מאמר שיטה

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

12.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56185

⸱

21 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of California, 2Program in Immunology, University of California, 3Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 4Department of Pathology, Stanford University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לגרום לדלקת שיתוק ובעיות opticospinal על ידי העברה של aquaporin-4 (AQP4)-תאי T ספציפי של עכברים- / - AQP4 לתוך WT עכברים. בנוסף, נדגים כיצד להשתמש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית טורי כדי לפקח על תפקוד מערכת הראייה.

תקציר

בעוד הוא מוכר הזה aquaporin-4 (AQP4)-תאי T ו נוגדנים ספציפיים להשתתף בפתוגנזה של neuromyelitis אופטיקה (NMO), מחלות אוטואימוניות המיאלין במערכת העצבים המרכזית (CNS) האנושית, היצירה מודל ממוקדות AQP4 עם שניהם ביטויים קליניים היסטולוגיים של מחלת חיסון עצמי CNS הוכיחה מאתגר. חיסונים של פראי-סוג עכברים (WT) עם פפטידים AQP4 elicited תא T התפשטות, למרות האלה בתאי T אינו יכול להעביר מחלות לעכברים הנמען תמים. לאחרונה, רומן שני AQP4 T תא epitopes, פפטיד (p) 135-153, p201-220, אותרו כאשר לומדים החיסון התגובות AQP4 בעכברים AQP4 לקויה (AQP4- / -), רומז תגובתיות תא T כדי epitopes אלה נשלטת בדרך כלל על ידי הרתי מבחר שלילי. AQP4- / - Th17 קוטביות בתאי T בשלה p135-153 או p201-220 המושרה שיתוק בעכברים WT הנמען, שהיה משויך ברובו leptomeningeal לדלקת של חוט השדרה, העצבים האופטים העצבים האופטים שמסביב דלקת ומעורבות של השכבות הפנימיות ברשתית (IRL) באו לידי ביטוי בשערי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית טורי (אוקטובר). כאן, אנו ממחישים את הגישות המשמש ליצירת ויוו המודל החדש של CNS, ממוקדות AQP4 מחלת חיסון עצמי (ATCA), אשר יכול להיות מועסק עכשיו ללמוד מנגנונים המאפשרים התפתחות תאי T ספציפי AQP4 פתוגניים, איך הם תשתף פעולה עם B תאים ב- NMO פתוגנזה.

מבוא

Neuromyelitis אופטיקה (NMO) היא מערכת העצבים המרכזית (CNS) אוטואימוניות דלקתיות מחלה כרונית הגורמת פרקים חוזרים ונשנים של שיתוק ואובדן חזותי שמוביל נכות נוירולוגית קבועה1. NMO כיום נחשבת בעיקר מחלות אוטואימוניות ההורמונאלית2 כמו זו קשורה נוגדנים (ירושלים) מיקוד aquaporin-4 (AQP4), תעלת מים לידי ביטוי בשפע האסטרוציטים3,4. אולם, CNS דלקת היא תנאי הכרחי לכניסה CNS של AQP4 Ig5,6. לכן, זה לא היה אפשרי ליצור מודל של NMO באמצעות העברה של החברה הגניאלוגית הישראלית anti-AQP4 לבד. הממצאים כי פתוגניים (1) החברה הגניאלוגית הישראלית ספציפי AQP4 בחולים NMO נמצאים IgG11,2, Ig תלויי-תא T ותאי T7 (2) מחלקת מזוהים ב- NMO נגעים8,9 (3) NMO קשורה עם גנים מסוימים MHC II (למשל הלע-DR17 (DRB1 * 0301 בשידור))10ו- proinflammatory (4) ד ר AQP4-תגובתי-מוגבל Th17 תאים מורחבות NMO חולים11,12 כל מציינים כי בתאי T ספציפי AQP4 יש תפקיד מפתח ב- NMO פתוגנזה. לכן, חשוב לפתח מודלים בעלי חיים כדי לקבוע כיצד תאי T ספציפי AQP4 עשוי לתרום NMO פתוגנזה.

לפני כמה שנים, epitopes תא AQP4 T מרובים אותרו בפראי-סוג (WT) עכברים13,14 וחולדות15. בזמן זה היה ציין כי תאי T AQP4-תגובתי שיכולים לזרז דלקת opticospinal תמים חולדות הנמען15,16, לא נצפו סימנים קליניים משמעותיים למחלות מערכת העצבים המרכזית. באופן דומה, ישיר חיסון של WT עכברים עם פפטידים המכילים AQP4 T תא epitopes14,17, או העברה של proinflammatory T תאים מיקוד האלה גורמים17, לא גרמה סימנים קליניים או היסטולוגית עדות CNS מחלת חיסון עצמי.

לאחרונה, זה היה ציין כי חיסון של C57BL/6 AQP4 לקויה (AQP4- / -) עכברים עם פפטיד AQP4 (p) 135-153 או p201-220, שני גורמים חזה כדי לאגד MHC II (-Ab) עם זיקה גבוהה18, elicited CD4 חזק + תא T תגובות17. לעומת זאת, אלה שני פפטידים elicited רק צנוע התגובות המקדימות בעכברים WT. יתרה מזאת, הרפרטואר קולטן (TCR) תא T המשמש לזיהוי של גורמים אלה על-ידי תאי T של עכברים- / - AQP4 היה ייחודי. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה מציינים כי הכרה תא T AQP4 מוסדר על ידי בחירה שלילי הרתי. AQP4 p135-153-p201-220-ספציפיים או תאים Th17 AQP4- / - תורם עכברים המושרה שיתוק כמעט 100% של עכברים WT הנמען תמים; זה היה קשור תסנין opticospinal של תאי T, תאים B ומונוציטים. טומוגרפיה קוהרנטיות opticospinal טורי (אוקטובר) הפגינו מעורבות מערכת הראייה דינמי. עכברים עם T תאית CNS, ממוקדות AQP4 מחלת חיסון עצמי (ATCA) התאוששה שיתוק ופציעה מערכת הראייה. בניגוד EAE שנגזרות המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) p35-55-ספציפי T תאים, אשר הובילה המחלה הקלינית מתמיד, ATCA הנגרם על ידי תאי T לבד לא היה מזוהה עם אובדן עצב או צמצום בתאי גנגליון (RGCs). התוצאות שלנו הראו בבירור כי ישנם מספר גורמים לתא AQP4 T פתוגניים. המודל החדש של ATCA שימושית לצורך לימוד מנגנוני שליטה התפתחות תאי T ספציפי AQP4 פתוגניים, לומד כיצד תאים אלה לגרום לדלקת CNS, איך הם תשתף פעולה עם תאים ספציפיים AQP4 B ונוגדנים כדי לקדם NMO פתוגנזה .

בדו ח הנוכחי, אנו מתארים בפרוטוקולים המשמשים זירוז ולהעריך ATCA תא T-induced. אנו מתחילים עם הטכניקות להשתמש חיסון, תרבית תאים T של קיטוב Th17 ליצירת תאי T ספציפי AQP4 פתוגניים, ניתוח cytometry זרימה כדי לאשר קיטוב והעברת המאמצים האלה בתאי T. לאחר מכן נתאר את שיטות השתמשו כדי להעריך מחלה קלינית היסטולוגיים ושימוש סדרתי OCT כדי לפקח על מערכת הראייה פציעה בעכברים הנמען.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם הנחיות ניסיוני שאושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו אכפת חיה מוסדיים שימוש הוועדה. C57BL/6 (H-2 b) הנקבה עכברים, 8 שבועות של גיל, נרכשו, עכברים - / - C57BL/6 AQP4 נמסרו על-ידי Verkman א.

