Method Article

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

DOI:

10.3791/56214

⸱

August 9th, 2017

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיניים מולדות חריגות ואסטתיים משקפים שיבושים בתפקוד הרכס העצבי, אוכלוסיה ארעית של תאי גזע נודדות כי להצמיח סוגי תאים רבים בכל הגוף. הכרת הביולוגיה של הרכס העצבי הוגבלה, המשקף מחסור של מודלים צייתן גנטית שניתן למדה ויוו , בזמן אמת. דג זברה הוא מודל התפתחותי חשוב במיוחד ללמוד אוכלוסיות תאים נודדים, כגון הרכס העצבי. לבחון העברה הרכס העצבי לתוך העין המתפתח, שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של מיקרוסקופ עם אורך גל ארוך פוטון רב זריחה עירור סריקת לייזר בוצע כדי ללכוד וידאו ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של העין לפתח בדג זברה מהונדס עוברי, כלומר Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP), כמו sox10 ו- foxd3 הוכחו במודלים של בעלי חיים רבים כדי לווסת את הבידול הרכס העצבי מוקדם ומייצגים סביר סמנים עבור תאי הרכס העצבי. הדמיה בצילום מואץ פוטון מרובה שימש להבחין את ההתנהגות ואת תבניות הגירה של שתי האוכלוסיות תא של הרכס העצבי, תורם להתפתחות המוקדמת של העין. פרוטוקול זה מספק מידע ליצירת סרטונים בצילום מואץ במהלך ההעברה הרכס העצבי דג זברה, לדוגמה, יכול להיות מיושם עוד יותר להמחיש את הפיתוח המוקדם של מבנים רבים את דג זברה ואורגניזמים אחרים מודל.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות עיניים מולדות עלולה לגרום לעיוורון בילדות, הן לעיתים קרובות בשל ליקויים של הרכס העצבי הגולגולת. תאי הרכס העצבי הם תאי גזע ארעי זה נובעים הצינור העצבי ויוצרים רקמות רבות בגוף. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 תאי הרכס העצבי, נגזר מן prosencephalon ו mesencephalon, להצמיח העצם ואת הסחוס של midface, אזורים חזיתית, איריס, קרנית, trabecular meshwork לבין sclera במקטע הקדמי של העין. 4 , 6 , 7 , 8 תאים הרכס העצבי מן הטופס rhombencephalon שלועיים קשתות, הלסת, יצוא לב בדרכי. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 מחקרים הדגישו את תרומתם של הרכס העצבי כדי עינית ופיתוח periocular, הדגשת החשיבות של תאים אלה בהתפתחות העין חוליות. אכן, שיבוש נדידת תאים הרכס העצבי ובידול להוביל ואסטתיים, עינית החריגות כפי שנצפתה תסמונת Axenfeld-ריגר ותסמונת פיטרס פלוס. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . וכך, הבנה מקיפה של הגירה, התפשטות התמיינות של תאים אלה הרכס העצבי יספקו תובנה המורכבות הבסיסית מחלות עיניים מולדות.

דג זברה היא אורגניזם מודל חזק לומד פיתוח עינית, כפי המבנים של העין דג זברה דומים לכלים המקבילים יונקים, גנים רבים אבולוציונית נשמרים בין דג זברה, יונקים. 18 , 19 , 20 . בנוסף, דג זברה העוברים הם שקופים, oviparous, הקלה על הפריט החזותי של התפתחות העין בזמן אמת.

