הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56171

⸱

20 באוגוסט 2017

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

תקציר

העכבר בתאי גזע עובריים (mESC) נגזרת הוא התהליך על ידי pluripotent אשר נקבעו שורות תאים מעוברים. קווים אלה שומרים על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים. בשל תכונות אלו, mESC הם כלי שימושי ב רפואה רגנרטיבית, מידול המחלה ולימודי הנדסת רקמות. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט להשיג mESC קווים עם יעילות גבוהה נגזרת (60-80%) מאת culturing blastocysts מן העכבר מתירניות זני מזין בתאים במדיום מוגדר עם לוקמיה מעכבות פקטור. הפרוטוקול ניתן גם ליישם ביעילות שואבים mESC קווים העכבר מתירני זנים, תוספת פשוטה של קוקטייל של שני מעכבי מולקולה קטנה למדיום נגזרת (2i בינוני). הליכים מפורטים על ההכנה ועל התרבות של תאים מזין, איסוף של תרבות של העכבר עוברי, נגזרת של התרבות mESC קווים הינם מסופקים. פרוטוקול זה אינו מצריך ציוד מיוחד, יכול להתבצע במעבדה כלשהי עם מומחיות תרבות בסיסיים בתרבית של תאים.

מבוא

תאי גזע עובריים (ESC) הם תאים pluripotent נגזר של עוברי, אשר לשמור על היכולת לחדש עצמי או להבדיל תחת תנאים מסוימים1. בהתבסס על מאפיינים אלה, ESC הפכו להיות כלי שימושי עבור רפואה רגנרטיבית מידול המחלה, לימודי הנדסת רקמות2.

ESC נשאבו בפעם הראשונה מעוברים עכבר של, שמקורם קווים העכבר ESC (mESC) עם3,הצלחה נמוך4. במשך שנים, היעילות נגזרת נשאר נמוך בשל הקושי של שמירה על pluripotency חוץ גופית בתוך. חוץ מזה הנוכחות של מזין תאים5, אשר לשפר את יעילות נגזרת, לקדם את המושבה המצורף, לשפר את יציבות karyotypic6, מספר שינויים ההפניה פרוטוקול על שיפור בתחזוקת pluripotency. החשוב ביותר היה התוספת של לוקמיה מעכבים מקדם (LIF) mESC תרבות בינוני7,8, השימוש של העוברים רקע מתירניות 129S29 ומוגדר התרבות של mESC בינונית בתוספת סרום, ללא פוטנציאל התמיינות גורמים10. לאחרונה, ראיות משכנעות הראו כי תוספת של קוקטייל של שני מאפננים מולקולה קטנה של איתות המסלולים למדיום תרבות mESC (המכונה 2i) הוא הטוב ביותר לשמור על pluripotency. 2i קוקטייל כוללת שילוב של החומר המדכא MEK PD0325901, אשר מפחית את האותות בידול על ידי עיכוב מסלול מופעל mitogen חלבון קינאז (MAPK), החומר המדכא GSK3β CHIR99021, אשר משפר הישרדות cell-צפיפות נמוכה על ידי הפעלת מסלול ונ ט11.

במאמר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ביעילות לנבוע mESC קווים העכבר blastocysts. אנו עוקבים אחר הליכים סטנדרטיים, culturing העוברים מן מתירניות זני מזין בתאים נגזרת בינוני עם LIF, החלפת סרום12. בעקבות זה לפרוטוקול, שורות mESC יכולות לנבוע עם היעילות מקבילה לאלו שהושגו 2i בינוני. למרות זאת, ניתן להוסיף 2i כדי למנוע בעיות אפשריות עם pluripotency תחזוקה או בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש של בעלי החיים המתוארים בסעיפים שלהלן אושרה על ידי ועדת האתיקה על חיות והמחקר האנושי של ברצלונה דה Autònoma Universitat ועל ידי Departament d ' פסקה חקלאיות וציוד, Ramaderia, אני Alimentació של Generalitat דה קטלוניה (פרוטוקול #8741).

1. מזין תאים איון ואחסון

הערה: העורלה האנושי fibroblasts (HFF-1) היו בעבר קפוא 1 מ"ל של הקפאה פתרון בהיקף של 90% סרום שור עוברית (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד ( דימתיל סולפוקסיד) והם מאוחסנים חנקן נוזלי עד שימוש.

