו יחס 1:1 של חיידקים תרבות, 30% גליצרול פתרון ב- 80 ° C הריכוז הסופי של גליצרול הוא 15%.

2. ביולומנאסן EHEC חיידקים לקראת חיסון אוראלי

הערה: ציר תרשים הזרימה של ההליכים ניסיוני עבור העכבר gavage אוראלי והכנה EHEC מוצג באיור 1 כדי לסייע בהכנה ניסיוני.

  1. רצף של e. coli O157:H7 EDL933 החיידקים מחסה לוציפראז פלסמיד על גבי צלחת אגר ליברות עם 50 kanamycin µg/mL במלאי-80 ° C. לגדל את החיידקים במשך 16-18 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. לבחור מושבה בודדת מ צלחת לילה והתרבות 3 מ ל LB בינוני עם 50 kanamycin µg/mL עבור 16-18 h בחממה 37 ° C-220 סל"ד.
  3. תת-תרבות החיידקים (דילול מטריים) לתוך kanamycin (50 µg/mL) המכיל ציר ליברות עבור 2.5-3 ש ח בחודש חממה 37 ° C-200 סל ד. (למשל, להוסיף 2 מ"ל תרבותי בין לילה לחיידקים בינוני 200 מ ל LB עם kanamycin (50 µg/mL) בתוספת).
  4. דגירה החיידק עבור 2.5-3 h ולמדוד את הערך צפיפות אופטית 600 nm (OD600) עד שהערך הוא בין 0.9 ל- 1. המספר תא החיידק הוא על צפיפות של-108 המושבה ויוצרים יחידות (CFU) / mL.
  5. Centrifuge חיידקים בתרבית מחדש ב g 8,000 x למשך 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס.
  6. למחוק את תגובת שיקוע מבלי לזעזע את צניפה של חיידקים ולשטוף את גלולה עם 100 מ ל 0.9% תמיסת סטרילית על ידי עצבנות עדין.
  7. חזור על שלבים 2.5 ו- 2.6 פעם אחת.
  8. לאחר כביסה, centrifuge התרבות חיידקי ב 8000 g x במשך 30 דקות, 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בעדינות.
  9. מעובה בגדר ב 100-fold עם תמיסת מלח סטרילית 0.9%. למשל, אם 200 מ ל חיידקים הם centrifuged, להוסיף 2 מ ל תמיסת להשעות את גלולה.
  10. לאשר את החיידקים CFU (זה צריך להיות בערך μL CFU/1009 10 לאחר עיבוי בתוך תמיסת מלח רגיל) על ידי ציפוי חיידקים מרוכזת באמצעות דילול טורי 10-fold25.

3. העכבר Gavage אוראלי של EHEC

  1. פנקו נקבה בת שבוע 6 C57BL/6 עכברים במים סטרפטומיצין (5 g/L) עבור 24 שעות.
  2. לאחר 24 שעות, לעבור שתייה רגילים עבור עוד 24 שעות לפני gavage. לאחר טיפול עם מים סדירה במשך 24 שעות ביממה, העכברים מוכנים gavage אוראלי של EHEC.
  3. למלא את המזרק עם 100 μL EHEC חיידקים על ידי למשוך בחזרה על הבוכנה. ודא אין בועות אוויר במזרק. הסר את הבועות על ידי הצמדת את המזרק עם האצבעות.
  4. הרם לחיה בעדינות ומניחים אותו על גג הכלוב עם טיפול.
  5. לתפוס את העכבר בזנב בקפידה, החיה לאחוז העליון של הכלוב ולנסות לעבור משם.
  6. בעדינות לרסן את העכבר על-ידי אחיזה של עור רפוי בצוואר וגב החיה עם האגודל והאצבע כדי למנוע את הראש של העכבר זז.
  7. החזק את העכבר בצורה מאונכת את המחט gavage ולהבטיח את שראשו של העכבר היא קיבוע ואנכי.
  8. את המחט gavage לתוך הפה העכבר בעקבות גג הפה והזז לתוך הוושט, לכיוון הבטן.
  9. כאשר המחט שנוסף הוא חצי או שני שלישים האורך העכבר, להזריק את החיידקים EHEC μL 100, אשר מכילים כ 109 CFU תאים.

