מחלות רבות סכנת חזון עינית משויכות לקוי microvessels ברשתית. לכן, המדידה של תגובות arteriole ברשתית הוא חשוב לחקור את המנגנונים הקשורים pathophysiological המשמש כבסיס. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בידוד arteriole רשתית העכבר והכנות כדי להעריך את ההשפעות של חומרים vasoactive על קוטר כלי הדם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שלבי הכנה מדידה של תגובתיות ב העכבר רבים ברשתית Vivo לשעבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
. אי ספיקת שינויים זלוף ברשתית נורמלי הם בין הגורמים העיקריים בפתוגנזה של סכנת הראייה עינית מחלות שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית, רטינופתיה יתר לחץ דם, ואולי גלאוקומה. לכן, ההכנות microvascular ברשתית הם כלים מרכזי עבור מחקרים פיזיולוגיים תרופתי על המנגנונים הקשורים pathophysiological כבסיס לעיצוב טיפולים עבור המחלות. למרות השימוש בעכבר מודלים במחקר אופטלמולוגיות רחב, מחקרים על תגובתיות כלי הדם ברשתית נדירים של מין זה. הסיבה הראשית לסתירה הזו היא ההליכים בידוד מאתגר בשל גודלו הקטן של אלו כלי דם ברשתית, אשר ~ ≤ 30 מיקרומטר בקוטר luminal. כדי לעקוף את הבעיה של בידוד ישיר של אלה microvessels ברשתית ללימודי פונקציונלי, הקמנו שיטת בידוד והכנות המאפשרת שמחוץ מחקרים של vasoactivity רשתית העכבר בתנאים ליד-פיזיולוגיים . למרות ההכנות ניסיוני נוכח באופן ספציפי יפנה אל רבים רשתית העכבר, מתודולוגיה זו יכול בקלות להיות מועסק כדי microvessels של חולדות.
מבוא
הפרעות ברשתית זלוף היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות עינית שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית, יתר לחץ דם רטינופתיה גלאוקומה1,2,3. לכן, מחקרים שמטרתם מדידה תגובתיות כלי הדם ברשתית חשוב להבין הפתופיזיולוגיה של מחלות אלו, לפתח טיפול חדש מתקרב.
בשל האפשרות של מניפולציה ג'ין הגנום מאתר, העכבר הפך מודל בעלי חיים בשימוש נרחב למחקרים של מערכת הלב וכלי דם4. עם זאת, בשל גודלו הקטן של כלי הדם ברשתית (≤ 30 מיקרומטר), מדידה של תגובתיות כלי הדם ברשתית העכבר הוא מאתגר. לדוגמה, טכניקות stereomicroscopic ויוו למדידה בו רזולוציה אופטית שלהם מוגבלים, לכן אפשר רק בדיוק לזהות שינויים בזרימת קוטר או דם בדם קטן של פחות מקוטר 30 מיקרומטר ≤ כאשר היא מצוידת נוספים התקנים מתוחכמים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות צבעי פלורסנט או אופטיקה אדפטיבית סריקה Ophthalmoscope אור5,6. יתר על כן, הפרשנות של ויוו מדידות שמטרתם זיהוי מקומי איתות מנגנונים בכלי הדם ברשתית יכולה להיות מבולבל על ידי הרדמה, משתנה לחץ דם סיסטמי, ההשפעה של כלי הדם retrobulbar.