1. חיסון של עכברים עם פפטידים AQP4

  1. להכין פרוינד שלמה ' מלאי עבודה אדג'וונט (CFA) s.
    1. לטחון דק הכנה מיובש של מ. שחפת (H37Ra) באמצעות ומכתש.
    2. הוסף קרקע H37Ra כדי לא שלמה פרוינד ' s אדג'וונט כדי ריכוז סופי של 4 מ"ג/מ"ל. פרנק שניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.
  2. התמוססות lyophilized אנטיגן (Ag) פפטיד AQP4 בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. לשמור על 4 ° C או על קרח
  3. להכין ההרכבה של 2 מזרקים נעל-סכינים סטריליים, הצטרף עם צימוד, המכיל האמולסיה פרנק/פפטיד.
    1. צרף מזרק נעל זכוכית-זכוכית ללא הבוכנה צימוד ניילון 3-way עם 2 קשרים סכינים סטריליים זכר-lock. סגור את צימוד על ידי מיתוג את ידית לכיוון המזרק. מקם את הקצה הפתוח של המזרק למעלה, המאפשר את המזרק לפעול כמו מבחנה. שם את זה מתלה צינור ליציבות נוספת.
      2. מלאי עבודה
    2. מערבולת פרנק, הפתרון Ag. להוסיף נפח 1:1 של פפטיד / פרנק את המזרק פתוח. 200 µL של פרנק/Ag (4 x 50 µL) נדרש לכל העכבר.
      הערה: בדרך כלל, כ 1 מ"ל של הכנה הולך לאיבוד צימוד, אשר תפחית את כמות זמינה עבור חיסונים. לכן חשוב לשלב זה חישוב הנפח הכולל הנדרש.
      דוגמה: עבור חיסונים של עכברים 5: (חיות חיים µL x 5 200) + 1 מ"ל יותר נפח = 2 מ"ל סך פרנק/Ag דרוש.
    3. הכנס על הבוכנה זכוכית לתוך המזרק ובזמן המחזיקים אותו במקומו, להפוך את המזרק כך צימוד מכוון כלפי מעלה. לעבור את ידית צימוד החיבור הנשי שאינם בשימוש. בזהירות הפעילו לחץ על הבוכנה זכוכית כדי להסיר עודפי המזרק. הנוזל מילוי החיבור נעל-סכינים סטריליים הזכר השני של צימוד.
    4. לצרף מזרק זכוכית השני (הבוכנה הוכנסה במלואה) החיבור נעל-סכינים סטריליים הזכר השני של צימוד. . זה אמור להיות מערכת סגורה של מזרקים זכוכית 2 קשור של צימוד המכיל כ אוויר עודף קטן ככל האפשר.
    5. ליצירת תחליב, לערבב על ידי סתימות של לעבור הנוזל לסירוגין בין מזרקים 2 עבור 2 דק צ'יל תארגן את הדברים על קרח במשך כ 10 דקות חוזר את מצמררת ולערבב עד שלא יהיה שינוי ברור צמיגות התכשיר , וכתוצאה מכך ברוטב נוקשה מאוד, לבן. להכניס למקרר של מזרקים המכיל האמולסיה ב 4 ° C או לשמור על קרח
  4. להעביר כל האמולסיה מזרק זכוכית-lock כוס אחת, להסיר את המזרק כוס ריקה ולהחליף אותו עם מזרק זכוכית-lock 1 מ"ל להזרקה. למלא את המזרק חדש אמולסיה, הסר אותה ממנה צימוד ולצרף מחט (25G x 5/8)-
  5. " מים -מבחן " האמולסיה עקביות. לגרש טיפת האמולסיה לתוך קערה קטנה עם מים. האמולסיה לא אמורים להתפזר, המציין כי זה מתאים הזרקת.
    1. אם האמולסיה מפזר, זה לא מוכן להזרקה; העברת הנוזל בחזרה לתוך הכוס מזרקים וממשיכים לערבב, ואז מקררים שוב עד האמולסיה, זה השריר המתוח.
    2. מבחן האמולסיה שוב עד מרקם תקין השיגה.
  6. להזריק עכברים - / - תורם AQP4 subcutaneously (ש) עם תחליב המכיל את פפטיד AQP4. כל עכבר מקבל 4 x 50 µL ספורטינג זריקות (200 µL הכולל (פפטיד µg 100)). האתרים 4 לכלול הן את צידי הבטן התחתונה, אשר נשפכים בלוטות הלימפה במפשעה (בתוך), והן את שני הצדדים של הקיר החזה המדיאלי כדי כל בית השחי, אשר נשפכים LN. בבית השחי העברת המאמצת ידרוש 1-2 עכברים לחסן התורם לכל נמען העכבר.

2. תרבית תאים T ו- Proinflammatory T תא קיטוב

  1. 10-12 ימים לאחר חיסון, לאסוף LN העכברים.
    1. במגש קרח, להכין צלחות פטרי 60 מ מ מצוידים עם מסננת תא (רשת שינוי גודל 70 מיקרומטר), המכיל צוננת המדיה RPMI עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- U/mL 100 פניצילין-100 µg/mL סטרפטומיצין (עט-דלקת) (RFPS).
    2. Euthanize עכברים כתוצאה מחשיפה CO 2, ואחריו נקע בצוואר הרחם. לטבול עכברים ב-70% אתנול, ואז להצמיד לו כל טביעות רגל ללוח לנתיחה.
    3. חותכים חתך בעור קו האמצע מהמפשעה בצוואר ומטה בכל רגל. משוך את העור מן הצפק ולהדק אותו tautly ללוח. לנתח LN המפשעתית, בבית השחי, מניחים צלחת פטרי המכילות RFPS, על קרח. 19
    4. לניסויים העברה המאמצת, לשלב בתוך של כל בעלי החיים בתוך הקבוצה חיסונים. עבור ניתוחים cytometric זרימה של שימוש Vβ, להפריד בעוד חיות בודדות.
  2. מניחים מסננת את התא המכיל את LN לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL המכיל RFPS. השתמש סוף פומפה מזרק 5 מ ל סטרילי שטוח להקיש בתוך התאים דרך מסננת, כביסה עם 20-30 מ של RFPS כדי לאפשר התאוששות של התאים. לשמור על תאים בתוך קרח במהלך העיבוד עד זמן תרבות.
  3. לשטוף פעמיים, צריך שתוציאו ב 393 x g למשך 5 דקות. לאחר השטיפה השנייה resuspend התאים LN בתקשורת תא T (TCM). TCM מכיל RPMI עם 10% חום-לא פעיל FBS, 292 µg/mL-גלוטמין, 110 פירובט נתרן µg/mL, ו- 55 מיקרומטר מרקפטואתנול, עט-דלקת. בדרך כלל, משמש אמצעי אחסון של 5 מ ל TCM לכל תורם העכבר.
  4. לספור את התאים LN. התשואה הצפוי הוא כ 3-6 x 10 7 בתוך תאים לכל חיסון העכבר התורם. להפריש 3-4 x 10 6 עבור וזמינותו התפשטות (ראה סעיף 3 להלן).
  5. להגדיר מקטב תרבויות להעברת המאמצת (סעיף 6).
    1. להכין Th17 תרבות מהפכנית של 5 x 10 6 בתוך תאים לכל מ עם 10 µg/mL Ag, 20 ng/mL העכבר רקומביננטי אינטרלויקין (IL)-23 ועכבר רקומביננטי ng/mL 10 IL-6 ב TCM.
    2. לחילופין, עבור Th1 קיטוב, להכין תרבות של 5 x 10 6 בתוך תאים לכל מ עם 10 µg/mL Ag ועכבר רקומביננטי ng/mL 10 IL-12 ב TCM.
    3. להוסיף 2 מ ל (1 x 10 7 תאים) לכל טוב של התערובת תרבות מהפכנית על פלטה 12-. טוב. התאים בתוך 2-4 התורם עכברים ימלא לוח 12-טוב אחד. לשמור על תרבויות חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור ה 72
    4. בדיקה חזותית התאים LN בתרבות להפעלה ב 48 שעות ו ה 72 הופעל תאים יהוו אשכולות רב תאי T יגדל בגודלם, הופך להיות יותר pleomorphic. העלייה בחילוף החומרים יגרום פגיעה של ה-pH בתקשורת, החלפת מ אפרסק כתום. אם ה-pH נמוך מספיק כדי להפעיל את המדיה צהוב, להוסיף 1 מ"ל של TCM טריים כדי למנוע רעילות תאים ה 24 הנותרים
    5. המשך סעיף 6 להעברת המאמצת. קיטוב יעילות ניתן לבירור על ידי ציטוקינים תאיים מכתים (ICS), כמו לתארibed בסעיף 5.
  6. להגדיר תרבויות באמצעות LN של עכברים בודדים עבור ניתוח תזרים cytometric Vβ משטח הביטוי (סעיף 4).
    1. להכין 5 x 10 6 בתוך תאים לכל מ עם 10 µg/mL Ag ב- TCM.
    2. להוסיף 2 מ ל (1 x 10 7 תאים) של התרבות לכל טוב על פלטה 12-. טוב. תרבויות צריכה להישמר ב חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 10 ימים. המשך סעיף 4-

