הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

סיכום

וידאו זה מציג את הליך ליצירת תרביות נוירונים מעובר מאוחר ועכבר מוקדם קליפת המוח לאחר הלידה. תרבויות אלו יכולים לשמש immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, סידן ונתרן הדמיה לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה לאחר הלידה הגן הקטלני.

תקציר

וידאו זה ידריך אותך בתהליך של יצירת תרביות נוירונים בקליפת המוח של העובר מאוחר ועכבר מוקדם המוח לאחר הלידה. בתרבויות אלה יכולים לשמש עבור מגוון של יישומים, כולל immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, הדמיה סידן, נתרן, חלבון / או RNA בבידוד. בתרבויות אלה גם לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה מאוחר עובריים או לאחר הלידה הגן הקטלני. ההליך הוא יחסית ישר קדימה, דורש קצת ניסיון טכניקה תרבות רקמות לא צריך לקחת יותר מ 2-3 שעות אם אתם מוכנים כראוי. הפרדה קפדנית של הקליפה קליפת המוח מתוך מערכת thalamo-קליפת המוח הסיבים יהיה להפחית את מספר הלא נוירונים תאים לא רצויים. כדי להגדיל את התשואות של תאים עצביים triturate את פיסות הרקמה קליפת המוח בעדינות אחרי שלב הדגירה האנזים. זה הכרחי שכן הוא מונע פגיעה מיותרת תאים מוקדמת מוות של תאים עצביים. מאחר תרבויות נשמרים בהעדר תאים מזין גליה, הם מציעים גם יתרון נוסף של תרבויות גדל מועשר בנוירונים.

פרוטוקול

הכנות לפני יום culturing:

• הכן פתרון לנתח סטרילי (DS).
• הכן NBM/B27 (Mediom Neurobasal עם תוספי B27).
• החיטוי DDH ₂ O ו לעקר coversilps זכוכית, במידת הצורך.
• רקמת סמל תרבות מנות או coverslips זכוכית עם פולי-D-ליזין.

Poly-D-ליזין ציפוי:

הכינו יום לפני culturing בתנאים סטריליים.

• הפשירי aliquot של PDL במקום 10X על קרח.
• הוסף 9 מ"ל סטרילי אולטרה מים מסוננים 1 מ"ל של PDL ומערבבים היטב (1X).
• מעיל משטחים עם PDL 1X לילה בטמפרטורת החדר כדלקמן:
  • זכוכית coverslips (חתול Bellco זכוכית, Inc # 1943-00012.): 75 μl / coverslip
    או
  • 24 תרבות צלחת היטב: 300 μl / טוב
    או
  • 35mm צלחת תרבות: 1ml/dish
• לשטוף עם מים סטריליים 5X (שימוש סטרילי pipettes פסטר כדי לשאוב נוזל).
• הסר מים עד משטח יבש לחלוטין.

הליך culturing (נעשה ברדס זרימה למינרית בתנאים סטריליים)

1. חותכים את גוש אגר ודבק אותו על לחסום את התמיכה של Vibraslicer microtome (Campden מכשירים בע"מ) באמצעות דבק סופר.
2. בעת שימוש עובריים בשלב מאוחר (E17-18) עוברים העכבר, סכר euthanise, להסיר את הרחם עוברים בודדים ללא שק עוברי. עוברים מקום לתוך צלחת פטרי סטרילית להמשיך כמתואר בהמשך.
3. לערוף את העובר עכבר או גור (הנחיות לעקוב אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים שלך ועדת השתמש).
4. הסרה של עור הגולגולת והמוח מקום על הדיסק נייר לסנן Whatman בצלחת פטרי 60mm מלא DS קר.
5. לנתק את המוח הקטן באמצעות סכין גילוח סטרילית.
6. תרימי המוח באמצעות מרית ומסננים נוזלים עודפים על נייר הסינון, ולאחר מכן להעביר המוח כדי לחסום תמיכה Vibraslicer והמוח דבק במקום (צד הזנב למעלה חלק הגחון מול אגר).
7. מלאו קאמרית עם DS קר. קבע בורר מהירות 8-9.
8. חותכים סעיפים 200-400 מיקרומטר, החל הנורה חוש הריח. לאחר להב Vibraslicer מזין את קליפת המוח, להתחיל לחתוך קטעים העטרה 600μm. המוח E17-18 העכבר בדרך כלל מניבה 3-4 פרוסות שמיש, בעוד המוח P0 עכבר התשואות 4-5 פרוסות שמיש.
9. העברת פרוסות המוח על צלחת פטרי 35 מ"מ שכותרתו DS 2 משתמש הקצה האחורי של בלתי פקוק 10 מ"ל pipet זכוכית פסטר.
10. לנתח את קליפת ולהסיר קרומי המוח באמצעות מחטים זכוכית משך משפופרות נימי.
11. חותכים קליפות קליפת המוח לחתיכות קטנות, 0.5-1 מ"מ אורך.
12. ES 0.2 מיקרומטר סינון דרך המסנן המחובר מזרק 5 סמ"ק לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ.
13. מעבירים את חתיכות רקמת קליפת המוח על צלחת פטרי המכילה ES מסונן.
14. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