לכן, פיתחנו שיטה למדידת תגובות של כלי הדם ברשתית עכבר עם רזולוציה אופטית גבוהה ex-vivo. הטכניקה שהוצגו במסמך זה מאפשר הדמיה של רבים ברשתית ויה ששודרו מיקרוסקופ אור. שיטה זו, אשר יכול לשמש גם בחולדות, מספקת גישה היתרונות של גן מיקוד הטכנולוגיה במחקר וסקולרית עינית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליכים ניסיוני של מחקר זה אושרו על ידי החיה טיפול הוועדה של ריינלנד-פאלץ, גרמניה. טיפול בבעלי חיים תאמו המוסדיים הנחיות ואת האגודה למחקר בהצהרת חזון, רפואת עיניים (ארוו) לשימוש בבעלי אופטלמולוגיות ומחקר חזון. חיות טופלו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי לניסויים בבעלי חיים. זכר C57BL/6J עכברים (מעבדה ג'קסון, בר הרבור, לי, ארה ב) בגילאי 3-4 חודשים שימשו את הניסויים. בעלי חיים שוכנו בתנאים סטנדרטיים (טמפרטורה 23 ± 2 ° C, לחות טווח 55 ± 10% ו- 12 h מחזורים/כהה), הייתה גישה העכבר הסטנדרטי צ'או ומים ad libitum.
1. בידוד של רשתית העכבר
- למקם את לנתיחה על השולחן הכנה ולבדוק אם כל המכשירים הם להשלים כדי לאפשר הכנה מהירה.
- להקריב את העכבר באמצעות אינהלציה2 CO.
- לערוף את העכבר עם מספריים פלדה, לחתוך את הגולגולת sagitally לשני חצאים באמצעות אותו זוג מספריים ולהסיר את העור ואת המוח באמצעות העין מספריים (איור 1).
- לחתוך עצם הגולגולת להשאיר רק את העצם מסלולית באמצעות מספריים העין.
- להעביר את מסלולו לתוך תבשיל לנתיחה המכיל מאגר קרבס-Henseleit קר כקרח.
- לשמור את המנה לנתיחה על קרח או לשנות את מאגר כל 10 דקות.
- לחתוך את העצם מסלולית באמצעות מספריים העין ולהסיר בעדינות את הגלובוס עין יחד עם הרקמה מסלולית באמצעות סוג 4 דיוק פינצטה ומספריים האביב סטודנט Vannas (איור 2).
- הסר בעדינות את בלוטת Harderian, רקמת השרירים extraocular באמצעות סוג 5 דיוק פינצטה ומספריים capsulotomy Vannas, דואג שלא יגרמו נזק הסניף הראשי של העורק אופטלמולוגיות.
- מאתרים ומפסיקים מסלולית ענפי עורק אופטלמולוגיות ובסופו של דבר הסוף הפרוקסימלית של הסניף הראשי של העורק אופטלמולוגיות בעזרת תפרים ניילון 10-0 (איור 3).
- העברת הגלובוס העין לתוך צלחת פטרי המכיל אתנול 70% עבור שימוש s 10 מסוג 4 דיוק פינצטה. מקום העולם העין בחזרה לתוך המנה לנתיחה והחלף את המאגר פתרון קרבס טריים. הקרנית יופיעו לבנבן לאחר חשיפה אתנול.
- לנקב את הקרנית היקפי עם מחט מד 30 ומנתחים את הקרנית באמצעות מספריים capsulotomy Vannas. בעדינות לחתוך את רקמת הקשתית, מקום אחד בחוד של המספריים capsulotomy Vannas בין הרשתית דמית העין ולנתק את דמית העין ואת sclera. להשאיר קצת הרקמה scleral סביב עצב הראייה (איור 4).
2. הרכבה הרשתית בבית הבליעה זלוף
הערה: תא זלוף המשמש עבור ניסויים arteriole ברשתית הוא תוצרת בית. זה מורכב של מאגר שקוף עם צינור-בו יצוא (איור 5). קצה אחד של צינור סיליקון מודבק לתחתית התא עם דבק histoacryl ואת הקצה השני מחובר של צימוד-כיוונית. התחבר המזרק המכיל מאגר קרבס טריים צימוד-כיוונית, ממלאים את הצינור עם מאגר.
- קח micropipette זכוכית עם בעל מחט ודחף לתוך בסוף הצינור בתחתית תא זלוף. אז שבור את הקצה של micropipette במספריים type 4 כדי לקבל טיפ של 100 מיקרומטר קוטר.