  1. להפשיר בקבוקון קריוגני HFF-1 (1 מ"ל) במועט המבחנה באמבט מים 37 ° C.
  2. להוסיף את תכולת המבחנה קריוגני המופשרים ומחוממת מראש Dulbecco ' s נשר שונה ' s בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS לעשות 1:10 דילול.
  3. זרע התאים מדולל (10 מ"ל) בבקבוקון T75 ואת תרבות אותן ב- CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  4. למחרת, לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.
  5. תרבות HFFs את ולשנות את המדיום כל 48 שעות עד התרבות מגיע השלב confluent. פעולה זו עשויה להימשך כ- 7 עד 10 ימים.
  6. להכין את הפתרון איון, לדלל מיטומיצין C ב- DMEM בתוספת 10% FBS-ריכוז סופי של 10 µg/mL. דגירה התאים עם הפתרון איון עבור h 3-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2.
  7. להסיר הפתרון איון ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) כדי לסלק שאריות מיטומיצין C.
  8. כדי לנתק את התאים מוחלש, להוסיף 1 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA ומחוממת מראש ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  9. לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהן מנותק (10 x המטרה עם מפתח נומרי או נה 0.3). אם הם לא, דגירה אותם במשך עוד כמה דקות-CO 37 ° C ו-5% 2. בדוק את התאים שוב תחת המיקרוסקופ הפוך.
  10. Pipette את הפתרון עם פיפטה פסטר על מנת לבטל כגיהנום תא.
  11. לנטרל את הפתרון אנזימטי על-ידי הוספת 4 מ ל בתוספת 10% FBS ו resuspend DMEM.
  12. לקחת את aliquot של התליה תא ולעשות לדילול בטחונות ב- HBSS. כדי לקבוע את מספר התאים, טען µL 10 של הדילול נויבאואר ' s קאמרית. לספור את התאים הממוקם באחד הריבועים הגדול של התא תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 x המטרה עם נה 0.45).
    1. לחזור על הספירה סך של ארבעה ריבועים גדולים. לחשב את המספר הכולל של תאים (N) כמו N = מספר ממוצע של תאים ספרתי x הנפח הכולל x דילול x 10 4.
  13. Centrifuge לשאר המדגם למשך 5 דקות ב 200 x ג' להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם מקפיא פתרון ריכוז 10 6 תאים לכל mL-
  14. Aliquot התליה של מבחנות הקפאה עם 10 6 תאים (1 מ"ל) כל. מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכל ההקפאה ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס
  15. למחרת, לאחסן את הבקבוקונים הקפאה בחנקן נוזלי.

2. תרבית תאים מזין

  1. 1-4 ימים לפני התחלת תהליך נגזרת, הפשרה בקבוקון קריוגני המכיל 1 x 10 6 להשבית HFF-1 תאים בתוך אמבט מים ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. לגרום לדילול 1:6 המופשרים HFF 1-מראש חימם DMEM בתוספת 10% FBS ולשמור הטמפרטורה ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. מלא בכל טוב של צלחת 4-ובכן עם 500 µL של ג'לטין מראש ומחוממת 0.2% מן העור חזירי ולשמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
  4. להסיר את µL 500 של ג'לטין מן הבארות ולהוסיף 500 µL של דילול HFFs. רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח התפלגות אחידה של HFFs על החלק התחתון של הבארות. להימנע בתנועות סיבוביות, אחרת התאים יתרכז במרכז הבאר.
  5. דגירה את הצלחת לפחות 24 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי להשיג של טפט של HFFs לא מופעל כל היטב.
  6. למחרת, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה (10 X המטרה עם נה 0.3) ולבדוק כי הם מחוברים, homogeneously מבוזרת. לשנות את המדיום לחסל את שרידי דימתיל סולפוקסיד. להסיר את המדיום ולהוסיף 500 µL של DMEM מראש ומחוממת בתוספת 10% FBS.