3. התפשטות Assay

הערה: זה ממשיך מ סעיף 2.4.

  1. להכין 3-4 מ"ל של תאים בתוך צינור, 2 x 10 6 תאים לכל מ ל TCM.
  2. לערבב בעדינות את התאים על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים ולאחר מכן להעביר שוקת סטרילי.
  3. שימוש pipettor רב-ערוצי כדי µL 100 צלחת של תאים לכל טוב לתוך סיבוב 96-ובכן הצלחת התחתונה תרביות רקמה. בדרך כלל, צלחת 15 בארות בדיקה triplicate של 4 Ag ריכוז והפניה אין Ag-
  4. לדלל את Ag ב TCM בריכוזים שונים, µg בדרך כלל 80, 20, 5, 1 ו- 0/mL (עבור מניות x 2). להוסיף 100 µL ריכוז כל דולר עבור ריכוז סופי של 40, 10, 2.5. 0.5, 0 µg/mL. תקופת דגירה של 72 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: צעדים 3.5 דרך 3.7 כרוכה בחומרים רדיואקטיביים. שימוש נאות במשאבי, ניטור וסילוק של חומרים רדיואקטיביים יש לנהל, לפי תקנות ממשלתיות המוסדיות.
  5. להכין פתרון מלאי עבודה של 3 H-תימידין (40 µCi/mL) על ידי הוספת mCi 1 3 H-תימידין 25 מ ל RPMI, ולאחסן את זה ב-4 ° C. Pipet 0.5 מ"ל של הפתרון עובד לתוך שוקת סטרילי.
  6. להוסיף 25 µL של 3 H-תימידין (1 µCi) לכל שימוש טוב של pipet רב-ערוצי. תקופת דגירה של h 18 נוספים 37 מעלות צלזיוס.
  7. קציר תאים על גבי שטיחון מסנן זכוכית באמצעות קומביין תא 96-ובכן ולשטוף עם 70% אתנול. לאחר הייבוש, חותם על המזרן מסנן לתוך שקית פלסטיק מדגם עם נצנוץ מ ל נוזל. מדד רדיואקטיביות כל טוב באמצעות מונה נצנוץ.

4. Flow Cytometry ניתוח תא השטח TCR Vβ ביטוי

הערה: זה ממשיך בסעיף 2.6. נוגדנים עבור העכבר TCR Vβ 2, 3, 4, 5.1 ו- 5.2, 6, 7, 8.1, 8.2, 8.3, 9, 10 ב, 11, 12, 13, 14, ו 17a זמינים מסחרית לבדיקת הביטוי TCR Vβ.

  1. גילוי של TCR Vβ, לסלק תאים T מהצלחת תרבות על-ידי pipetting מספר פעמים ולהעביר תאים לרכבת התחתית.
  2. לשטוף עם FACS מאגר (פנסיון מלא) המכיל 2% FBS, אזיד הנתרן 0.1% ו- 2 מ מ EDTA ב- PBS.
  3. העברת תאים צלחת V-התחתון 96-ובכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 5 3 x 10 6 תאים לכל טוב. אם כל הלוח. Vβ נבחנת, התאים יופצו לתוך בארות מרובים (באר אחת לכל Vβ הנבדקת).
  4. הכללת תאים מתים מניתוח תזרים cytometric על ידי צביעת עם צבע הכדאיות חי/מת, אשר מגיב אמינים חינם שנחשפו על ידי תאים עם נמק. בצע את היצרן ' s הנחיות צנטריפוגה, resuspension, צבען הכדאיות. דגירה על קרח במשך 10-20 דקות ברחבי התא מכתים הליכים, להגן על תאים מפני אור ולשמור על קרח
  5. לאחר דגירה, לשטוף את הצלחת פעם אחת ב- FB. כדי לזהות TCR Vβ, להשעות את התאים µL 100 של פנסיון מלא המכיל לדילול מטריים נוגדנים עבור CD4 (לשבט RM4-5) ו TCR Vβ. תקופת דגירה של 15-60 דקות על קרח
  6. לשטוף את הצלחת פעם אחת ב- FB ולתקן את התאים על-ידי הוספת µL 200 של 4% paraformaldehyde מדולל ב- PBS. תקופת דגירה של 20 דקות על קרח. לשטוף את הצלחת ב FB ולנתח על ידי cytometry זרימה.