- פוקוס על קצה micropipette, לשטוף את זה דרך המזרק מחובר הצינור. תשמרי נימי הוא לא occluded על ידי פסולת. במקרה של סגר, להסיר אותו, לשטוף את הצנרור ולהוסיף עוד micropipette.
- למלא את התא זלוף מאגר קרבס קר ולשים את התא תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- המקום פלטפורמה פלסטיק שקוף אל החדר זלוף. פלטפורמה זו יש ההזחה של 1.8 מ"מ רוחב עצב הראייה, העורק אופטלמולוגית והיא מושם על שני חוטי פלדה של 1.6 מ"מ קוטר. אז, במקום טבעת מפלדת של 2.8 מ"מ קוטר פנימי ו- 4.0 מ"מ הקוטר החיצוני על הפלטפורמה.
- העברה הרשתית עם עצב הראייה, עורק אופטלמולוגיות המצורפת מן החדר ניתוח אל החדר זלוף בזהירות מרבית, באמצעות כף. השלב זה חשוב למנוע את הפוטנציאל מתיחה של הרקמות כפי שהוא יכול להיות מזיק הניסוי.
- לחתוך את החלק sutured של סוף הפרוקסימלית של העורק אופטלמולוגיות להציב שתי לולאות preformed של 10-0 תפר ניילון על גבי micropipette, נקרר את העורק אופטלמולוגיות עם micropipette. לקשור את העורק micropipette (איור 6) ומניחים על הרשתית על הפלטפורמה שקוף באמצעות פיין-נקודת-פינצטה.
- בעדינות כשהבנו את capsula עדשה קדמית עם שני הצבע בסדר פינצטה להוציא את העדשה, לחתוך את capsula העדשה כל שימוש microscissors.
- לאחר מכן, להכין ארבעה חתכים רדיאליים לתוך הרשתית חצי המרחק pars plana עצב הראייה ולמקם טבעת מפלדת על הרשתית כדי לתקן את זה לעומק. הרשתית עכשיו הוא מוכן לניסוי (איור 7).
3. הכנה של רבים ברשתית לניסוי.
- מקם את התא זלוף תחת מיקרוסקופ אור. המטרה היא עדשה המטרה 100 X טבילה במים.
- לחבר את שני tubings עבור - ו -out - flow משאבה pericyclic, הפיצו את התא באמצעות מאגר קרבס חמצן ב- 95% O2 ו מוגז עם 5% CO2 ב 37 º C. השתמש בקצב הזרימה בין 100 ל 120 מ לדקה.
- להתחבר ברכבת התחתית סיליקון, אשר מחובר של micropipette, מאגר סיליקון צינור דרך צימוד-כיוונית. לאחר מכן, מילוי המאגר עם מאגר קרבס לגובה המתאים ל-50 מ מ כספית אבל אל תפתח את צימוד-כיוונית עדיין.
- להסתכל דרך המטרות של מיקרוסקופ, להתמקד על פני הרשתית. לחפש כלי דם או כדוריות דם אדומות. זה אפשרי כי כלי הדם לחלוטין מכווצים, אז לפעמים רק שקצת כדוריות דם אדומות גלויים.
- כאשר כלי דם, להתמקד בו ופתח את צימוד-כיוונית. הקוטר של הכלי צריך להגדיל באופן מיידי, כדוריות דם אדומות לזוז גם centrifugally, אם זה arteriole, או centripetally במקרה של venule. רבים קטנים בקוטר בהשוואה venules באותו הסדר.
- ברגע נמצא כלי דם עם קיר גלוי. ובכן, זה יכול להיות מועסק לניסויים בעקבות תקופה equilibration של 30 דקות (איור 8). במהלך התקופה equilibration, רבים לפתח הטון מהותי החלשה היחידה וכתוצאה מכך פחות מ-10% של הפחתת קוטר luminal.
4. ביצוע הניסוי
- בדיקת הכדאיות של כלי עם thromboxane מימטי 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy פרוסטגלנדין F2α (U46619) על-ידי הוספת זה הפתרון אמבט. סוכן זה מכווץ רבים רשתית העכבר על ידי כ-50% מן נח קוטר בריכוזים של ≥ 10-6 מ'.