3. אוסף העובר ותרבות

  1. 4 ימים לפני אוסף העובר, לנהל 5 IU של סוסה הרה ' s גונדוטרופין סרום בזריקה בקרום הבטן לעכברים נקבה שבוע 6-12.
    הערה: השתמשנו נקבות 129S2 או זנים B6CFAF1, למרות נקבות מפני זנים אחרים העכבר יכול לשמש. ובכל זאת, כאשר עובדים עם הנקבות ממתירני זנים (למשל כקבוצת), בינוני יש להשלימה עם 2i כאמור בשלב 4.2.
  2. לאחר 48 שעות, לנהל 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי על-ידי הזרקת בקרום הבטן, חבר הנקבות עם גברים, זקנים, ביחס של 1:1 לפחות 8 שבועות. להפריד בין הנקבות מן הזכרים למחרת.
  3. יום לפני איסוף העובר, להכין תרבות 35 מ מ תא צלחת פטרי עם מספר 40 טיפות µL בינוני KSOMaag בתוספת 4 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA), למלא את הצלחת עם שמן מינרלי כדי כיסוי מלא הטיפות. דגירה המנה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי equilibrate של המדיום.
  4. להכין את העובר מניפולציה פיפטות, מחממים את חלק רזה זכוכית ארוך שקצהו פיפטה פסטר באמצעות מבער בונזן. ברגע רכים, מסירים אותה מן הלהבה ו להפריד את שני הקצוות. לשבור את זה עד לאורך הרצוי. הקוטר הפנימי בקצה צריך להיות 100-150 מיקרומטר.
  5. המתת חסד העכברים נקבה על ידי נקע בצוואר הרחם 45-48 h פוסט-coitum (p.c.).
  6. לנתח העכברים לחשוף את חלל הבטן על ידי חיתוך העור עם מספריים חדות מעוקלים חלקה ו של הצפק עם מספריים חדות ישר. תפוס את הרחם אחת עם מלקחיים, לחתוך את oviduct באמצעות מספריים חדות ישר, ולמקם אותו בינוני (HCZB) CZB Hepes באגירה 13-37 ° C. חזור על התהליך כדי להסיר את oviduct אחרים.
  7. סומק oviducts עם מזרק 1 מ"ל עמוסה HCZB שנערך במקום על ידי שען מלקחיים כדי לאסוף את העוברים 2-תא.
    הערה: כדי להכין לקחת מחט שטיפה מחט תת-עורית 30 גרם, לחתוך את הקצה על הקרקע עד קצה קהה על אבן שוחקים.
  8. באמצעות המנגנון פיפטה בפה, לאסוף את העוברים, לכבס אותם במים HCZB, תרבות אותם בצלחת תרבות העובר מוכן קודם לכן ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 עד לשלב הבלסטוציסט. עד 50 עוברי יכול להיות בתרבית בתוך כל טיפה 40 µL. לעקוב אחר התפתחות העובר בכל 24 שעות תחת stereomicroscope.
    הערה: לחלופין, העוברים ניתן לאסוף בשלב הבלסטוציסט כדי לקצר במבחנה העובר תרבות. במקרה זה, המתת חסד הנקבות ביום 3.5-4.5 p.c., לנתח את הרחם. מדובר עם HCZB.

4. תא גזע נגזרת

  1. הכנה של הלוחות נגזרת
    1. ביום של העובר זריעה, להכין המדיום נגזרת על ידי שכשהם DMEM בינוני עם 100 מיקרומטר 2-β mercaptoethanol, 1 x חומצות אמינו שאינם חיוניים , 20% של החלפת סרום ו- 10 3 U/mL LIF.
    2. במידת הצורך, גם להוסיף 1 מיקרומטר של המדכא MEK PD0325901 ו-3 מיקרומטר של המדכא GSK3 CHIR99021 כדי לקבל מדיום 2i.
    3. לוקח את הצלחת 4-ובכן עם טפט של HFFs מוחלש (שלב 2.6) מ חממה. להסיר את המדיום ולהוסיף µL 800 נגזרת מראש ומחוממת בינוני כל טוב. להחזיר את הצלחת החממה.
  2. העובר זריעה וניקוי Zona pellucida
    1. הכנת תרבית תאים של 35 מ מ צלחת פטרי עם µL 30 שלוש טיפות של Tyrode חומצי ' s פתרון 14 ו- µL 30 שלוש טיפות של גזירת בינוני. לכסות את הטיפות עם שמן מינרלי ולשמור את המנה ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. קח את הצלחת תרבות העובר מן החממה. אחד אחרי השני, להעביר blastocysts את הטיפות התרבות Tyrode חומצי ' s פתרון טיפה באמצעות פיפטה מניפולציה של העובר. אם אפשר, בחר רק את blastocysts מורחבת כדי להתחיל את תהליך הערכת.
    3. לפקח על העיכול zona pellucida תחת stereomicroscope. ברגע pellucida zona נעלמת, להעביר את הבלסטוציסט ירידה בינונית נגזרת על מנת לשטוף את Tyrode חומצי ' פתרון s.
    4. לוקח את הצלחת 4-ובכן נגזרת מן החממה ואת זרע אחד נטול zona הבלסטוציסט במזין תאים היטב לכל.
    5. להחזיר את הצלחת נגזרת 4-ובכן חממה והתרבות-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  3. בינוני וצמיחה של תאי גזע ניטור לשנות
    1. לפקח על התרבויות כל 24 שעות תחת מיקרוסקופ הפוכה (20 X המטרה עם נה 0.45). חשוב לשים לב אם קיימים סימנים של התמיינות תאי גזע, כגון נפוחות השבירה תאים המקיפים את תוצר או אפילו שדחקו את המזין תאים הצידה.
    2. בכל יום אחר, לשנות את המדיום של התרבות. לוקח את הצלחת 4-ובכן מן החממה, להסיר את המדיום מכל קידוח ולהוסיף µL 800 בינוני נגזרת מראש ומחוממת עם LIF ו- 2i, אם נעשה שימוש. לשמור על התרבות עד outgrowths שנצפו (6-8 ימים).