בינתיים:

1. ניקוי, מכסה המנוע Vibraslicer כלים לנתח.
2. הוסף 5 מ"ל של NBM/B27 חם לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ.

אחרי 30 דקות. דגירה:

1. העברת רקמות DS 10 מ"ל. בואו להסתפק דקות 1.
2. העברת רקמות קודם במערבולות היי הצינור ולתת להסתפק 2-3 דקות.
3. העברה היי השני. חזור לעיל.
4. העברה Li הראשון. חזור לעיל.
5. העברה Li השני. חזור לעיל.
6. העברה Li השלישי. חזור לעיל.
7. העברת רקמות המנה 60 מ"מ עם התקשורת.

תחת מיקרוסקופ הניתוח:

1. פסולת נקי של רקמות triturate כל פיסת ידי בעדינות עובר pipet כוס משך (הפחתת שימוש בגדלים נשא) כדי לשחרר את הרקמה.
2. העברת ההשעיה התא צינור המכיל 15 מ"ל חרוטי שאר NBM + B27 (בצע סך של 13 מ"ל לצלחת 24 באר או 11 מ"ל במשך 5 - 35. מנות מ"מ מערבבים בעדינות ולחכות פיסות גדולות של רקמה להתיישב).
3. תא העברת ההשעיה (0.5 מ"ל / 24 צלחת היטב היטב או 2 מ"ל / 35 תרבות צלחת מ"מ).
4. בעת שימוש coverslips זכוכית, להוסיף 80 ההשעיה תא μl לכל coverslip ולאפשר 1 שעות ברקמות תרבות חממה עבור תאים לדבוק לפני מציפים את החדר עם NBM/B27 התקשורת יותר.
5. שמירה על תרבויות 37 ° C ו 5% CO _2.

יום הבא

24 צלחת היטב: כל ערוצי היטב עם תא 0.5 שאינם נוירונים מ"ל מותנה NBM/B27 בינוני (cNBM/B27; פרוטוקול להכנת בינוני cNBM/B27 מופיע בהמשך)

מנות 35mm: החלף 0.5 מ"ל עם מדיום cNBM/B27.

שמרו על תרבות על ידי החלפת 0.5ml של המדיום עם cNBM/B27 טריים כל 2-3 ימים.

למרות התקשורת בתרבות אינו מקדם התפשטות תאים גליה, תרבויות יכולים להיות מטופלים עם 5μM FDU (5-Fluoro-2'-deoxyuridine, Sigma F0503) ביום 3-5 בתרבות לצמצם עוד יותר את מספר התאים גליה במידת הצורך.

