הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56213

⸱

31 בינואר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

תקציר

נזק לדנ א מעוררת תגובות ספציפיות איתות ותיקון בתא, אשר חיוני להגנה של הגנום שלמות. לייזר microirradiation הפך כלי ניסויי חשוב לחקור את ה-DNA נזק התגובה (DDR) ויוו. היא מאפשרת ניתוח מתא בודד ברזולוציה גבוהה בזמן אמת של דינמיקה macromolecular בתגובה לייזר המושרה נזק מוגבל לאזור submicrometer בתוך גרעין התא. עם זאת, התנאים לייזר השונים שימשו ללא הערכה של הבדלים בין סוגי הנזק הנגרם. כתוצאה מכך, מהות הנזק הוא לעתים קרובות לא טוב מאופיין או נשלט, גורם חוסר עקביות לכאורה פרופילי גיוס או שינוי. להדגים כי תנאי הקרנה שונות (קרי, אורכי גל שונים וכן סמכויות קלט שונות (irradiances) של לייזר הפמטו-שנייה (fs)-סגול (ניר)) המושרה הרכבות חלבון ברורים של DDR ותיקון. זה משקף את סוג נזק לדנ א המיוצר. פרוטוקול זה מתאר איך טיטור של עוצמת הקלט הלייזר מאפשר אינדוקציה של כמויות שונות המורכבות של נזק לדנ א, אשר ניתן לנטר בקלות על ידי זיהוי של נזקים crosslinking, בסיס, פוליפוני דיפרנציאלית (ADP-ריבוז) (PAR) איתות, ו תיקון מסלול ספציפי הרכבות גורם נזק אתרים. ברגע נקבעים התנאים נזק, זה אפשרי לחקור את ההשפעות של נזק שונות המורכבות והאיתות נזק דיפרנציאלית, כמו גם דלדול של factor(s) נגד הזרם על כל גורם בעל עניין.

מבוא

אין ויוו ה-DNA נזק איתות זה אינם מובנים היטב
In vivo, ה-DNA הוא ומורכבת עם שינויים היסטוניים וגורמים אחרים כדי טופס כרומטין סיבים. ויסות הכרומטין היא בעלת חשיבות עליונה עבור ה-DNA חילוף החומרים. לדוגמה, הגרסה היסטון H2AX phosphorylated אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM), אחרים kinases כפול הבאים-strand שובר אינדוקציה (DSB), ועל חשוב DSB נזק אות הגברה, כמו גם מתן אתר עגינה עבור השני גורמים. הפצת הבחירה מסלול איתות ותיקון הנזק מופיעים אנושות להיות מושפע הכרומטין מקומיים-נזק לאתרים1. מספר של כרומטין שיפוץ גורמים מלווים היסטון, היסטון שינוי אנזימים אכן גייסו לפגוע באתרים חשובים עבור תיקון דנ א יעיל, הדגשת החשיבות של כרומטין רגולציה ב- DDR ואת תיקון2 , 3 , 4. יתר על כן, נזק באתר קיבוץ באשכולות או שינוי מיקום נצפתה ב שמרים ו דרוזופילה5,6,7,8, מזכיר relocalization של ג'ין לוקוסים, תא subnuclear הקשורים עם ג'ין בתקנה9,10. מחקרים שנעשו לאחרונה העכבר, תאים אנושיים התגלה גם גיוס של אתרים DSB, אילו השפעות תיקון נאמנות ועל מסלול הבחירה11,12. זה מעלה את האפשרות כי DDR/תיקון גם בצורה אינטימית קשורה אדריכלות גרעיני כרומטין מיומנויות ארגון, כרומוזום דינאמיקה של גרעין התא. לפיכך, חיוני לפתח שיטות ברזולוציה גבוהה ללמוד DDR ולתקן תהליכים בהקשר של הסביבה גרעיני אנדוגני בתא חי כדי להבין קצר - ארוכת ההשלכות של נזק לדנ א.

תפקיד מכריע של PAR פולימראז (PARP) מודד במידה ואת סוג הנזק, ויסות חלבון הרכבה באתר נזק
PARP1 הוא חיישן ניק DNA מופעל במהירות על ידי נזק לדנ א שמשחקת תפקיד קריטי תיקון דנ א13. PARP1 חשבו תחילה לפעול יחד עם הרנטגן לתקן לחצות משלימים 1 (XRCC1) כדי להקל על כריתה הבסיס לתיקון (בער), אך מחקרים אחרונים לחשוף את תפקידה השני שמסלולי התיקון ה-DNA, כולל DSB תיקון14. PARP1 שימושים nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD+) כמו מצע ל ADP-ribosylate מספר היעד החלבונים מופעל, כולל את עצמו. אנזים זה ובני משפחה אחרים משכו תשומת לב רבה בשנים האחרונות כפי מעכבי PARP הופיעו גם מבטיח תרופות טיפוליות עבור סרטן. למרות מעכבי PARP בתחילה נמצאו יעילים גנטי לסרטן השד (BRCA)-מוטציה תאים סרטניים בשד, עכשיו יש שפע של עדויות על ההשפעות שלהם במונו - שילוב טיפולים אלטרנטיביים יחד עם ה-DNA נזק סוכנים/הקרנה נגד קשת רחבה של סרטן עם מוטציות לא מוגבל ל- BRCA15,16,17,18,19,20.