5. תא גזע תרבות ותחזוקה

  1. הכנת Kolle כמו ידיות, פיפטות מניפולציה תאי גזע. בצע צעד 3.4 להכין את תאי הגזע פיפטות מניפולציה בקוטר הפנימי בקצה של 250-300 מיקרומטר. השתמש החלק השני של פיפטה פסטר משך כדי להכין את הידית, כמו Kolle. מחממים ולעצב אותו עד קבלת וו.
  2. לוקח את הצלחת. ובכן 4 תרבות מתוך החממה ואתר את תוצר תחת stereomicroscope. להשתמש בידית כדי להרחיק את התאים הבדיל ומזינים את המקיפים את תוצר.
    הערה: כדי להימנע בסופו של דבר הבידול של תוצר, חשוב להסיר את כל התאים הבדיל מהקצה של תוצר.
  3. וארוקן את תוצר עם פיפטה מניפולציה תאי גזע ולמקם אותו תבשיל חדש בטיפה טריפסין-EDTA 50 µL-
  4. השימוש באזמל לחתוך את תוצר בכמה חלקים על מנת disaggregate זה מכנית והן enzymatically.
  5. מיד, להעביר את שברי תוצר לתוך טיפה טריים של גזירת בינוני לנטרל טריפסין פעולה.
  6. להעביר השברים תוצר צלחת 4-ובכן חדשה עם טפט של מזינים. להעביר עד 10 קטעים מפוצלים טוב ואת תרבות אותם עם נביעה בינוני-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  7. לשמור על התרבויות תאי גזע דמוי לפחות שישה שבועות לפני בהתחשב הקו mESC הוקמה. לשנות המדיום. כל יום, תת-תרבות אחרים אותם פעם בשבוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה, מעל 95% תוצר היווצרות צריך להיות מושגת לאחר השבוע הראשון של תרבות (איור 1 א'). הקמת קווי mESC לאחר 6 מעברים הוא משתנה בין משכפל ניסיוני, עם הצלחה ממוצע של 60-80%. התוספת של 2i לא באופן משמעותי לשפר את התוצאות בעת עבודה עם עכבר מתירניות זנים, כגון אלה עם רקע 129S2, אבל זה הכרחי בעת עבודה עם זנים שאינם מתירניות.

ESC העכבר מושבות צריך להציג מורפולוגיה רגיל צורה שטוחה, מוגדר קצוות כא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות mESC קו נגזרת היא הליך ידועים בשימוש שגרתי במעבדות רבות, היעילות שלה אינה גבוהה כמצופה לאור הגורמים מרובים יכולים להפריע pluripotency תחזוקה תמיד. במאמר הנוכחי אנו מציגים, צעד אחר צעד, כיצד להקים קווי mESC עם יעילות גבוהה באמצעות פרוטוקול פשוטה ואמינה. היעילות אלה דומים לאלה שדווחו בספרות.