SET -UP עבור Dissection ותרבות

לעקר כלי הביתור EtOH 70% או החיטוי אותם:

• מספריים (med. קטנים) מריות (med. קטנים)
• מלקטת (med. קטנים) רייזור להב
• Blade לאמבטיה הצפת vibraslicer
• טריז מתכת קטנים לתמיכה להב למוח

חומרים אחרים:

• צלחות פטרי (60 מ"מ)
• צלחות פטרי (35 מ"מ)
• מסנן נייר
• Pipet זכוכית 10 מ"ל
• Pipets חד פעמי סטרילי, 5,10 ו - 25 מ"ל
• מזרק מסנן, 0.2 מיקרומטר
• מזרק 5 סמ"ק
• צנטריפוגה צינורות, 15 מ"ל
• סטרילי פסטר זכוכית pipets
• PDL תרבות צלחות זכוכית מצופה או coverslips

Six לייבל 15 מ"ל צנטריפוגות צינורות לעקוב הכנה:

Tube מס '1: פתרון אנזימים:

הוסף 50 U של papain (וורטינגטון LS 03,126) ל DS 5 מ"ל המכיל:

• 100μl של L-cystein (0.8mg)
• 7 μl 0.1N NaOH
• 50 APV μl (5mm)

השאירו את פתרון בטמפרטורת החדר כדי לנקות. שים לב כי פתרון אנזים יופיע "מעונן" בהתחלה צריך לנקות לפני השימוש.

Tube & # 2 # 3: היי מעכבי האנזים:

3 מ"ל + DS 300 μl BSA / Ti + 30 APV μl (5 מ"מ).

מערבבים בעדינות כדי למנוע בועות, ואז מתחלקים לשתי aliquots 1.5ml.

Tube # 4 - # 6: מעכבי האנזים נמוכה:

8 מ"ל DS + 80 μl BSA / Ti + 80 APV μl (5 מ"מ).

מערבבים בעדינות כדי למנוע בועות, לחלק לשלוש aliquots 2.6 מ"ל.

צינורות מקום ממוספר # 2 עד # 6 על הקרח. השאר צינור # 1 (פתרון אנזימים) בטמפרטורת החדר.

פתרונות ALIQUOTS

• הפתרון (בופר) סיגמא פורמולה wt 500 מ"ל [קונצרט כלשהו.]
• כלוריד הנתרן NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mM
• אשלגן כלוריד KCl P-4504 74.56 4.0g 5.4mM
• סודיום פוספט Dibasic anhydrous Na ₂ HPO ₄ S-0876 142.0 0.24g 0.17mM
• אשלגן פוספט Monobasic anhydrous KH ₂ PO ₄ P-5379 136.09 0.3g 0.22mM

לשקול את כל המרכיבים ומערבבים עד להתמוסס במים מסוננים 400 מ"ל במיוחד. תביאו נפח סופי 500 מ"ל. מקום בבקבוק החיטוי נקי. חנות ב 4 ° C ו התווית "הפתרון DS".

• פתרון ב '(Hepes) סיגמא פורמולה wt 250 מ"ל [קונצרט כלשהו.]
• Hepes Hepes H-3375 283.3 20.97g 9.9mM

הוסף אולטרה סינון מים עד 200 מ"ל. מערבבים עד שהיא נמסה ולהביא נפח סופי 250 מ"ל. מקום בבקבוק החיטוי נקי. חנות ב 4 ° C ו התווית "DS פתרון B".

• הפתרון עובד 500 מ"ל [קונצרט כלשהו.]
• Ultra מסונן 400 מ"ל מים
• במלאי פתרון מ"ל 25
• במלאי פתרון B 14 מ"ל
• D (+), גלוקוז Sigma-G-8270 3.0 גרם 33.3mM
• סוכרוז Sigma S-0389 7.5 גרם 43.8 mM

התאם ל-pH 7.4 עם 1N NaOH. תביאו נפח סופי 500 מ"ל מים מסוננים במיוחד. למזוג אל תוך בקבוק זכוכית נקי החיטוי. חנות ב 4 ° C. לייבל "הפתרון הביתור".

Poly-D-ליזין אופן ההכנה:

1. הכן פתרון מניות 10x של פולי-D-ליזין (PDL: Sigma P-7280) ב סטרילי H ₂ O ב 1mg/ml.
2. בצע 1.0 aliquots מ"ל. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C עד 3 חודשים.

MEDIA

1. הוסף 10 מ"ל של B-27 מוסף (Gibco 17504-044) על בקבוק 500 מ"ל NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049).
2. בצע 40 מ"ל aliquots ולאחסן ב 4 ° C.