5. זרימה Cytometric ניתוח לייצור ציטוקין תאיים

  1. עבור ציטוקין תאיים מכתים (ICS), מתייחסים תרביות תאים T לדילול 1:1,000 חלבון התחבורה מעכב ריאגנט (למשל, GolgiPlug) ב- TCM, 4 שעות לפני ICS כדי למנוע הפרשת ציטוקינים. באותו הזמן, להפעיל את תאי T עם 50 ננוגרם למ"ל phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ו 500 ננוגרם למ"ל ionomycin וכדי לעודד ייצור החלבון.
  2. לאחר 4 שעות של תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, מכך התאים מהצלחת תרבות על-ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהעביר שפופרת צנטרפוגה (15 או 50 מ"ל).
  3. כביסה עם פנסיון מלא. Resuspend התאים ב- FB והעברתן ל צלחת V-התחתון 96-ובכן-צפיפות של 5 x 10 5 3 x 10 6 תאים לכל טוב.
  4. הכתם תאים עם צבע הכדאיות כפי שתואר לעיל (סעיף 4.2). לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת פעם אחת ב- FB.
  5. להוסיף נוגדנים לצורך זיהוי סמנים משטח כדלקמן:
    1. לצורך זיהוי סמני פני השטח, להשעות את התאים µL 100 של FB המכילה לדילול מטריים נוגדן CD4 (לשבט RM4-5).
    2. כוללים באופן אופציונלי, נוגדנים עבור B220 (כפיל 30-F11) ו CD11b (שיבוט M1/70)-לדילול בטחונות כדי לשפר את דרך השער של תאי B, ומונוציטים/מקרופאגים, בהתאמה. באופן כללי, PE-Cy7 anti-CD4, FITC אנטי-B220 ו- PerCP-Cy5.5 אנטי-CD11b עובד טוב. הבחירה של נוגדן/fluorochrome conjugates צריך להיות מונחה על ידי קביעת התצורה של זרימת cytometer כדי לשמש לניתוח, ריכוז אופטימלי של נוגדנים צריך להיות נחוש מדעית.
    3. תקופת דגירה של 15-60 דקות על קרח
  6. Resuspend תאי µL 200 של קיבעון/Permeabilization פתרון עבור 20 דקות על הקרח וקונטה לצלחת עם פנסיון מלא. זה לתקן את התאים, permeabilize את הממברנות.
  7. על מנת לשמור על permeabilization של קרום התא במהלך ההכתמה תאיים, השתמש פרם/שטיפת מאגר (PW) (מדולל 1:10 מן המלאי X 10) במקום פנסיון מלא. לשטוף את בארות µL 200 של PW.
  8. עבור ICS, להתכונן לדילול מטריים הנוגדנים אינטרפרון (IFN)-γ ו- IL-17A באמצעות 1 x PW. אפשרות אחת היא APC אנטי-IFN-γ (שיבוט XMG1.2) ו- PE אנטי-IL-17A (שיבוט eBio17B7) אשר עובד היטב. Resuspend תאים µL 100 של הנוגדן תאיים קוקטייל, ואז תקופת דגירה של פחות 15 דקות. זה גם אפשרי להמשיך ההכתמה בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס
  9. לשטוף את בארות µL 200 של PW resuspension ב FB עבור cytometry זרימה.
  10. במקביל, מכינים דוגמה וללא רבב (תאים ב- FB ללא נוגדנים) כדי למטב את המתחים גלאי ודוגמאות שהוכתמו יחיד עבור כל fluorochrome בודדים (קרי, תאים או פיצוי חרוזים צבעונית עם נוגדן אחד בלבד/fluorochrome) כדי לקבוע פיצוי והתאמת הערכים.
  11. באמצעות cytometer של זרימה, לרכוש ≥ 10,000 תאים (אירועים), gating על CD4 (חי/מת-שלילי) בת קיימא + תאים. כדי להבטיח gating מדויק של תאי T, לא לכלול את B220 +, CD11b + תאים (תאי B ו ומונוציטים/מקרופאגים, בהתאמה). בתוך CD4 + T תא subpopulation, לקבוע את אחוזי תאים IFN-γ (Th1 היוחסין) או איל-17A (Th17 היוחסין).

6. המאמצים תאים העברה של פתוגניים T ספציפי AQP4

הערה: שלב זה בעקבות סעיף 2.5: קיטוב תא T תרבות, proinflammatory תא T.

  1. תאים לשחזר מקוטב מבאר-12 צלחות על-ידי pipetting למעלה ולמטה מכך ולאחר העברת צינור 50 מ. אמאintain על הקרח עד זריקות.
  2. לספור את התאים, לשטוף פעמיים ב- PBS קר והכן השעיה של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ב- PBS. באופן כללי, מזריקים תאים בתוך השעה.
  3. בעדינות לערבב את התאים על ידי מתערבל ולהעביר מזרק 1 מ"ל בזמנו של הזרקה. ניהול µL 200 של התאים (2 x 10 7) דרך הווריד (עירוי) העכבר כל אחד, דרך הזנב הווריד.
  4. להזריק כל של העכבר הנמען i.p. עם 200 ng של שעלת דרב רעלן מעורבבת עם µL 200 ל- PBS באותו היום, יומיים לאחר מכן. לפקח על עכברים מדי יום עבור סימנים של מחלה.

7. הערכה קלינית של ATCA

  1. לבחון עכברים הנמען מדי יום עבור סימנים קליניים של CNS מחלת חיסון עצמי. באופן כללי, עכברים יראה סימנים של מחלת חיסון עצמי CNS 5-8 ימים לאחר העברה המאמצת של תאי T AQP4 ספציפיים. העכברים יציג סימפטומים קליניים של חוסר תפקוד נוירולוגי. זה עוזר לבצע ההערכות על עכבר תמים כדי להגדיר את היכולת הרגילה של עכבר.
    2. צליל
  2. עכברים הערך עבור אובדן של הזנב. החזק בעדינות את העכברים בבסיס הזנב והרם זקוף. זנב כי משתפלת ברציפות הוא לתאר אובדן של הזנב טון (ציון של 1). אובדן של הזנב הטון לעתים קרובות הסימן הראשון של המחלה הקלינית.
    3. רפלקס
  3. מבחן עבור ליישר על-ידי הנחת העכבר על גבו על משטח שטוח. איטי בטעותו הוא סימן של חוסר קואורדינציה truncal (ציון של 2). עכבר תמים לחלוטין לעמוד כל ניסיון למקם אותו על גבו, אז בשום איטיות ביכולת נכון הוא הבקיע כמו תפקוד לקוי. זה אופייני כדי לבדוק את העכבר 3 - 4 פעמים בשביל זה רפלקס.
  4. הערך יציבה, ambulation. עכברים מתחילים להראות שינוי בתנוחה וכתוצאה מכך פגיעה או גרירה של הירכיים במהלך ambulation (ציון של 2.5). עוד תוצאות המחלה monoplegia, שיתוק מוחלט של אחד הינד האיבר (ציון של 3.0), שיתוק גפיים, שיתוק מלא של שני הינד בגפיים (ציון של 3.5). Quadraparesis מתון, חולשה של כל ארבעת הגפיים, התוצאות בתנועה קדימה באיטיות (ציון של 4). Quadraparesis חמורה מאפשר כמעט אין תנועה קדימה (ציון של 4.5). לבסוף, עם מחלה קשה הם עשויים להפוך אדעך או למות (ציון של 5).
  5. מנהל לעכברים לאבד את היכולת לרכוש מזון נוזל או מוצק 1 מ"ל של 5% גלוקוז ב- saline i.p.. לחלופין, השתמש תוספי עם נוזל ג'ל כוסות, גבוהה הקלוריות ג'ל ובייקון רגשות כדי לנטרל התייבשות, מניעת מזון. המתת חסד עכברים אדעך.