הרחבת העבודה שפורסמו בעבר,6,7,20 הדפוס הנדידה של תאי הרכס העצבי שתואר באמצעות פוטון רב זריחה זמן לשגות הדמיה בשורות דג זברה מהונדס המסומנת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה תעתיק של זו מדיניות (קביעת מין אזור Y)-תיבת 10 (sox10) או Forkhead תיבת D3 אזורים הרגולציה של ג'ין (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. הדמיה בצילום מואץ פלורסצנטיות פוטון מרובה היא טכניקה עוצמה המשלב טכניקות אופטי מתקדם של מיקרוסקופ עם זמן אורך גל עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי של דגימות המתויגת fluorophores סריקת לייזר. 25 , 26 , 27 השימוש של הלייזר פוטון מרובה יש יתרונות ברורים על פני קונפוקלית רגיל, כולל חדירה לרקמות מוגברת, ירידה fluorophore הלבנה.

באמצעות שיטה זו, שתי האוכלוסיות ברורים של תאי הרכס העצבי משתנה בתזמון של העברת מסלולים נודדות היו תאי הרכס העצבי מאפלייה, כלומר foxd3-חיוביות periocular מזנכימה ועין המתפתח הרכס העצבי sox10-חיוביות תאי מזנכימה ואסטתיים. בשיטה זו, גישה כדי להמחיש את ההעברה של הרכס העצבי ו ואסטתיים ההעברה בדג זברה הוא הציג, ולכן קל להתבונן ההעברה הרכס העצבי מוסדר בזמן אמת במהלך הפיתוח.

פרוטוקול זה מספק מידע ליצירת סרטונים בצילום מואץ במהלך התפתחות מוקדמת העין Tg (sox10:EGFP), דג זברה מהונדס Tg (foxd3:GFP), כדוגמה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עוד יותר עבור הפריט החזותי ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של ההתפתחות המוקדמת של כל מבנה ו ואסטתיים שמקורם בתאי הרכס העצבי דג זברה. יתר על כן, ניתן ליישם שיטה זו נוספת להמחשת ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים דג זברה, דגמים בעלי חיים אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן בוצע בהתאם להנחיות לטיפול הומני בחיות מעבדה שנקבעו על ידי הוועדה של אוניברסיטת מישיגן לשימוש וטיפול בבעלי חיים (UCUCA).