APV

1. הוסף 10 מ"ל סטרילי H ₂ O ל בקבוקון של 10 מ"ג APV (2-amino-5-phosphonopentanoic חומצה, Sigma A-5282) ומערבבים היטב.
2. הכן 180 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C.

BSA / טי

1. ממיסים 1 גרם BSA (אלבומין שור. Sigma A-7030) ו 1 גרם מעכבי טריפסין (Sigma T-9253) ב 10 מ"ל DS.
2. התאם ל-pH 7.4 עם 1N NaOH.
3. לעקר ידי סינון דרך המסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
4. מתחלקים 400 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C.

L-ציסטאין

בתוך צינור Eppendorf לפזר 0.6 מ"ג L-ציסטאין (Sigma C-7755) ב DS 200 μl.

אגר (4%)

1. ממיסים 4 גרם של אגר Bacto (Difco 0140-01) במים סטריליים 100 מ"ל. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד זקוקים לתרבות.
2. אגר במיקרוגל כדי להמיס למלא צלחת פטרי 35 מ"מ. בואו לשבת להתקרר לפלמר.

PAPAIN (וורטינגטון LS 03126)

e_title "> NON-העצבית תרבויות הבקבוקים תרבות NUNC

תרבות ציפוי הבקבוקים (4 בקבוקים Nunc)

1. הוסף 9 מ"ל מים סטריליים כל אחד 3 צינורות של PDL 10X לעשות PDL 1X.
2. העברת 30 מ"ל 1X PDL בבקבוק הראשון.
3. הזז מעט עד שכל משטחי הגידול מכוסים. בואו לשבת במשך דקות 1.
4. העברת 1x PDL אל הבקבוק השני. בואו לשבת במשך דקות 1.
5. חזור עם הבקבוקים השלישי הלאה.
6. לשטוף כל ארבעה בקבוקי 2X עם 150 מ"ל סטרילי H ₂ O.

להכין תמיסת אנזים (ES):

1. ב משקל 0.6 צנטריפוגות מ"ל צינור החוצה 0.8 מ"ג L-ציסטאין (Sigma C7755), מוסיפים 150 מ"ל ו - DS מערבולת עד הגבישים מתמוססים.
2. העברת DS 5 מ"ל ל 15 מ"ל צינור חרוטי, ולאחר מכן להוסיף 150 מ"ל L-ציסטאין.
3. הוסף Papain 50 יחידות. (03,126 LS וורטינגטון)
4. הוסף 7ml 0.1N NaOH.

להכין מזכרות (GIBCO # 11090-081)

1. הסר 65 מ"ל מבקבוק מ"ל 500 ממ. שמור 10 מ"ל להכין גלוקוז.
2. הוסף 5 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס (Gibco # 15070-063).
3. הוסף 10 מ"ל גלוקוז 1M (Sigma G-8270) (1,8 גרם / מ"ל ​​10 ממ)
4. הוסף 50 מ"ל סרום עוברית שור (Gibco # 16140-071) שור או עגל סרום (אומגה BC-04).
5. מערבבים היטב, aliquot ולאחסן ב 4 ° C.

תוספת NEUROBASAL MEDIUM/B-27 (NBM/B27)
NBM, 500 מ"ל (Gibco # 21103-049); B-27 (50X), 10 מ"ל (Gibco # 17504-044)

1. מוסיפים את התוכן של בקבוקון B-27 על הבקבוק NBM ומערבבים.
2. Aliquot ולאחסן ב 4 ° C.

דיסקציה של רקמת מוח

1. יבש לנתח בכלים EtOH 70% לפני לנתיחה.
2. העברת 10 DS מ"ל בכל צינור 3-15 מ"ל.
3. בחר גורים העכבר (P0 - P3), תוכלו זקוק לשלושה מוחות עבור 4 בקבוקים.
4. הוסף DS קר צלחת פטרי 35 מ"מ.
5. לערוף עכבר סיירים לנתח את המוח.
6. מקום המוח לתוך צלחת פטרי המכילה DS קר.
7. קוצצים הרקמה לחתיכות קטנות מספיק כדי לעבור דרך פיפטה זכוכית.