8. היסטולוגיה והכנה רקמת

  1. עזים ומתנגד עכברים עם קטמין 100 מ"ג/ק"ג ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים ולאחר מכן להצמיד לו כל טביעות רגל לקרש חיתוך.
  2. פתח את החזה, לחשוף את הלב. פצעים וחתכים הכבד להתיר תזרים דם. לצרף מחט פרפר הצנרת של משאבת מהירות משתנה miniflow באמצעות מאגר נפרד עבור פורמלין PBS ו 10%. הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי של הלב, perfuse עם 5 מ של PBS, ואחריו 25 מיליליטר 10% פורמלין.
  3. להסיר את הראש ואז העיניים. הרשתית כפי שתואר לעיל 20 והעיניים תהליכים. חצו ארובות העיניים, להוסיף מספריים על האף, לחתוך את הגולגולת והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה בכל צד.
    1. אסיר את הגולגולת, לחשוף את העצבים האופטים, לחתוך הצנטר, הכנס קלטת בין 2 מזרוני הספוג הרגילים.
    2. Immerse ב 10% פורמלין (24 שעות), ואת ואז 50% אתנול (24 שעות) ואז העברת אתנול 70%-
  4. להסיר את המוח וחוט השדרה ומניחים בפורמלין 10%. באופן סדרתי סעיף המוח במישור הילתית; סעיף מה בתוך הווריד (בערך חצי) ואת טורי הפרונטליים מטוסים (כ 20 חתכים לכל עכבר).
  5. דגימות CNS תהליך שגרתי להטבעת פרפין. כתם 8 מיקרומטר מקטעים עבה עם hematoxylin ו אאוזין (העצבים האופטים) או Luxol מהיר כחול-hematoxylin אאוזין (המוח ועמוד השדרה).
  6. להעריך את העצבים האופטים לנוכחות של דלקת בתוך העצב, קרומי המוח שמסביב (לדלקת בעצה הראייה) או בעיקר בכל קרומי המוח שמסביב (perineuritis סיב אופטי).
  7. נחשב של קרום המוח, parenchymal מוקדים דלקתיים (> 10 תאים תאי באשכולות) הדגימות המוח וחוט השדרה עבור כל עכבר.

9. אין ויוו ברשתית הדמיה על ידי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר)

הערה: הדמיה ברשתית OCT בתחום ספקטרלי של עכברים מתבצע באמצעות ציוד מסחרי (למשל, Spectralis עם TruTrack עין המעקב) כדי להשיג את העינים עקבי התמצאות להפחית לכלוכים תנועה-

  1. חמש דקות לפני הדמיה, להתרחב תלמידים עם 1% tropicamide (טיפה אחת לכל עין) והניחו העכבר לדימות בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה, מתן זרימה קבועה של 2 ליטר מינימום (1.5% איזופלוריין). להפעיל את השטיח חום ולהכין בכלובי ההתאוששות שלאחר ההרדמה.
  2. במקום בעכבר על הגליל הדמיה ולנתב מחדש את הזרימה הרדמה בהתאם. להגן על העיניים עם methylcellulose hydroxypropyl 0.3% כדי לשמור על לחות העין, כדי להבטיח המשכיות שבירה. במקום עדשות מגע מותאם אישית על העין כדי להיבדק.
  3. מודרך על ידי לתמונה הפונדוס אינפרא-אדום, לכוון את הלייזר לעין, המבטיח הקרן ממורכזת על ראש עצב הראייה. סריקות OCT אופקיים ואנכיים עליך לוודא כי הרשתית מטילה בניצב כדי הלייזר.
  4. 25 לבצע סריקות B ברסטר מ-30 ומצב ברזולוציה גבוהה בממוצע סריקות A.
  5. לאחר הדמיה בשתי העיניים, להסיר את עדשות המגע ולהחיל אופטלמולוגיות ג'ל. להשאיר את העכבר לכלוב. שחזור חמים.

10. עיבוד וניתוח של OCT

  1. להשתמש את מודולרי הדמיה תוכנה עבור פילוח אוטומטיות.
    1. מקטעים ידנית הנכון המתאים הפנימיות הגבלת ממברנה (ILM), השכבה הפנימית plexiform (IPL), המייצג את הגבולות של הרשתית הפנימי שכבות (IRL) 21-
    2. ודא בשכבת סיבי עצב ברשתית (RNFL), השכבה תא גנגליון (שזכתה) שיקוב של IRL, לא יחפפו.
  2. בעוביים IRL לחשב באמצעות הרשת 2 בתחילת טיפול סוכרתי רטינופתיה המחקר (ETDRS) עם קטרים של 1, 2 ו- 3 מ מ ממורכז על דיסקים אופטיים, ו ייצוא לקובץ הגיליון האלקטרוני. התוכנה מחשבת עובי של כל אחת מהשכבות הרשתית על ידי חישוב ממוצע בכל מגזר רשת. לכן, קטע מרכזי, המקביל בראש עצב הראייה, הוא נשלל.
  3. ניתוח סטטיסטי הבדלים בין הקבוצות בכל נקודה בזמן. ניתוח בשתי העיניים עבור כל עכבר, באמצעות מוכללת הערכת משוואות עם מטריצת מתאם להחלפה והתאמות מתאמים בין העין אינטרה-הנושא 21-

תוצאות

ב פרוטוקול זה, השתמשנו באפשרות התורם T תאים עכברים- / - C57BL/6 AQP4. התחסנות תת עורית של אלו עכברים עם AQP4 p135-153 או p201-220, להכיל פתוגניים תא T epitopes, elicited תא T proliferative חזקה תגובות ניקוז הלימפה (איור 1), ואילו אלה שני פפטידים המושרה תא T חלשה יותר התפשטות בעכברים WT. לשם השוואה, חיסון AQP4 p91-110, המכיל פתוגניים שאינם AQP4 T תא הקובע13א, או ש א p35-55, פפטיד המיאלין שמפעיל בתאי T הגורמות ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE)22,23 ,24, המושרה בסדר גודל דומה של תא T התפשטות AQP4- / - ועכברים WT. ניתוח TCR הניצול על ידי צביעת cytometry זרימה של Vβ בודדים או משפחות Vβ, הדגימו כי p135-153-p201-220-ספציפיים או T תאים AQP4- / - עכברים מנוצל repertoires TCR ייחודי. סלקטיבי hyper-התפשטות של AQP4 p135-153, p201-220 עכברים- / - AQP4, כמו גם ניצול TCR ייחודי (איור 2), ציין כי התגובות האלה גורמים פתוגניים תא T בדרך כלל מוסדר על ידי שלילי הרתי מבחר, דבר המלמד את החשיבות של שימוש AQP4- / - תורם T תאים של פרוטוקול זה.

לפני העברת המאמצת עבור אינדוקציה של ATCA, תאים בלוטת לימפה AQP4 פפטיד-איפה זה מונח עכברים היו תרבותי במבחנה בתנאים קיטוב Th17 או Th1 במשך שלושה ימים. במידה של קיטוב של התורם CD4+ T תאים היה אושר על ידי ציטוקינים תאיים מכתים (ICS), נמדדת cytometry זרימה (איור 3). עכברים הנמען תמים הוזרקו לווריד 2 x 107 התורם AQP4 פפטיד ספציפי בתאי T. לאחר כ- 6 ימים, כמעט 100% של עכברים הנמען פיתח סימנים קליניים של מחלות אוטואימוניות מערכת העצבים המרכזית, כולל שיתוק זנב ואיברים הינד רפויה (איור 4). מקוטב Th17 תאי T ספציפי AQP4 המושרה מחלה חמורה יותר מאשר בתאי T ספציפי AQP4 מקוטב-Th1. עכבר נציג זה התקבל Th17 AQP4-פפטיד-ספציפי ופיתח הגפיים האחוריות מלאה שיתוק (paraplegia) מוצג 1 וידאו. לעומת עכברים שהתפתח EAE לאחר מתן של תאים ספציפיים ש א Th17, עכברים הנמען התאוששה מחלה הנגרמת על ידי תאים ספציפיים AQP4 Th17. באשר EAE הנגרם על ידי תאים Th17 p35-55-ספציפיים ש א, מחלה הנגרמת על ידי AQP4 p135 153-ספציפי או תאים Th17 p201-220-ספציפי היה קשור עם חדירה של תאי תאי מערכת העצבים המרכזית parenchyma, קרומי המוח (איור 5). נגעים היו יותר בשפע קרומי המוח מאשר ב- parenchyma עבור מחלת חיסון עצמי CNS הנגרם על ידי תאים ספציפיים AQP4 Th17.