כדי להבטיח יעילות מרבית, חשוב לשלוט התאים כל יום או כל יום אחר, מאז הפעם נקודות המצוין הם רק להמחשה. זה חיוני כדי למנוע את צמיחת יתר של מושבות, מאז זה מעודד את מות תאים ובידול. חשוב גם להפחית ככל האפשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים יונתן לוקאס לסיוע טכני שלו עם תרבית תאים מזין, Servei Estabulari de la UAB עבור טיפול בבעלי חיים, מרטין Domènec עבור הקלטת הוידאו. עבודה זו היא נתמכה על ידי y Ministerio דה Economia Competitividad AGL2014-52408-R ו- Generalitat דה קטלוניה 2014 SGR-524. MVC הוא המוטב של מלגת PIF-UAB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל שרינגBD 
2-β-mercaptoethanolLife Technologies31350-010
צלחת 4 בארותThermo Scientific Nunc176740
תמיסת טירוד חומצית תוצרתראה מתכון ב- Nagy et al, 2003. לאחסון לטווח קצר (עד חודש) שמור אותו על 4ºC. לחלופין, לאחסון לטווח ארוך שמור אותו על -20ºC. אם יעילות התמיסה פוחתת, יש להחמיץ אותה על ידי הוספת טיפה קטנה של HCl 1M. 
BSASigmaA3311
עוף נגד עכבר IgG, Alexa Fluor 488בדיקות מולקולריות - דילול InvitrogenA-212001:500. נוגדן משני לנוגדנים לעכברים Oct4, Tuj1, αSMA ו-AFP. 
CHIR990212Axon Medchem 1386הרכיבו מחדש עם 2.15 מ"ל DMSO עבור כל מ"ג אבקה, לקבלת תמיסת מלאי של 1 מ"מ. יש לאחסן בנפח הרצוי ולאחסן בטמפרטורה של -20ºC. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה. 
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810השבת אותו לפני השימוש על ידי חימום למשך 30 דקות ב-56ºC. Aliquot ואחסן ב-20º C
מחט שטיפהBD 304000חותכים את קצה המחט וטוחנים לקצה קהה על אבן שוחקת
ג'לטין מעור חזירפלוקה48724מדללים ב-0,2% במים מזוקקים ומבצעים חיטוי. ניתן להשתמש בכל דילול למשך חודש.
עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 594בדיקות מולקולריות - דילול InvitrogenA-110371:500. נוגדן משני לנוגדנים לארנב Sox2. 
HBSSBioWestL0611
CZB  חוצץ Hepes;תוצרתראה הרכב ב-Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropinDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIדילול ב-NaCl 0.9% ב-50 IU/ml. יש לצרוך אותו ב-1 מ"ל ולאחסן ב-20º C עד חודשיים. לאחר ההפשרה אין להקפיא שוב. 
פיברובלסטים של עורלה אנושיתATCCATCCSCRC-1041לאחסון לטווח ארוך מומלץ לאחסן אותם בחנקן נוזלי.
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies  10828-028רגיש לאור. מומלץ לצטט אותו בכמויות קטנות כמו 10 מ"ל ולאחסן אותו ב-20º C (בדוק את תאריך התפוגה). הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה.     
תוסף KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050עם 4 מ"ג/מ"ל BSA. שיווי משקל ב-37º C ו-5% CO2 יום לפני השימוש.
גורם מעכב לוקמיהMerk MilliporeESG1106
עכברים צ'ארלס ריבר/הרלןמומלץ להשתמש בעכברים מזן מתירני מבחינת נגזרת mESC (כגון 129S2 או C57BL). עם זאת, זני גזע פחות יעילים בייצור עוברים. לכן, מומלץ להשתמש בזן היברידי, כגון 129S2 x C57BL או B6CBAF1 כדי לנצל את המרץ ההיברידי.
שמן מינרליSigmaM8410נבדק עובר. רגיש לאור. 
Mitomycin CServa2980501להרכיב מחדש את האבקה עם מי MilliQ ב-0.5 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן ב-4º C מוגן מפני אור. שימו לב, זה מזיק וחשוד כגורם לסרטן. 
עכבר אנטי טובולין ובטא; III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500 דילול
עכבר חד-שבטי אנטי-&אלפא;SMASigmaA52281:200 דילול
עכבר חד-שבטי אנטי-AFPR& D SystemsMAB13681:50 דילול
עכבר חד שבטי אנטי Oct3/4 סנטה קרוזSC-52791:50 דילול
חומצות אמינו לא חיוניותטכנולוגיות חיים11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408Reconstruct עם 2.08 מ"ל DMSO עבור כל מ"ג אבקה, לקבלת תמיסת מלאי של 1 מ"מ. יש לאחסן בנפח הרצוי ולאחסן בטמפרטורה של -20&C. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה.
צלחת פטרי (35 מ"מ)Thermo Scientific Nunc153066
(60 מ"מ)Thermo Scientific Nunc150288
גונדוטרופין סרום סוסה בהריוןFoligonFoligon-1000 UIמדולל ב-NaCl 0.9% ב-50 IU/ml. יש לצרוך אותו ב-1 מ"ל ולאחסן ב-20º C עד חודשיים. לאחר ההפשרה אין להקפיא שוב. 
ארנב פוליקלונלי אנטי-Sox2Merck MilliporeAB56031:200 דילול
T75 בזThermo Scientific130190
Trypsin-EDTA 10xBioWestX0930מדלל 1:10 ב-HBSS לקבלת תמיסה 1x
309628 בית בית צלחת פטרי

מקורות

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע עובריים של עכברתרבית עובריתהכנת תאי מאכילהפקה מבלסטוציסטגורם מעכב לוקמיהמצע 2iהסרת הזונה הפלוצידהתתי-תרבית של תאי גזעסממני פלוריפוטנציאליותדיפרנציאציה של שכבות עובריות
נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.