ברמה המולקולרית, הפעלת PARP הוצגה לשחק תפקידים חיוניים בארגון הכרומטין מקומיים באתרים נזק. תלויי-PAR גיוס של כרומטין השינוי אנזימים מקלה DSB תיקון ותיקון מכתיבה בחירות מסלול, מציעה את תפקיד חשוב פיגומים PAR השינוי באתרים נזק. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 לאחרונה להדגים את החרגת מחייב p53 חלבון 1 (53BP1) מפני נזק אתרים על ידי PAR 32, מתן הסבר חלופי עבור תלויי-53BP1 hyperactivation של endjoining שאינם הומולוגיים ( NHEJ) על ידי PARP מעכב, המדגיש את חשיבות PARP ב DSB תיקון מסלול הבחירה33,34. PARP1 גם ישירות PARylates, משפיע על הפעילות של DNA מרובים תיקון גורמים14.

באמצעות לייזר Microirradiation ככלי לימודים DDR/תיקון In Vivo
לייזר microirradiation לייצר שינויים תת מיקרון על כרומוזומים בודדים היה תחילה תיאר בשנת 196935 , שנסקרו בפירוט 198136. כמה עשורים מאוחר יותר, לייזר microirradiation הוצגה כדי לגרום נזק לדנ א-אזור מוגדר submicrometer בתוך גרעין התא, ולא הוכח טכניקה יקר ללמוד גיוס או שינויים של גורמים שונים DNA נגעים vivo בתוך 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. שיטה זו מאפשרת זיהוי של גורמים אלו שיוצרות לא ברורים הקרנה-induced מוקדים (IRIF)-נזק לאתרים39,42. . זה גם ניתן לבחון את הדינמיקה ייתכן של שינויים מבניים כרומטין באתרים נזק והן בשאר חלקי הגרעין. השווינו בקפידה את DDRs המושרה על ידי מערכות לייזר שונים קלט כוחות כדי להעריך את הקשר בין סוג נזק לדנ א microirradiation תנאים32,43,44, 45. דפוסי גיוס aberrant של 53BP1 ושל telomeric חוזר מחייב פקטור 2 (TRF2) נצפו במחקרים קודמים לייזר נזק, אשר סיפקה את הבסיס על הדאגה מחזוריות הטבע "הלא-פיזיולוגיים" לנזק לייזר המושרה46 ,47,48,49. מצאנו כי אלו סתירות לכאורה יכול עכשיו להיות מוסברת על ידי PARP דיפרנציאלית איתות אשר בוחן את הכמות ואת המורכבות של נזק מושרה32. אנחנו אישר כי: 1) לייזר-microirradiated תאים (אפילו לאחר הקרנה גבוהה קלט-power) הם נעצרו ב לאטמוספרה באופן תלוי-בקרת מחסום נזק, מורדם (לפחות עד 48 שעות)32,50; ו- 2) תיקון גורם גיוס/שינויים בנאמנות מסכם את הדברים אלו נצפו עם טיפול קונבנציונאלי DNA סוכנים מזיק, אינדוקציה DSB endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. תוצאות אלה תומכים מאוד את הרלוונטיות פיזיולוגיים של הלומדים לייזר המושרה נזק הסלולר תגובות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. התא הבסיסי הכנה

הערה: השלב זה לגילוי סטנדרטי immunofluorescence של חלבון אנדוגני גיוס או שינוי, לשימוש של קו תא stably ביטוי חלבון רקומביננטי מתויגות fluorescently. לדוגמה, בתאי אפיתל של הכליה כיס Potorustridactylus (PtK2) לבטא stably EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP שימשו קודמות שלנו לומדים (איור 1)32. במקרה הראשון, המוקד ויוצרים אזור של 53BP1 (חומצה אמינית 1220-1711) המכיל את התחום oligomerization התחום טיודור, המוטיב גיוס תלויי-ubiquitylation (UDR), שהיה מחובר לגבו GFP משופרת (EGFP-53BP11220-1711). חלבון כימרי זה recapitulates נזק באתר הגיוס של54,53,5553BP1 באורך מלא. הלה תאים, מתויגות fluorescently subunits של cohesin (למשל, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52ו- GFP-SA2 51) חייב stably להביע כדי להבטיח השתלבות יעילה המתחם וכדי מסכם את הדברים S/G2 מחזור התא נזק ספציפי שלב באתר הגיוס של cohesin אנדוגני51.