1. איסוף עוברים להדמיית זמן-lapse

  1. בין השעות 15:00 ל-21:00, הקימו דג זברה טרנסגני זכר ונקבה Tg(sox10:EGFP) או Tg(foxd3:GFP) במיכל רבייה מחולק להזדווגות זוגית.
    הערה: דגי Tg(sox10:EGFP) ו-Tg(foxd3:GFP), מתנות נדיבות מתומאס שילינג ומרי הלורן, בהתאמה, הועברו לרקע קספר (רוי -/-, nacre -/-) כדי להפחית את הפלואורסצנציה העצמית והפרעות לפיגמנטציה.
    1. הרכיבו את מיכל הרבייה (מיכל פנימי מחורץ + מיכל חיצוני מוצק) ומלאו אותו במי מערכת אוסמוזה הפוכה (RO).
    2. העבירו עד 3 נקבות ו-3 זכרים לצדדים מנוגדים של המיכל המופרדים על ידי מחיצה; ניתן לגדל עד 6 דגים בזוגות במיכל רבייה אחד.
    3. למחרת בבוקר, הסר את המחיצה זמן קצר לאחר הדלקת האורות בוויווריום.
      הערה: במחקר הנוכחי, האורות דולקים במחזור אור של 14 שעות (דולק בשעה 9 בבוקר) וחושך של 10 שעות (כבוי בשעה 23:00).
    4. אפשרו הזדווגות ללא הפרעה למשך 20 דקות או עד שייווצרו מספר מספיק של עוברים; העוברים יהיו בתחתית מיכל הרבייה. כאשר נצפים ביצים, הרם את המיכל הפנימי המחורר החוצה יחד עם הדגים והנח אותם במהירות (דגים ומיכל פנימי) לתוך מיכל חיצוני מוצק ונקי מלא במי RO.
  2. הכן מדיום עוברי סטנדרטי 1X על ידי הוספת הדברים הבאים לכל 1 ליטר מים RO: 0.287 גרם (4.9 מ"מ) NaCl, 0.127 גרם (0.17 מ"מ) KCl, 0.048 גרם (0.33 מ"מ) CaCl2.2H 2O, 0.04 גרם (0.33 מ"מ) MgSO4 (נטול מים). מערבבים את התמיסה עד להמסה מלאה של המלחים.
    1. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.1% מתילן כחול כקוטל פטריות. הוסף 0.25 גרם נתרן ביקרבונט כדי להתאים את ה-pH ל-7.75. יש לאחסן בינוני בטמפרטורת החדר.
  3. אספו ביצים מהמיכל החיצוני באמצעות מסך לאיסוף ביצים, והעבירו את הביצים לצלחות פטרי (~50 עוברים למנה) המכילות 30 מ"ל של מדיום עוברי 1X. דגרו על הביצים שנאספו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.
  4. הכנת עוברים
    1. עוברי Tg(sox10:EGFP).
      1. עבור עוברי Tg(sox10:EGFP), לאחר 12 שעות לאחר ההפריה (hpf), הסר את הביציות המתות והעריך את השלב ההתפתחותי של העוברים. מסך לעוברים חיוביים ל-GFP באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי מנתח עם מסנן עירור פס סטנדרטי של 460-490 ננומטר. בעזרת מלקחיים, הסר את הכוריון מ-3-4 עוברים המבטאים GFP, והעביר את העוברים הללו לצלחת פטרי נפרדת המכילה 30 מ"ל של מדיום עוברי טרי 1X.
    2. עוברי Tg(foxd3:GFP).
      1. עבור עוברי Tg(foxd3:GFP), ב-22-24 hpf, הסר את הביציות המתות והעריך את השלב ההתפתחותי של העוברים. מסך לעוברים חיוביים באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי מנתח עם מסנן עירור מעבר פס סטנדרטי של 460-490 ננומטר. בעזרת מלקחיים, הסר את הכוריונים מ 3-4 עוברים המבטאים GFP.
      2. הכן תמיסת מלאי 1000X Phenylthiourea (PTU) על ידי המסת 0.75 גרם (3%) של PTU ב-25 מ"ל של דימתיל-סולפוקסיד (DMSO). שים ואחסן את תמיסת המלאי ב-4 מעלות צלזיוס. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת מלאי 1000X PTU (3%) ל-30 מ"ל של מדיום עוברי 1X כדי ליצור תמיסת PTU של 0.003%.
      3. הנח את העוברים החיוביים ל-GFP שהוקרנו ועברו דה-כוריון בתמיסת PTU של 0.003% כדי לעכב פיגמנטציה. אין להתחיל טיפול בעוברים עם PTU לפני 20 hpf, מכיוון שטיפול מוקדם (ב-<20 hpf) יכול להיות בעל השפעות שליליות על הפסגה העצבית והתפתחות הנוירו-אפיתל. 28
    3. לפני ביצוע ניסוי הזמן-lapse, עקוב אחר העוברים באמצעות הדמיה חיה באמצעות סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי במרווחים של 12-24 שעות בהשוואות מותאמות גיל כבקרה על סחף הטמפרטורה.