אנזים דיסוציאציה

1. הסר כמו DS האפשר מן המנה עם פיפטה פסטר.
2. סנן ES באמצעות מזרק 0.2 מיקרומטר לסנן 5cc.
3. המקום ES בצלחת עם רקמה.
4. דגירה רקמה על 37 מעלות צלזיוס חממה (CO ₂ חינם) למשך 30 דקות.

כביסה רקמות

1. העברת רקמות עם פיפטה זכוכית הצינור DS הראשון, וודא לקבל כמו ES שפחות.
2. צנטריפוגה למשך 30 שניות ב 1500 סל"ד.
3. העברת רקמות הליך לחזור עוד פעמיים.

טחינה דקה

1. מקום 38 מ"ל של ממ / FBS לשפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה
2. הוסף 3 מ"ל של ממ / FBS לצלחת 35 מ"מ ורקמות להעביר צלחת פטרי זה.
3. לנתק את הרקמה על ידי בעדינות triturating אותו דרך קצה Eppendorf 1000μl pipet.
4. העברת ההשעיה תא אל הצינור המכיל 38ml של ממ / FBS ומערבבים היטב.

ציפוי

1. מעמד בקבוקי תרבות זקוף לקבל כמויות שוות של ההשעיה תא התקשורת בבקבוק אחד.
2. שים 90 מ"ל של ממ / FBS בבקבוק כל תרבות.
3. הוסף 10 מ"ל של השעיה תא בקבוק אחד.
4. לייבל: Non-העצבית, ראשי תיבות ותאריך. לדגור על 37 ° C ו 5% CO _2.

האכלה

1. ביום 3 או 4, תאים להאכיל עם מזכרות חם / FBS (למזוג את כל התקשורת להחליף אותו עם 100 מ"ל של ממ / FBS). תרבויות עשוי להימשך 70-10 ימים להפוך ומחוברות.
2. ביום 7-10 לשנות את המדיה עבור NBM/B27.
3. למחרת, לאסוף את כלי התקשורת. מסנן עם 0.22μm
4. הפוך את aliquots של 40 מ"ל ולהאכיל תרבות עם ממ / FBS.
5. הבא 2 או 3 ימים, לשנות את המדיה עבור NBM/B27
6. למחרת, לאסוף לחזור על התהליך.
7. שמור על איסוף המדיה עבור כ. 2 שבועות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
נתרן כלוריד	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
אשלגן כלוריד	Sigma-Aldrich	P4504
נתרן פוספט דיבסי	Sigma-Aldrich	S0876
אשלגן פוספט מונובסי	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-גלוקוז	Sigma-Aldrich	G8270
סוכרוז	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
תוסף B27	Invitrogen	17504-044
מצע Neurobasal (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
אלבומין בקר	Sigma-Aldrich	A7030
מעכב טריפסין	Sigma-Aldrich	T9253
נתרן הידרוקסיד, תמיסה 1N	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
פפאין	Worthington Biochemical	LS 03126
מסנן מזרק סטרילי 0.2 μm	Fisher Scientific	DDA02025S0
כיסויות זכוכית, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
מצע מינימלי חיוני (MEM)	Invitrogen	11090-081	עם מלחים של Earle’s וללא L-glutamine, נדרש לגידול תרביות שאינן נוירונליות
פניצילין/סטרפטומייצין	Invitrogen	15070-063	עבור תרבית שאינה נוירונלית
סרום בקר עוברי	Invitrogen	16140-071	נדרש עבור תרביות שאינן נוירונליות
בקבוק לתרבית רקמה Nunclon "Triple Flask"	Fisher Scientific	12-565-25	לשימוש עבור תרביות שאינן נוירונליות. בקבוקים אלה נוחים מאוד להפקת "conditioned Neurobasal Media/B27", אך ניתן להשתמש בכל בקבוק או צלחית אחרים לתרבית רקמה במקומם.
צלחית "Imaging dishes" עם תחתית זכוכית	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	צלחית תרבית 35mm עם תחתית זכוכית, אידיאלית לדימות סידן או נתרן בעת שימוש במערכת דימות הפוכה. אך יקרה!