  1. זרע בכל סוג התא חסיד על גבי מאכל תרביות רקמה 35 מ מ עם coverslip gridded כדי לאפשר זיהוי תא בודד. להתאים את מספר התא הראשוני להשגת 60% confluency ב 36-48 h מבוסס על קצב התפשטות של הקו לתא מסוים. לדוגמה:
    1. עבור PtK2 כיס אפיתל תאי הכליה (פראי סוג או אלה לבטא stably EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP): צלחת 2.0 x 10 תאים4 ב 2 mL מתקדם מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מגלוטמין, שור עוברית 4% סרום (FBS) ואנטיביוטיקה (פניצילין U/mL 100 ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL), דגירה ב 37 ° C עם 7% CO2.
    2. עבור הלה תאים עם stably לבטא fluorescently מתויג חומרים GFP-SA2: תאי זרע 1.0 x 105 2 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין U/mL 100 ו- 100 µg/mL סטרפטומיצין, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2. שאר התאים הלה עשוי לשמש גם כולל תאים שלא שונתה או תאים לבטא hSMC1-GFP.
  2. לאפשר תאים לדבוק ולאחר להתרבות במשך 36-48 שעות לפני DNA נזק אינדוקציה-30-60% הנהרות (כדי לאפשר ויזואליזציה של המספר לרשת). המשך סעיף 4.

2. ארעי תרביות תאים

הערה: לפעמים טוב נוגדנים אינן זמינות לזהות את החלבונים אנדוגני. אם שורות תאים stably המבטאים חלבונים סמן אינם זמינים, לבצע את transfections ארעית כדי לפקח חלבונים fluorescently עם תוויות עבור ניתוחים תא חי.

  1. עבור תאים הלה, ביום 1, זרע 6-8 x 10 תאים4 בתקשורת תרבות 0.5 mL בבאר אחת של צלחת 24-ובכן, דגירה ב חממה humidified 100% ב- 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2. ראה שלב 1.1 תנאים תרבות המדיה.
  2. יום 2, שימוש פלסמיד ביטוי בתרבית של קידוד של DNA מתויגות fluorescently לתקן פקטור (למשל, ה-GFP-NTH1 או ה-GFP-OGG1 עבור נזק הבסיס32,44,56GFP-Ku עבור מינון גבוה DSBs57, GFP-53BP1 32 DSBs פשוט יחסית, או חלבונים אחרים עניין דבוקה תגית פלורסנט) כדי לבצע בתיווך ליפוזום תקנים הדנ א. לדלל פלסמיד µg 0.3 DNA לתוך µL 25 של סרום ללא תרבות התקשורת צינור 1.5 מ.
  3. עוד צינור 1.5 mL, לדלל 1 µL מבוססי ליפוזום DNA תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 25 ללא סרום תרבות המדיה ומערבבים בעדינות.
  4. מערבבים בעדינות את הסוכן מדוללת של DNA ו תרביות תאים, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) אל טופס DNA-השומנים מתחמי.
  5. שטיפה תאים עם 0.5 mL תרבות המדיה פעם אחת, מסיר את המדיה, וכן להוסיף 0.5 mL טריים תרבות המדיה על התאים (כמו שלב 1.1).
  6. הוסף את מתחמי ה-DNA-השומנים לתאים. מערבבים בעדינות במוזיקת שלוחית מספר פעמים. להחזיר את התאים החממה כמו שלב 2.1.
  7. לאחר 4-6 ה', להסיר את המדיה התרבות התאים ולהוסיף 300 µL 0.05% טריפסין-EDTA. להסיר אותו, להוסיף 200 µL טריפסין-EDTA, דגירה בחממה 37 º C למשך 3-4 דקות.
  8. לאחר שנוכח כי התאים מנותקים, להוסיף 800 µL תרבות המדיה, resuspend את התאים על ידי בעדינות pipetting להיפרד כגיהנום התא. להעביר התליה תא לצלחת תרבות 35 מ מ עם coverslip gridded ולאחר הוספת מדיה תרבות לאמצעי הסופי של 2 מ.
  9. דגירה תאים בחממה כמו שלב 2.1 במשך 48 שעות, ולאחר מכן להמשיך בסעיף 4.
    הערה: אם הביטוי של חלבון רקומביננטי רעיל (transfected תאים להציג מורפולוגיה עגולים או לא סדיר לאחר דגירה בשלב 2.8), לקצר את זמן הביטוי, ולבצע microirradiation לייזר (סעיף 4) ב- 16-20 h לאחר תרביות תאים כל עוד ביטוי חלבון יכול להיות מאושרות (לגילוי קרינה פלואורסצנטית, ראה שלב 4.3). במקרה זה, לבצע תרביות תאים ישירות לתוך המנה 35 מ מ. זרע 3.0 x 105 הלה תאים בצלחת 35 מ מ עם coverslip gridded כדי להשיג כ 50-70% זרימה לאחר 30 ה Transfect DNA פלסמידים, ולשנות מדיה h 2-6 לאחר תרביות תאים. . המשך עם לייזר microirradiation 12-20 h מאוחר יותר אם ביטוי חלבון סביר ותאים בריאים.