עצב הראייה מעורבות הודגם על ידי הערכה היסטולוגית, על ידי טורי באוקטובר AQP4 ספציפיים, ש א ספציפי Th17 תאים הן דלקת עצב הראייה המושרה, אשר היה מאופיין על ידי נוכחות של תאים תאי. ואילו תאים ספציפיים AQP4 Th17 גרם perineuritis סיב אופטי, תאים ספציפיים ש א Th17 המושרה לדלקת בעצה הראייה קשים (איור 5). באמצעות OCT טורי, דלקת עצב הראייה היה ניכר על ידי נפיחות, גדל עובי השכבה הפנימית ברשתית (IRL) עבור מחלה הנגרמת על ידי AQP4 ספציפי או תאים ספציפיים ש א Th17 (איור 6). עבור. מחלת חיסון, AQP4 Th17-induced CNS עצמי-עובי IRL חזר בסיסית כמו עכברי התאוששה מחלה קלינית. לעומת זאת, ההתמדה של EAE שנגזרות ש א ספציפי Th17 התכתב עם IRL דליל, הפגנו קודם לכן17, היה מזוהה עם אובדן תאי גנגליון.

figure-results-1
איור 1 : AQP4 p135-153, p201-220 להפיק חזקים תא T התפשטות עכברים- / - AQP4, אך לא WT עכברים. עכברים היו לחסן ספורטינג עם פפטידים המצוין פרנק. עשרה ימים לאחר מכן, בלוטות הלימפה, הבדלקינו תרבותי ואז גם אין אנטיגן, או את פפטיד המשמש עבור חיסונים. התפשטות נמדדה על ידי 3H-תימידין ההתאגדות (זאת אומרת ± SEM, נציג של ניסויים 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2 : תאי T ספציפי AQP4 מ- AQP4- / - עכברים לנצל ייחודי TCR repertoires. AQP4- / - ועכברים WT היו חיסון עם פפטידים המצוין. עשרה ימים לאחר מכן, בלוטות הלימפה הבדלקינו תרבותי עם פפטיד המשמש עבור חיסונים. תאים נבצרו. ניצול TCR Vβ נותחה על ידי cytometry זרימה (זאת אומרת ± SEM, n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3 : Proinflammatory קיטוב תאי התורם T ספציפי AQP4. אחד עשר ימים לאחר חיסון עם AQP4 p135-153 או p201-220, הלימפה התאים היו שנקטפו, תרבותי עם פפטיד המשמש עבור חיסונים בתנאים שאינם מקטב, תנאים מקטב Th1 או Th17. קיטוב Th17 או Th1 נבדק על ידי ICS וזרימה cytometry IL-17 או IFN-γ, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4 : תאי T ספציפי AQP4 מקוטב Th17 לגרום לשיתוק בעכברים הנמען WT. עכברים הנמען WT קיבל 2 x 107 התורם מקוטב-Th17 AQP4 p135-153 או תאי T p201-220-ספציפי עכברים- / - AQP4. מקוטב Th17 תאי T ספציפיים ש א שימש פקד חיובי. התוצאות הן נציג של ניסויים 8 (n = 5/קבוצה). * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5
איור 5 : תאים ספציפיים AQP4 Th17 לגרום דלקת opticospinal בעכברים WT. עכברים הנמען קיבל 2 x 107 התורם Th17 AQP4 p135-153 - או p201-220-טענתי Th17 תאים AQP4- / - עכברים או ש א Th17 p35-55-ספציפי בתאים, הוקרבו 10 ימים לאחר מכן. רקמות חוט השדרה, עצב הראייה היו מוכנים, מוכתם H & E/LFB להעריך ראיות של דלקת demyelination, בהתאמה. התוצאות הן נציג של עכברים 5/קבוצה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6
איור 6 : דלקת עצב הראייה הנגרם על ידי תאים ספציפיים AQP4 Th17 ניתן יהיה פיקוח על ידי אוקטובר ברשתית האורך עכברים הנמען WT קיבלו 2 x 107 התורם מקוטב-Th17 AQP4 p201-220-ספציפי או תאי T p35-55-ספציפיים ש א ביום 0. הם נבדקו על-ידי OCT ביום 0 (לפני ניהול של תאי T) ולאחר מכן, ב ימים 4, 7, 8, 9, 10, 11 14 ו- 21. עובי IRL היה נמדד (זאת אומרת ± SEM). נתונים סטטיסטיים מצביעים על השוואה עם שליטה תמים. התוצאות הן נציג של 3 ניסויים (5 עכברים/קבוצה). * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

AQP4 זוהה המטרה העיקרית ב- NMO אג ב- 20053. . אז, זה הוכר שיהיה זה חשוב לציין, ממוקדות AQP4 במודל חיה של CNS מחלת חיסון עצמי. מודל כזה יכול להיות שימושי כדי לחקור כיצד תאים ספציפיים AQP4 T ו- B להשתתף התפתחות מחלת חיסון עצמי CNS, כדי לבדוק את המועמד הרפוי NMO. למרות זיהוי של תא T ספציפי AQP4 epitopes בעכברים פראי-סוג דווחה לראשונה ב- 201013, תאי T להגיב epitopes האלה לא גרמו מחלה קלינית או היסטולוגית14,17. חוסר היכולת ליצור מודל של מערכת העצבים המרכזית מחלת חיסון עצמי המבוסס על תגובתיות מערכת החיסון כדי AQP4 נותרה תעלומה עד 2015 כאשר ג'ונס, et al. 25 גילה כי תורם AQP4 p135-153-בשלה ' T תאים של עכברים- / - AQP4 מסוגל לגרום סימנים קליניים היסטולוגיים של מחלת חיסון עצמי CNS בעכברים WT. עניין, AQP4 p135-153 הוא חזה כדי לאגד MHC II (-Ab) עם זיקה גבוהה17. אחד בלבד אחרים AQP4 חומצת אמינו רצף, 201-220, הוא חזה כדי לאגד-Ab עם זיקה גבוהה דומה. אכן, הבחנו כי AQP4 p135-153, p201-220 שני להפיק התפשטות חזקה ב- AQP4- / -, אבל לא WT, עכברים. כאן, אנחנו הראו איך אחד יכול לבודד ולהרחיב encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - ו p201-220-תגובתי בתאי T של עכברים- / - AQP4. בעת העברת לתוך עכברים הנמען WT, תאים Th17 AQP4-תגובתי התורם המושרה שיתוק, אשר לוותה תא תאי תסנין חוט השדרה, עצב הראייה. מערכת הראייה מביא הפציעה ידועה אצל חולים עם NMOSD AQP4-seropositive26. . הנה, הבחנו כי דלקת עצב הראייה הנגרם על ידי תאים AQP4-תגובתי ו- Th17 ש א-תגובתי הייתה ברורה. ואילו תאים ספציפיים AQP4 Th17 המושרה perineuritis סיב אופטי, תאים ספציפיים ש א Th17 המושרה חמור לדלקת בעצה הראייה. גם תארנו של טכניקות השתמשו כדי לפקח על דלקת עצב הראייה הנגרם על ידי תאים ספציפיים AQP4 ו- T ספציפיים ש א על-ידי OCT טורי. חוקרים אחרים כעת אמור להיות מסוגל ליישם את הפרוטוקולים המתוארים כאן כדי לקדם את המחקרים שלהם עצמם התמקדו פתוגניים מנגנוני ATCA.