- פעם אחת כלי הקיבול הוא אישר קיימא, לשטוף אגוניסט מהאמבטיה מאת במחזור המשאבה והענק מאגר קרבס טריים לתוך האמבט.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
U-46619 מיוצר תגובות תלויי-ריכוז מצר את כלי הדם של הרשתית רבים עכברים פראי-סוג של רקע C57Bl/6J. ריכוז של 10-6 מ', ירידה בקוטר luminal היה ≈50% מ קוטר מנוחתו. איור 9 א מציג עקומת ריכוז נציג-תגובה של אחד arteriole ברשתית. ב רבים preconstricted עם U46619, ניהול המצטברת של אצטילכולין עורר מגביר ריכוז תלוית בקוטר luminal ל≈25% מ קוטר preconstricted ב- 10-5 מ', מעידה על (אנדותל כלי הדם ללא פגע איור 9B).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המדד של תגובות כלי הדם ברשתית העכבר הוא מאתגר בשל גודלו הקטן של כלי הדם ברשתית. עם הטכניקה שהוצגו, רבים ברשתית הם דמיינו ידי מיקרוסקופ אור המשודרת. זה אפשרי, כי הרשתית מבודד הוא שקוף למחצה. היתרון של השיטה הוא אופטי ברזולוציה גבוהה. הרזולוציה המרחבית מחושב הוא px 11/מיקרומטר. אולם, הפתרון האמיתי למערכת אופטית זו, העושה שימוש באור לבן הוא בין 200 עד 300 ננומטר, כפי שמוסבר על ידי הגבול עקיפה אבה. מאז הסניף הראשון של רבים רשתית העכבר יש של קוטר פנימי של 20-30 מיקרומטר, השינויים בקוטר של כ-1% הם לזיהוי במערכת זו. יש צורך של ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ארנסט und ברטה Grimmke Stiftung ואת בווריה Ophthalmologische דויטשה (הכלב).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מספריים פלדה | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 מ"מ |
| מספריים לעיניים | Geuder | G-19390 | 1x ישר, 10.5 ס"מ |
| פינצטה מדויקת, ישר עם טיפים עדינים | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x סוג 4 |
| פינצטה מדויקת, ישר עם טיפים עדינים במיוחד | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x סוג 5 |
| מספריים | קפסולוטומיה VannasGeuder | 19760 | 1x ישר, 77 מ"מ |
| סטודנט Vannas מספריים אביב | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x מעוקל, |
| Barraquer מחזיק מחט | Geuder | G-17500 | 1x מעוקל, 120 מ"מ |
| מחט | בקטון, דיקינסון ושות' | 305128 1x 30 גרם | |
| נימי זכוכית (לייצור מיקרופיפטות) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 מ"מ; קוטר חיצוני/פנימי) |
| תפר ניילון | אלקון | 198001 1x 10-0 | |
| צלחת תרבית תאי Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 מ"מ |
| קוטר צלחת תרבית תאי Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 מ"מ קוטר |
| דיסקופיקס C | בראון | 16500C | 10 ס"מ |
| היסטואקריל דבק | ב. בראון כירורגי, S.A. | 1050052 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>ציוד | |||
| משאבה פריציקלית (סייקלו השני) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| חולץ פיפטה אנכי דגם 700C | David Kopf מכשירים | 1x | |
| מיקרוסקופ (Vanox-T AH-2) | אולימפוס | 1x | |
| מטרת טבילה במים LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| מצלמה דיגיטלית (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| תא זלוף | מתוצרת | 1x | |
| name | Company | >Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| קליום כלוריד (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| קליום דימימן פוספט (KH<תת>2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| מגנזיום סולפט (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| נתרן מימן פחמתי (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- גלוקוז מונוהידראט | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | קיימן כימיקל | 16450 | |
| אצטילכולין כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | A6625-25G |
מקורות
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