3. מחזור התא סינכרון

הערה: עבור רקומבינציה הומולוגית לתקן (HR) חלבונים, כמו Rad51 ו cohesin, הגיוס הוא בולט יותר בשלב S/G2 של מחזור התא, אשר בנוסף תיקון לוקח מקום51. לפיכך, כדי לפקח על הגיוס של חלבונים אלה, התא לשלב S/G2 דרוש סנכרון.

  1. שלב S/G2 סינכרון
    1. השתמש בפרוטוקול בלוק תימידין כפול עבור סינכרון תא S/G2 לשלב50,51. לאחר זריעה התאים בצלחת gridded coverslip 35 מ מ (ראה שלב 1.1), דגירה התאים תימידין (כדי ריכוז סופי של 2.5 מ מ) בתקשורת תרבות (כמו שלב 1.1) עבור h 17 ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2.
    2. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל תימידין ללא תרבות המדיה (כמו שלב 1.1) פעמיים, דגירה התאים 2 מ"ל תימידין ללא תרבות המדיה עבור h 9 כמו שלב 1.1.
    3. להוסיף µL 200 מ מ 27.5 תימידין מניות פתרון (מומס תרבות המדיה) לתוך תרבות התקשורת עם תאי ריכוז סופי של תימידין 2.5 מ מ. דגירה התאים כמו צעד 3.1.1 ה 15 עוד שטיפה דגירה התאים ללא תימידין תרבות המדיה עבור 4-6 h, לגרום נזק לדנ א (סעיף 4).
    4. לאשר את יעילות סינכרון באמצעות סמנים מחזור התא (Cyclin A2 ו- B1 S/G2 ו G2, בהתאמה), S/G2 ספציפיות שלב DNA נזק תיקון גורמים (למשל, Rad51 או cohesin), או על-ידי IdU/עידו ההתאגדות (עבור תאים שלב S)51.
  2. סינכרון שלב G1
    1. זרע 6-8 x 10 הלה4 תאים בצלחת תרבות 35 מ מ עם gridded coverslip (שלב 2.1).
    2. לאחר יומיים, לזהות מפה של תאים, אשר הינם מעט והרימה אותה בצורת עגול, תחת מיקרוסקופ הפוכה באמצעות המטרה X 10 X 10 עדשות עינית. לרכוש תמונות כדי להקליט את המיקום של מפה של תאים ב- coverslip gridded.
    3. לאחר 3-4 h, לאשר חלוקת התא לתוך שני תאי הבת (בשלב G1), לגרום נזק לדנ א (סעיף 4).

4. טיטור של לייזר כוח קלט

הערה: פרוטוקול זה, ואנחנו יוצרים נזק לדנ א באמצעות של 780 nm פעמו לייזר fs ניר מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי, או 800 nm פעמו לייזר ניר fs מצמידים במיקרוסקופ אפינפרין הפוכה-זריחה. למרות כוח קלט (בפועל בקרינה בנקודת המוקד לייזר הדגימה) צריך זירוז DDR דומות שונה במערכות אלו, העיקרון הבסיסי של כוח קלט טיטור חל בשני, אם בכלל, ניר מערכות32,57 . האנרגיה בחיי עיר לפי הדופק לייזר irradiance שיא-מוקד עבור מערכות לייזר שני היו בטווח של-2-4 × 10 × 10 5.33 מטרים-1 nJ ו- 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, בהתאמה32.