אפשר בקלות להימנע ממלכודות הפוטנציאל שלושה בפרוטוקול שלנו. הראשון, המאמצת בהעברת ATCA דורש שימוש בתאי T ספציפי AQP4 מ- AQP4- / - תורם עכברים. באופן ספציפי, התורם WT AQP4 p135-153-ספציפי T תאים לא גרמה ATCA בעכברים WT הנמען. שנית, חשוב לבצע "מים-מבחן" עם טיפת האמולסיה פפטיד/פרנק לפני חיסון של עכברים- / - AQP4 (פרוטוקול שלב 1.5). צריך האמולסיה לא תתפזרו במים כאשר הוא מתאים הזרקת ספורטינג. אם האמולסיה מפזר, אחד צריך לערבב האמולסיה פעם נוספת, שוב. תירגע, חזור על המים-המבחן. לבסוף, תאי T אנטיגן ספציפי מופעל התורם CNS לגרום מחלת חיסון עצמי CNS באופן יעיל יותר נח בתאי T. אחד עליך לפקח באופן חזותי התרבויות במיקרוסקופ אור לפני הקטיף תאי T התורם להעברת המאמצת. במהירות חלוקת תאים עשויים בצורת אשכולות, המורכבים מזוהים בקלות. כמו כן, כאשר תרבויות מכילות רבים ותאי T מופעל, התקשורת שינוי מיגדרי מורוד כתום או אפילו צהוב, עקב ירידה ב- pH. אחד גם יכול להעריך הפעלה של התורם AQP4-איפה זה מונח לימפה הצומת T תאים עבור הפצה על ידי 3H-תימידין התאגדות, כמתואר בשלב 3 פרוטוקול.

התגלית שלנו כי שני פתוגניים AQP4 T תא epitopes (1) צפויים לאגד MHC II עם זיקה גבוהה, (2) להפיק התגובות המקדימות חזק AQP4- / -, אבל לא WT, עכברים מציע כי בתאי T מיקוד גורמים אלה הם בדרך כלל נשלט על ידי בחירה שלילי הרתי17. Repertoires TCR מנוצל עבור זיהוי של AQP4 p135-153, p201-220 בעכברים- / - AQP4 הם ייחודיים (איור 2), וזה מתאים גם עם מחיקת המשובטים מתווכת על ידי תאים אפיתל מדולרי הרתי. מנגנונים tolerogenic אחרים עשויים בדרך כלל לרסן את תגובות מערכת החיסון כדי AQP4. לאחר הדיווח הראשוני שלנו17, קבוצה נוספת גם הדגימו כי AQP4 p201-220 מכיל encephalitogenic של תא T הקובע27. כאשר α/β (TCRα- / -) לקויה תא T עכברים היו מחדש עם AQP4- / - CD4+ T תאים, ניתן היה להפיק תשובה תא T encephalitogenic AQP4 ספציפי, אבל לא ספציפית AQP4 ההורמונאלית מענה, רומז ב WT עכברים ספציפי AQP4 תא B תגובות, הדומה AQP4 ספציפי תא T תגובות, כפופים הבחירה שלילי. אכן, אובדן של חוט השדרה אקסונים ו RGCs, אשר לא נצפתה ב WT עכברים עם ATCA הנגרם על ידי תאי T ספציפי AQP4 לבד, עשוי לדרוש השתתפות של נוגדנים ספציפיים AQP4 פתוגניים. ברור כי העכבר מודלים של מחלת חיסון עצמי, ממוקדות AQP4 CNS תמשיך להתפתח כאשר אנחנו לומדים יותר לגבי המנגנונים tolerogenic בדרך כלל שליטה חסינות ספציפי AQP4 תא T ו- B cell.

מודלים אחרים של מחלת חיסון עצמי, ממוקדות AQP4 CNS מתבצעת גם מפותחת6,16,28,29,30. כל אחד יכול להציע יתרונות לימוד היבטים מסוימים הנוגעים NMO פתוגנזה. תאי T ספציפי AQP4 זוהו WT חולדות6,16,29. תאי T ספציפי AQP4 האלה גרמו שינויים היסטולוגית של CNS מחלת חיסון עצמי, אבל, בדומה תצפיות בעכברים, תאי T ספציפי AQP4 חולדה WT אינם גורמים סימני מחלה. לכן, מנגנוני עמידות הגבלת תא T ו B תאים ספציפיים AQP4 תגובות מערכת החיסון בעכברים WT פעילים גם בחולדות. בכל מקרה, אחד שכדאי להמעיט את הכוח באמצעות העכבר מודלים לימוד מנגנונים מעורבים בפתוגנזה של המחלה. העושר של הנוק-אאוט, הטרנסגניים ועכברים כתב יכול להיות יתרון. זה צריך גם להיות מוכר כי מספר תגליות בסיסיות במחלת חיסון עצמי נעשו באמצעות העכבר EAE מודלים. לדוגמה, הפגנה שתא T שיבוטים ספציפיות עבור אנטיגן עצמי יכול לתווך31,מחלות אוטואימוניות32, זיהוי של תפקידו של תא T costimulation ב מחלת חיסון עצמי33 הגילוי מסלול התפתחותי עבור בידול Th1734 שתוארו קודם באמצעות העכבר EAE מודלים. באמצעות העכבר בדגם ATCA שרכשנו, עכשיו יש את האמצעים ללמוד פיתוח ותקינה של תגובות חיסוניות AQP4 ספציפיים פתוגניים ויוו, אשר אמור לספק תובנות חשובות הקשורות NMO פתוגנזה.

גילויים

דרום אמריקה סייגן, א קרוס-Herranz, ספנסר C.M., הו P.P., ל' שטיינמן, איי ירוק ו ע ר סובול הדו ח אין גילויים. אס Zamvil הוא סגן עורך של נוירולוגיה, Neuroimmunology, Neuroinflammation , חבר הוועדה המייעצת של האגודה הבינלאומית של Neuroimmunology. הוא שימש חבר מערכת של כתב העת החקירה קליני, כתב העת לאימונולוגיה יומן למדעי נוירולוגיות, היה חבר ועדת ביקורת גרנט המכונים הלאומיים וי Neuroimmunology קליני לבריאות (NIH), גידולים במוח (CNBT) לומדים במקטע, החברה טרשת הלאומי (NMSS). יש לו שימש כיועץ והוא קיבל honoraria Biogen-איידק, EMD-סרונו, ג'נזיים, נוברטיס, רוש/Genentech ו טבע Pharmaceuticals, inc, שימש או מגישה בלוחות ניטור בטיחות נתונים עבור לילי, BioMS, טבע, Opexa הרפוי. כיום, ד ר Zamvil מקבל תמיכה מענק מחקר של NIH, NMSS, קרן Maisin, Biogen, Celgene.