4. ויזואליזציה

  1. לאחר gavage הפה, לזהות את האותות ביולומנאסן בימים 1 ו-2.
  2. לפני שבחן את האותות ביולומנאסן של בעלי חיים, עזים ומתנגד להם על ידי לשים אותם לתא של 2.5% איזופלוריין עם חמצן 1.5 ליטר/דקה.
  3. חכו 2-5 דקות עד עכברים כל להיות מודע, תפסיקי לזוז. בעלי חיים מוכנים ויוו גילוי של ביולומינסנציה.
  4. זיהוי של תמונה אותות ביולומנאסן של בעלי חיים על ידי יישום ויוו מערכת הדמיה. נא עיין בסעיף 5 "קירור והקפאה" לתפעול התוכנה. במהלך תהליך ההדמיה, כל החיות נמצאים תחת אספקה מתמשכת של 2.5% איזופלוריין עם חמצן 1.5 ליטר/דקה.
    1. לחץ על קובץ > חי, באופן ידני למקד על העכבר.
    2. בחר את עוצמת לייזר וזמן החשיפה.
    3. לחץ על רכוש > ללכוד.
  5. עבור ex-vivo הדמיה, המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם ולהסיר את המעי כולו של עכברים נגועים. למקם את המעיים 9 ס מ פטרי התמונה באמצעות ה ויוו מערכת הדמיה. ההגדרה היא זהה ויוו הדמיה רק בתחום התצוגה מוגדרת בתור A/B. לקבלת פרטים, עיין בסעיף 5 "קירור והקפאה".
    הערה: השיטה נקע בצוואר הרחם: לרסן את העכברים על גג הכלוב על ידי לתפוס את הזנב עם יד אחת כך החיות לאחוז את הכלוב. הצב עט מרקר או את האגודל והאצבע הראשון של היד השנייה נגד האחורי של הצוואר בבסיס הגולגולת. מהר לדחוף קדימה עם היד או אובייקט בעת הרחקה בראש ומשוך לאחור עם היד מחזיק את הזנב.
    בדוק מקרוב כדי לאשר דום נשימה, דופק.

5. קירור והקפאה

הערה: התוכנה ששימשה עבור רכישת נתונים מפורט בטבלה של חומרים.

  1. עבור רכישת התמונה, פתח את לוח הבקרה רכישה של התוכנה (איור 2).
  2. בחר "זורח", "צילום", ו "כיסוי".
  3. הגדרת זמן החשיפה בתור "אוטומטי". הגדר Binning כמו "בינוני".
  4. להגדיר פונקציות צפיפות/עצירה 1 עבור זורח ו- 8 עבור התמונה. פקדים פונקציות צפיפות/להפסיק כמות האור שקיבל גלאי CCD.
  5. הגדר את שדה הראיה בהתבסס על השדה של תמונות כי הם עניין לרכוש. האפשרות "D" ניתן להתאים עכברים 6 בת חמש, תמונה אותם כל באותו זמן. "C" אפשר תמונה שלושה עכברים בת שבוע 6 בשדה אחד.
  6. לאחר הדגימות העכברים/מוכן עבור הדמיה, לחץ על "רכוש" עבור רכישת התמונה.
  7. פתח את נתוני התמונה שנרכשה.
  8. פתח את החלונית ' הכלי ' הלוח (איור 3).
  9. בחר כלים ROI. אנו ממליצים על העיגול (אחד השמאלי ביותר) טווח האזור מייצרים אור על תמונות (איור 4).
  10. לחץ על "מדד ROIs" (סמל העיפרון) כדי למדוד את עוצמת מייצרים אור פני השטח (איור 3). לוח רועי המידות והערכים כימות מופיעים (איור 5).
  11. השתמש המדידה להגדיר על הפינה השמאלית של הפאנל רועי מדידות כדי לבחור הערכים/המידע הדרוש (איור 6), אחרת לחץ על "לייצא" לייצא את טבלת הנתונים ולשמור בתור קובץ csv (איור 5).
  12. להשתמש את הערכים בעמודה "סך השטף (p/s)" כימות עוצמת מייצרים אור בקובץ. csv.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