  1. להפעיל את הלייזר ניר ולאפשר את מערכת הלייזר לחימום לשעה לפני השימוש.
  2. במקום מנה של תאים על שלב מחוממת (37 מעלות צלזיוס) בתוך תא המאפשר CO2 (5%) ובקרת לחות (100%).
    הערה: אם תא2 CO אינה זמינה, השתמש CO2-תקשורת תרבות עצמאית במשך עד 5-6 שעות. אם שלב החימום אינו זמין, להשאיר את התאים במיקרוסקופ < כעשרים דקות, להחליף מיד לתוך החממה תרביות רקמה עם טמפרטורה נכונה, CO2בקרת לחות. תנאים תרבות אלה עשויים להשתנות בהתאם לסוג תאים מסוים בשימוש כמו גם האורגניזם נגזרת (למשל, יונקים לעומת דו-חיים).
  3. לניתוח תא בשידור חי של חלבונים מתויג fluorescently, בחר מסנן GFP (450-490 nm עירור, פליטה nm 515-586) או מסנן Cy3 (540-552 nm עירור, פליטה nm > 590) GFP או התמזגו mCherry חלבון, בהתאמה, באמצעות 100 X או טבילה שמן X 63 המטרה.
  4. לחפש תאים בעלי אותות פלורסצנטיות דומות, המשקפים רמות דומות של ביטוי חלבון. הימנע תאי יש ביטוי חלש מדי או חזקים מדי על מנת להפחית את השתנות לתא במדידות קרינה פלואורסצנטית.
  5. Titrate את עוצמת הקלט של הלייזר.
    1. 780 ניר ננומטר לייזר המחוברים מיקרוסקופ קונפוקלי
      1. השתמש בפונקציה אקונומיקה התוכנה למטרה רצועות ליניארית בתוך גרעין התא חשיפה סריקות לייזר יחיד (רזולוציה 512 x 512 פיקסלים, זום X1, מולבן אזור 50 x 4 פיקסלים, 12.8 µs פיקסל להתעכב זמן, איטראציה x1) דרך המטרה שמן (100 X / 1.3 נה).
      2. להתאים את האחוז שידור לייזר (באמצעות התוכנה/חומרה בנוי למערכת מיקרוסקופ לייזר על ידי היצרן) ל 5% מבלי לשנות הגדרות אחרות כלשהן.
      3. המקום תא במרכז השדה. לחץ על האזור של כלי הריבית (ROI), ואת לצייר קו או תיבת (כ 50 x 4 פיקסלים) בגרעין באמצעות העכבר, ולחץ על הלחצן "אקונומיקה" כדי לגרום נזק לדנ א.
        הערה: בשלבים הבאים הקרנה, "הלבנת" צריך להיות מוגברת במרווחים של 5% ל-40% או עד 100% במידת הצורך.
      4. 800 ננומטר לייזר ניר המצורפת מיקרוסקופ epi-זריחה
      5. לשלוט כוח קלט (63 X / 1.4 NA) שלב ניגודיות שמן טבילה אובייקטיבית שסיבוב ממונע של מסנן קיטוב הציג הנתיב של קרן, רכוב על32,מבוקר-מחשב הבמה המסתובבת ממונע39 , 58.
      6. להתאים את הזווית מקטב (°) ומדידת כוח קלט (mW) הזנת המיקרוסקופ, באמצעות מד כוח לייזר. לקבוע את הזוויות מקטב לספק קלט כוחות שנעים בטווח שבין 20 mW-155 mW ב 5-10 mW במרווחים.
      7. לקבוע את זווית מקטב המתאים כדי 20 mW הספק קלט.
        הערה: עבור מערכת הלייזר שלנו, אם הזווית מקטב הוא 40 °, הכוח קלט הוא 65 מגוואט. להגדיל את כוח קלט עם גידול של 5-10 מגה-וואט.
  6. לניתוח תא חי, ללכת שלבים 6.1 ו- 6.3. לגילוי immunofluorescence של חלבונים אנדוגני או שינויים המשך סעיף 5. לאחר הניתוח, עבור לשלב 4.7 עבור טיטור נוספת של הכוח לייזר. כדי לנתח את הדרישה פקטור נגד הזרם, עבור אל סעיף 7.
    הערה: גיוס של גורמים BER והן NHEJ היא מהירה (בתוך דקות ספורות), ארעי (< ~ 30 דקות h - 1 בהתאם הפוסט גורם ו- < ~ 4 h נזק אינדוקציה, בהתאמה). לעומת זאת, הגיוס של גורמים HR Rad51 ו cohesin לזיהוי ב ~ 30 min - 1 h, הם נוטים להימשך יותר מ 8 שעות לא מתוקן DNA נגעים44,50,51. לכן, זה הכרחי לבחון בתקופה שונה נקודות פוסט הקרנה עבור גורמים שונים לתיקון.
  7. עולה כוח קלט במרווחים הרצוי (כלומר, 5% 780 ניר לייזר ו- 5-10 mW עבור ניר 800) כמו שלב 4.4, וחזור על הצעדים 4.5-4.7 על סט חדש של תאים כדי לקבוע את הסף (50% של תאים פגומים הצג הגיוס) ואת שיא (100% של תאים הצג גיוס) עבור כל חלבון.

5. immunofluorescence מכתים

הערה: לצורך זיהוי של שינוי חלבון קוולנטיות, כגון נקוב (סמן נזק מורכבות) ו- H2AX זרחון (γH2AX) (DSB מרקר), כמו גם cyclobutane פירימידין דיימר (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) ו- 8-oxoguanine (8-oxoG) (crosslinking ו בסיס נזק סמנים, בהתאמה), תאים חייב להיות קבוע, מוכתם נוגדנים ספציפיים. בנוסף, מומלץ לאשר התוצאות המתקבלות עם החלבונים רקומביננטי מתויגות fluorescently על ידי זיהוי נוגדנים של החלבונים אנדוגני, כדי להבחין בין חפצים המושרה על ידי ביטוי של חלבונים פיוז'ן רקומביננטי.