תודות

העניקה תמיכה כדי S.S.Z. המכון הלאומי לבריאות (RO1 AI073737, NS092835-01-RO1), חברה לאומית טרשת (RG 4768, RG 5179 ו RG 5180), Maisin קרן, קרן הצדקה של ג'קסון Guthy.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
M. tuberculosis H37RaBD Difco231141Dessicated, killed M. tuberculosis
Incomplete Freund's AdjuvantBD Difco263910
AQP4 peptide p135-153Genemedרצף פפטיד סינתזה מותאם אישית: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN
AQP4 פפטיד p201-220של סינתזה מותאמת אישיתGenemed: HLFAINYTGASMNPARSFGP
MOG peptide p35-55סינתזה מותאמת אישיתשל Genemed / Auspep: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
תלת כיווני StopcockKimble420163-4503
HyClone סרום בקר עוברי (מאופיין)GE מדעי החיים של שירותי הבריאותSH30071
עכבר רקומביננטי IL-23מו"פ D Systems (BioTechne)1887-ML
עכבר רקומביננטי IL-6R& D Systems (BioTechne)406-ML
עכבר רקומביננטי IL-12R& D Systems (BioTechne)419-ML
תימידין [Methyl-3H]PerkinElmerNET027
מסנני סיבי זכוכיתPerkinElmer1450-421
נוגדנים נגד עכבריםeBioscience (Affymetrix)[שונים]
אנטי עכבר TCR Vβ פאנל הקרנהBD Biosciences557004
LIVE / DEAD כתם תאים מתים הניתן לתיקוןThermoFisher Scientific[שונים]
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15710
ערכת פתרון קיבוע/פרמיביליזציה עם GolgiPlugBD Biosciences555028
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139
Iomomycin (מלח סידן)Sigma-AldrichI0634
רעלן שעלת מ-B. pertussisList מעבדות ביולוגיות181
10% פורמליןVWR89370-094
משאבה פריסטלטית בזרימה משתנהפישר סיינטיפיק13-876-2
רפידות ביופסיה קצף, מלבניפישר סיינטיפיק22-038-221
איזותזיה (איזופלורן, USP)הנרי שיין לבריאות בעלי חיים050033NDC: 11695-0500-2
תמיסת עיניים טרופיקמיד, USP (1%)AkornNDC: 17478-102-12
פלטפורמת הדמיה אבחנתית ספקטרליסהיידלברג הנדסה
רצף פפטידים רצף פפטידים של

מקורות

  1. Hardy, T. A., et al. Atypical inflammatory demyelinating syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 15 (9), 967-981 (2016).
  2. Lennon, V. A., et al. A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis. Lancet. 364 (9451), 2106-2112 (2004).
  3. Lennon, V. A., Kryzer, T. J., Pittock, S. J., Verkman, A. S., Hinson, S. R. IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel. J Exp Med. 202 (4), 473-477 (2005).
  4. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), 62(2015).
  5. Bennett, J. L., et al. Intrathecal pathogenic anti-aquaporin-4 antibodies in early neuromyelitis optica. Ann Neurol. 66 (5), 617-629 (2009).
  6. Bradl, M., et al. Neuromyelitis optica: pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo. Ann Neurol. 66 (5), 630-643 (2009).
  7. Nurieva, R. I., Chung, Y. Understanding the development and function of T follicular helper cells. Cell Mol Immunol. 7 (3), 190-197 (2010).
  8. Lucchinetti, C. F., et al. The pathology of an autoimmune astrocytopathy: lessons learned from neuromyelitis optica. Brain Pathol. 24 (1), 83-97 (2014).
  9. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (4), 110(2015).
  10. Brum, D. G., et al. HLA-DRB association in neuromyelitis optica is different from that observed in multiple sclerosis. Mult Scler. 16 (1), 21-29 (2010).
  11. Varrin-Doyer, M., et al. Aquaporin 4-specific T cells in neuromyelitis optica exhibit a Th17 bias and recognize Clostridium ABC transporter. Ann Neurol. 72 (1), 53-64 (2012).
  12. Vaknin-Dembinsky, A., et al. T-cell responses to distinct AQP4 peptides in patients with neuromyelitis optica (NMO). Mult Scler Relat Disord. 6, 28-36 (2016).
  13. Nelson, P. A., et al. Immunodominant T cell determinants of aquaporin-4, the autoantigen associated with neuromyelitis optica. PLoS One. 5 (11), 15050(2010).
  14. Kalluri, S. R., et al. Functional characterization of aquaporin-4 specific T cells: towards a model for neuromyelitis optica. PLoS One. 6 (1), 16083(2011).
  15. Pohl, M., et al. Pathogenic T cell responses against aquaporin 4. Acta Neuropathol. 122 (1), 21-34 (2011).
  16. Zeka, B., et al. Highly encephalitogenic aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG jointly orchestrate lesion location and tissue damage in the CNS. Acta Neuropathol. 130 (6), 783-798 (2015).
  17. Sagan, S. A., et al. Tolerance checkpoint bypass permits emergence of pathogenic T cells to neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (51), 14781-14786 (2016).
  18. Vita, R., et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic Acids Res. 43, Database issue 405-412 (2015).
  19. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  20. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized protocol for retinal wholemount preparation for imaging and immunohistochemistry. J Vis Exp. (82), e51018(2013).
  21. Cruz-Herranz, A., et al. The APOSTEL recommendations for reporting quantitative optical coherence tomography studies. Neurology. 86 (24), 2303-2309 (2016).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur J Immunol. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  23. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).
  24. Molnarfi, N., et al. MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med. 210 (13), 2921-2937 (2013).
  25. Jones, M. V., Huang, H., Calabresi, P. A., Levy, M. Pathogenic aquaporin-4 reactive T cells are sufficient to induce mouse model of neuromyelitis optica. Acta Neuropathol Commun. 3, 28(2015).
  26. Oertel, F. C., et al. Microstructural visual system changes in AQP4-antiboby-seropositive NMOSD. Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm. 4, 72(2017).
  27. Vogel, A. L., et al. Deletional tolerance prevents AQP4 directed autoimmunity in mice. Eur J Immunol. , (2017).
  28. Zhang, H., Verkman, A. S. Longitudinally extensive NMO spinal cord pathology produced by passive transfer of NMO-IgG in mice lacking complement inhibitor CD59. J Autoimmun. 53, 67-77 (2014).
  29. Zeka, B., et al. Aquaporin 4-specific T cells and NMO-IgG cause primary retinal damage in experimental NMO/SD. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 82(2016).
  30. Felix, C. M., Levin, M. H., Verkman, A. S. Complement-independent retinal pathology produced by intravitreal injection of neuromyelitis optica immunoglobulin G. J Neuroinflammation. 13 (1), 275(2016).
  31. Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
  32. Zamvil, S. S., et al. Encephalitogenic T cell clones specific for myelin basic protein. An unusual bias in antigen recognition. J Exp Med. 162 (6), 2107-2124 (1985).
  33. Kuchroo, V. K., et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy. Cell. 80 (5), 707-718 (1995).
  34. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T 4Th17TAQP4 KnockoutB Pertussis

מאמרים קשורים