. הזמנו התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC (~ 109 תאים חיידקיים) 6 - בן שבועיים לעכברים C57BL/6 נשים על-ידי gavage דרך הפה. לאחר חיסון אוראלי של EHEC לעכברים בתוך 1 h, החיות נבדקו לאות זוהרים על-ידי ויוו מערכת ההדמייה, כפי שמוצג באיור 7. התוצאות הראו אות מייצרים אור חזק בעכברים gavage עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC. בדקנו את האותות על זיהום פוסט 2 ימים. כפי שמוצג באיור 8A, העכברים מחוסן עם התווית על-ידי ביו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבר דווח כי יש כבר מנוצל EHEC טרנספורמציה עם פלסמיד לוציפראז לבחון שלה לוקליזציה מארחים או גנים ביטוי ויוו8,11,12. המודל מאתר המודגמות כאן דווחה גם לזהות את העיתוי EHEC התנחלו ולוקליזציה מארח מאתר8. עם זאת, אנו מספקים פרוטוקול פירוט כיצד לנהל EHEC חיסון לעכברים intragastrically וכיצד להתכונן בקפידה את החיידקים מייצרים אור gavage דרך הפה. ראוי לציין, עבור העכבר gavage אוראלי של EHEC (שלב 3.7), המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו להכיר את צ'י-צ'אנג צ'ן מן המחלקה של מחקר רפואי, המרכז הרפואי של מיי צ'י (איחוד האמירויות הערביות) על העזרה עכבר, זיהום, והתמיכה מהמרכז חיות מעבדה של האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג. עבודה זו נתמכת על ידי שר המדע, הטכנולוגיה (רובם) מעניקה (ביותר 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) CC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חממת שייקרYIH DERLM-570Rדגירה של חיידקים 
אינקובטור טלטול אורביטליFIRSTEKS300דגירה של חיידקים 
pBSL180מקור לגן nptII
pAKlux2מקור לאופרון luxCDABE
T& ערכת שיבוטYeastern BiotechFYC001-20Pלשימוש לשיבוט TA 
Nsi אניב-NEBR0127Sלשיבוט פלסמיד 
Sca אניNEBR0122Sלשימוש בשיבוט פלסמיד 
Spe שימוש ב-HFNEBR0133Sלשיבוט פלסמיד 
Sma I שימוש ב- NEBR0141Sלשיבוט פלסמיד 
שימוש ב- T4 ligaseNEBM0202Sלשיבוט פלסמיד 
שימוש Ex TaqTaKaRaRR001Aלהגברת PCR
10X Ex Taq BufferTaKaRaRR001Aשימוש להגברת PCR
תערובת dNTP TaKaRaRR001Aשימוש להגברת PCR
PCRמיושמת Biosystem מחזור תרמי 2720   להגברת PCR
גליצרולSIGMAG5516-1Lשימוש לתמיסת גרב חיידקים
NaClSigma31434-5KG-Rכימי להכנת מדיום LB, 10 גרם/ליטר
טריפטוןCONDA pronadisaCat 1612.00כימי להכנת מדיום LB, אבקת תמצית שמרים 10 גרם/ליטר
Affymetrix23547-1 ק"גכימי להכנת מדיום LB, 5 גרם/ליטר
AgarCONDA pronadisaCat 1802.00כימיקל לייצור LB אגר
קנמיצין אנטיביוטיקה סיגמאK4000-5G, לשימוש בסטרפטומיצין סלציטון
 SigmaS6501-100Gאנטיביוטיקה, לחסל את המיקרוביוטה בעכברים
EDL933 תא מוכשרתוצרת ביתנמצאת במסמך משלים 
אלקטרופורטורMicroPulserלאלקטרופורציה
אלקטרופורציה CuvettesGene Pulser/MicroPulser1652086לאלקטרופורציה
צנטריפוגה מהירהבקמן קולטראוונטי, J-26S XPלשימוש לצנטריפוגה חיידקים 
רוטור זווית קבועהשימוש בקמן קולטרJA25.5לצנטריפוגה של חיידקים 
שימוש ברוטור בזווית קבועהבקמן קולטרJLA10.5לצנטריפוגה של חיידקים 
בקבוקי צנטריפוגהבקמן קולטרREF357003להשתמש בהם לצנטריפוגה של חיידקים 
בקבוקי צנטריפוגהתרמו פישר מדעי3141-0500שימוש לצנטריפוגה חיידקים 
אפנדורף ביופוטומטר פלוס eppendorfAG 22331 המבורגלמדידת ערך OD600 של חיידקים
עכברי C57BL/6 מעיל מעבדה של מרכז חיות המעבדה של NCKU
, כפפותלהגנת כוח אדם 
איזופלורן פאניון & BF ביוטק בע"מG-8669להרדמת עכברים, מזרק 1 מ"ל בדרגה פרמצבטית
 שימוש במחט האכלה אוראלית של עכברים
לשימוש חוזר 22 גרם מחט האכלהכדורי φ 0.9 מ"מ X L 50 מ"משימוש לטיפול אוראלי בעכברים
כירורגיים  מספריים שימוש בניסוי עכברים
מערכת הדמיה Xenogen IVIS 200ספקטרוםPerkin Elmerשימוש לצילום תמונות ביולומינסנציה 
תוכנת תמונה חיהפרקין אלמרגרסה 4.1משמשת לכימות נתוני התמונה
משתמש מכונת שיטה עם קצה IVIS

מקורות

  1. Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
  2. Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
  3. Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
  4. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  5. Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).
  6. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
  7. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  8. Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
  9. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
  10. Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
  11. Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
  12. Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
  13. Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).
  14. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
  15. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
  16. Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  17. Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
  18. Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
  19. Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
  20. Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
  21. Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).
  22. Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).
  23. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
  24. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  25. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  26. Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
  27. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  28. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  29. Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
  30. Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
  31. Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
  32. Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
  33. Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  34. Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
  35. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  36. Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

E. coli אנטרוהמורגידימיון ביו-לומנצנטידימיון In Vivoמודל התנחלות בעכברטכניקת זריקה פומית (Gavage)כימות לומנצנטיהתנחלות בעקוםהתנחלות במעי הגסדימיון Ex Vivoזיהוי לא פולשני
זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.