  1. לתקן תאים בנקודות זמן שונות לאחר נזק אינדוקציה (שלב 4.5) תלוי בגורמים על-ידי החלפת המדיה תרבות (ראה שלב 1.1) 1.5 מ של 4% paraformaldehyde/1 X PBS 10 דקות ב- RT.
    התראה: Paraformaldehyde אדים רעילים, כל העבודה צריכה להיעשות בשכונה fume מאוורר.
  2. להסיר 4% paraformaldehyde/PBS ולהוסיף 1 מ"ל של 0.5% סבון/PBS 10 דקות ב- RT.
  3. להסיר תאים דטרגנט/PBS ולשטוף 0.5% 2 מ ל- PBS, עבור 5 דקות פעמיים, דגירה בתאים 2 מ"ל של חסימת פתרון (10% עגל סרום, 1% BSA/PBS) עבור h 1-RT.
  4. הסרת חסימה פתרון, להוסיף 2 מ של PBS לתאים, והחלף PBS 250 µL פתרון נוגדן ראשוני של 3% BSA/PBS לילה 4 ° C או h 1 בשימוש RT. 1:200-שבערך דילול (ריכוז טיפוסי כ 1 µg/mL, נחוש מדעית) עבור נוגדנים ספציפיות עבור סימני נזק-דנ א שונים (למשל, γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); רופאות/6-4PP (נזק crosslinking); 8-oxoG/DNA glycosylases (למשל, NTH1) (בסיס נזק); PAR (נזק מורכבות במינון גבוה)).
  5. הסר את הפתרון נוגדן לשטוף עם 2 מ של PBS עבור 5 דקות פעמיים, הסר PBS ואת דגירה עם משני-נוגדן 250 של µL 0.1%, 3% BSA/PBS עבור h 1 בחושך-RT.
  6. להסיר את הפתרון נוגדנים משניים, להוסיף 2 מ של PBS עבור 5 דקות פעמיים ולהשאיר תאים ב- 1.5-2 מ"ל PBS ב 4 ° C עבור הדמיה בשלבים 6.1 ו- 6.2.

6. ניתוח כמותי זריחה של Immunostained או תאים חיים

  1. לכידת תמונות של תאים מוכתם או חי (n > 10) באמצעות מיקרוסקופ המשמש הקרנה. למערכת מיקרוסקופ epi-זריחה, להשתמש ברזולוציה של 1,344 x 1,024 פיקסלים ולשמור תמונות כקובצי TIFF 16 סיביות. לשימוש מיקרוסקופ קונפוקלי, 1 X הגדלה; ללייזר עבור GFP/FITC, 594 הנה לייזר עבור Cy3/mCherry; 512 x 512 או 1,024 x 1,024 פיקסלים עבור רזולוציית התמונה; סריקה מהירות 5, מספר: 1 עבור סריקה מהירה או 2 + עבור ממוצע של מעל סריקות מרובות כדי לשפר את האות לרעש יחס.
  2. השתמש ניתוח התמונה תוכניות שנועדו למדוד את עוצמת פיקסל.
    1. השתמש בכלי מלבן אמצעי האחסון כדי לצייר רועי סביב האתר נזק בתמונה תא בודד. השתמש באותו גודל רועי כדי למדוד את האות פלורסצנטיות רקע את נוקלאופלזמה הסמוך, אך לא חופפים עם האתרים נזק. . זה חשוב עבור נרמול photobleaching הקשורים במערכת מיקרוסקופ קונפוקלי
    2. למדידת קרינה פלואורסצנטית אותות באמצעות תוכנית ניתוח תמונה, לחץ על "נפח דו ח ניתוח" מצאה שבתיבה הכלי. יופיע חלון חדש. תחת הסעיף "נתונים כדי להציג", רק את "שם" ו- "צפיפות" התיבות הסימון. ואז לחץ על "סיום" כדי להמחיש את המידות.
    3. לייצא את ערכי תוכנית גיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על סמל שולחן נמצא בחלק התחתון של חלון דוח אמצעי האחסון, בחר "הלשוניות (בפורמט אקסל)" עבור שדה מפרידים ו- "קובץ" עבור ייצוא היעד.
    4. כדי לקבל אותות יחסית, להשתמש בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לחלק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית באתר נזק (עמודה 1) מאת בפקד זה רקע (עמודה 2) באזור נוקלאופלזמה ולחסר 1 עבור נרמול.
  3. קרינה פלואורסצנטית כמותיים בזמן אמת זמן-קורס ניתוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
    1. לזהות תאים חלבון-חיוביות מתויגות fluorescently באמצעות המיקרוסקופ כמו שלב 4.3.
    2. לבצע הדמיה זריחה זמן לשגות לפני הנזק, בנקודות זמן שונות לאחר נזק אינדוקציה בסעיף 4. קודם צייר את מלבין ROI (עבור נזק אינדוקציה) ולאחר מכן בחר "רכוש > סדרות זמן"-תפריט להגדיר "מספר" 20, וכן את "עיכוב מחזור" בתור 30 s, לבחור "מלבין פעם אחת אחרי הסריקה הראשונה" ולאחר מכן לחיצה על 'התחל ב''. במקרה זה, התמונה הראשונה היא רכשה מייד לפני הנזק אינדוקציה, ואחריו רכישות תמונה 19 במרווח s 30. מרווחי הזמן ("עיכוב מחזור") יכול להשתנות בהתאם למטרת המחקר.
    3. לאחר השלמת ייבוא תמונות, לחץ על "מתכוון", לצייר את רועי-האזור נזק. לחץ על "הצג טבלה" כדי להשיג שולחן המפרט את העוצמה בתוך ROIs שנבחר. לנרמל את הנתונים על-ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית האתר נזק בנקודות זמן שונות מעוצמת באותו האזור לפני הנזק, לחסר ב- 1.

7. קטן Interfering RNA (siRNA) תרביות תאים

הערה: דלדול של החלבון המטרה היא דרך יעילה ניסחו את הדרישה במעלה הזרם גורם לגיוס חלבון שנצפה נזק לאתרים (סעיף 4). יתר על כן, האסטרטגיה היא הדרך הטובה ביותר לטפל יחודיות של נוגדן המשמש לצורך זיהוי immunofluorescence (ראה סעיף 5).

  1. יום 1: הכן בארות 2 תאים הלה לתוך צלחת 24-ובכן על ידי זריעה 6-8 x 10 תאים הלה4 בתקשורת תרבות 0.5 mL מכל קידוח, אחד עבור פקד siRNA תרביות תאים, אחד עבור PARP1 siRNA (5'-CCG אגא AAT CTC TTA סי טי סי-3').
  2. יום 2: לאשר כי תאים הם כ- 40-50% confluent. לבצע בסיבוב הראשון של תרביות תאים siRNA: לדלל 5 siRNA pmol לתוך µL 25 ללא סרום תרבות המדיה, להוסיף 3 µL שומנים מבוסס תקנים ריאגנט לתוך הצינור, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של 5-10 דקות ב- RT.
  3. לשטוף את התאים עם מדיה תרבות טריים 0.5 מ ל פעם אחת, ולשמור את התאים בתקשורת תרבות טריים 0.5 mL (ראה שלב 1.1).
  4. הוסף את מתחמי ה-RNA-השומנים לתאים, לערבב בעדינות על ידי הטיית המנה אחורה וקדימה. להחזיר את התאים החממה כמו שלב 2.1.
  5. תשאף המיקס תרביות תאים, וכן להוסיף 0.5 mL טריים תרבות המדיה (שלב 1.1) לאחר 6 שעות.
  6. יום 3: ביצוע השלב השני של siRNA transfections (ראה צעד 7.2). זרע לאחר מכן, 60-100% של התאים לתוך תבשיל gridded coverslip 35 מ מ, כפי שמתואר בשלב 2.3.
  7. יום 5: להמשיך עם microirradiation לייזר באמצעות התנאי כוח לייזר אופטימלית לגיוס מירבי של הגורם של עניין, כפי שנקבע על-ידי סעיף 4. בדרך כלל, דלדול יעיל יכול להיות שנצפו בכ-60-90% של תאים הלה.
    הערה: כחלופה ומשלימים הגישה, מעכבי, אם הוא זמין, ניתן לעכב את הפונקציה של הגורם של עניין32,44. ניתוח ההשפעה של עיכוב DDR איתות, להוסיף 20 מעכבי PARP מיקרומטר, 1 מיקרומטר PAR glycohydrolase (PARG) המעכב או 10 מיקרומטר, DNA תלוית חלבון קינאז עם מעכב קטליטי יחידה משנית (DNA-PKcs) ו- 10 מיקרומטר כספומט מעכב ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) מנות h 1 לפני הנזק אינדוקציה. להוסיף דימתיל סולפוקסיד רק לתאים שליטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות תאים PtK2 stably להביע את EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP, לייזר כוח קלט טיטור בוצע כדי לקבוע את המצב האופטימלי עבור שלהם גיוס (איור 1)32.

באתרים נזק גבוה קלט-כוח לייזר, משמעותי התקבצות של שיקגו (crosslinking נזק שנוצר בדרך כלל על ידי אולטרה סגול (UV) נזק) כמו גם glycosylase DNA GFP-NTH1 במיוחד מזהה נזק הבסיס נצפו. בנוסף, אותות XRCC1 ו- CtIP גבוה נצפו, המשקף עלייה במספר מעברי סטרנד ולאחר הוכחת נזק לדנ א מורכב הוא המושרה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יתרונות השימוש microirradiation לייזר למחקר DDR הם:

1. זה ריאלי לזירוז סוגים שונים, כמויות של ה-DNA נזק ממעברי סטרנד פשוטים מורכבים נזק לדנ א, כדי לזהות גורמים שונים לתיקון על ה-DNA נזק אתרים על-ידי התאמת הפרמטרים הקרנה לייזר. זה גם אפשרי לגרום נזק מספר פעמים, גרעין התא אותו, על מנת להעריך את ההשפעות טרנסג'נדרים (כמו איור 3).

2. חשוב, אירועים-נזק ואתרי משני האירועים המתרחשים במקומות אחרים בגרעין ניתן בקלות להבחין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ד ר אקירה Yasui ב אוניברסיטת Tohoku, יפן על פלסמיד ביטוי GFP-NTH1, ד ר ארוס Lazzerini Denchi המחקר סקריפס המכון, הויה שבקליפורניה עבור TRF2-YFP ו- EGFP-53BP11220-1711 ביטוי פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי חיל האוויר Office של המחקר המדעי (FA9550-04-1-0101), בקמן לייזר המכון inc. לקרן (M.W.B), את מלגת קרן פורד של האקדמיה הלאומית למדעים (ל B.A.S), ואת ה-NSF MCB-1615701 CRCC CRR-17-426665 (ל- Y ק.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ti:Sapphire NIR פועם לייזר פמטו-שנייה Mira-900Coherent Inc.מירה 900
מיקרוסקופ הפוך Carl ZeissAxiovert 200M
63X/1.4 NA אובייקטיביZeissAPOCHROMAT Ph3 
שלב סיבוב קומפקטי בקר טמפרטורה Newport CorpPR50PP
WarnerTC-344B
מערכת חימוםIbidi 10918
מערכת דגירה בגזIbidi 11920
מד כוח ואנרגיה לייזר (RoHS)שדה קוהרנטיMaxII-TOP 
מצלמת CCD דיגיטלית ORCA-R2HamamatsuC10600
LSM 510 META מיקרוסקופים לסריקת לייזרCarl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APOCarl Zeiss
35 מ"מ כלים מרושתים MatTekP35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 תאי אפיתל כליהATCCCCL 56 
תאי HeLaATCCCCL-2
DMEMLife Technologies11885-092
מדיום בלתי תלוי CO2 טכנולוגיות חיים18045-088
מתקדם MEM Life Technologies12492-013בתוספת L-גלוטמין, 4% FBS
פניצילין/סטרפטומיציןFisher Scientific15140122
L-גלוטמיןFisher Scientific25030081
FBSOmega ScientificFB-02
תימידין   SIGMAT9250
מדיה ללא סרום        (מדיית סרום מופחתת Opti-MEM I)פישר סיינטיפיק11058021
אנטי-ציקולבוטנס פירימידין דימר (CPD) (עכבר)Kamiya Biomedical CompanyMC-062
Anti-XRCC1 (עכבר)Gene Tex IncGTX72311
Anti-53BP1 (ארנב)Santa Cruz Biotechsc-22760
Anti-CtIP (ארנב)Abcamab70163
אנטי-PAR פולימרים (עכבר)Enzo Life SciencesBML-SA216-0100
Anti-PAR (ארנב)Trevigen4336-BPC-100
Anti-TRF2 (עכבר)Novus Biological NB100-56506
אנטי 6-4PP (עכבר)Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (ארנב)                                        (לזיהוי קוהיסין)יוקומורי (KY)
Anti-Rad51 (ארנב)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-8349
Anti-Ku70 (עכבר)  Novus BiologicalsNB100-102
8-אוקסיגואנין Trevigen, Inc.
אנטי-PARP1  (ארנב)                                       נוצר ב-KY labref 43
  אנטי-hCAPG (ארנב)                                      (לזיהוי עיבוי)נוצר ב KY labref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc711-165-152
חמור אנטי עכבר Alexa Fluor 488 IgGThermo Fisher ScientificA-21202
HiPerFect siRNA Transfection ReagentQiagen301705
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
GFP-SMC1 קו תאים יציב       נוצר ב-KY labref 49 
קו תאים יציב GFP-NEIL2שנוצר במעבדתref 54
GFP-NTH1 קו תאים יציבשנוצר במעבדתref 32
GFP-SMC1 פלסמידשנוצר במעבדת
GFP-Ku פלסמידשנוצר במעבדת
Anti-MDC1 (ארנב)  נובוס ביולוגיNB100– 395
אנטי-gH2AX (ארנב)  Millipore07– 164
EGFP-53BP1(1220-1711) קו תאים יציב PtK2שנוצר במעבדתref 32
TRF2-YFP PtK2 קו תאים יציבשנוצר במעבדתref 32
DMSOSigmaD2650-100ML
מעכב PARGTrevigen4680-096-03
DNA– מעכב PKcs  NU7026 מעכב כספומט SigmaN1537
KU55933  Calbiochem118500
Olaparib Apexbio TechnologyA4154
Paraformaldehyde ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS100503-916 (EA)
כמות תוכנת ניתוח חד-ממדית אחת גרסה 4.6.9Bio-RadSOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC תוכנית ניתוח תמונות
תוכנית הגיליונות האלקטרונייםאקסלמיקרוסופט
Triton X100Fisher ScientificBP151-500חומר ניקוי
מי מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco 10X ללא סידן ומגנזיוםFisher Scientific14200166 לדלל ל-1X 
נוצר במעבדת KY KY KYKY ברנס ברנס של

מקורות

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27(2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135(2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68(2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548(2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219(2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460(2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNAPoly ADP RibosylationPARP
לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.