2. הרכבת עובר להדמיית זמן-lapse

  1. הכנת מדיה עוברית בזמן-lapse
    1. הכן תמיסת מלאי טריקאין סטנדרטית של 0.4% על ידי הוספת 0.004 גרם טריקאין ל-100 מ"ל מי RO. Aliquot (~1 מ"ל) את תמיסת המלאי לצינורות צנטריפוגה טריים של 1.5 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. הכן מדיום עוברי זמן-lapse (50 מ"ל של מדיום עוברי 1X, 0.016% טריקאין) על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת טריקאין 0.4% ל-48 מ"ל של מדיום עוברי 1X. אם משתמשים בעוברים >22 hpf, הוסף גם 50 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PTU 3% (ריכוז סופי.003% PTU) למדיום העובר.
  2. הכנת אגרוז נמס נמוך 2%
    1. הוסף 0.4 גרם אבקת אגרוז נמסה נמוכה ל-20 מ"ל של מדיום עוברי 1X. מחממים 1-2 דקות או עד שהתמיסה צלולה וכל החלקיקים מומסים.
      הערה: הגדלת אחוז ג'ל האגרוז מפחיתה את נקבוביות המטריצה, מה שעלול לעכב פיזית את צמיחת העובר והתפתחותו. לכן, ניתן להוריד את תמיסת האגרוז ל-1.5% כדי למזער את ההשפעות הללו. עם זאת, כאשר קרן העירור מוחזקת נייחת במהלך מיקרוסקופ סריקת לייזר, יכול להתרחש חימום גדול יותר, הגדל במהירות בקשר לוגריתמי עם הזמן. בפרוטוקול זה, חימום עקב ספיגת פלואורופור ממוקם מאוד לאזור המוקד. לפיכך, באזור העניין, הטמפרטורה יכולה לעלות לערך גבוה מספיק (≥ 30 מעלות צלזיוס) כדי להמיס תמיסות אגרוז המיוצרות באחוזים נמוכים מ-1.5, ובכך לחשוף ישירות את העובר ללייזר או לאפשר תנאים שבהם העובר צף מחוץ למישור המוקד. מסיבה זו, השימוש בתמיסות אגרוז נמוכות מ-1.5% אינו מומלץ.
    2. Aliquot (~1 מ"ל) את תמיסת האגרוז לצינורות צנטריפוגה טריים של 1.5 מ"ל לאחסון. אחסן עודפי תמיסת אגרוז בצורה נוזלית על גוש חום (60-70 מעלות צלזיוס) למשך 2-3 שבועות.
  3. הרכבת העובר
    1. כדי להגדיר את תא האמבטיה הפתוח, הניחו כמות קטנה של שומן ואקום גבוה על בסיס תא האמבטיה הפתוח. הנח כיסוי זכוכית עגול על הבסיס והברג את החלק העליון של תא האמבטיה הפתוח על הבסיס עד להידוק (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A, B).
    2. פיפט (~500-700 מיקרוליטר) של תמיסת אגרוז 2% (60-70 מעלות צלזיוס) לתוך תא האמבטיה הפתוח עד שהבסיס מתמלא ~3/4 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1C). שימו לב שברגע שתמיסת האגרוז נמצאת בתא האמבטיה הפתוח על ספסל המעבדה, טמפרטורת התמיסה יורדת בכ-1 מעלות צלזיוס לשנייה.
    3. המתן 30 שניות כדי לאפשר לאגרוז להתקרר מעט (~30-40 מעלות צלזיוס), מבלי להתפלמר לחלוטין, ולאחר מכן להעביר עובר בודד למרכז הבסיס (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1D, E).
    4. תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, מקם את העובר באמצעות קצה מיקרופיפטה של 1-10 מיקרוליטר וודא שהעובר ממוקם ליד תחתית האגרוז, מכיוון שהעובר עלול לצוף כאשר הוא מכוסה במדיה עוברית אם הוא ממוקם קרוב מדי לפני השטח של האגרוז.
      הערה: בסרטונים המוצגים (סרטונים 1-3), העוברים מכוונים לרוחב, אך בהתאם לתחום העניין, ניתן לכוון את העוברים לכיוון הגחון או הגב.
    5. עקוב אחר העובר ומקם אותו מחדש עד שהאגרוז יתייצב. לאחר שהאגרוז התייצב, השתמש בצינור העברה כדי למלא את החדר הפתוח המורכב כולו במדיה עוברית עם זמן-lapse (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1F).
    6. הנח את תא האמבטיה הפתוח בפלטפורמת ההחלפה המהירה, המתאימה ל-tagמתאם ( איור 1G). הנח את כל המערך (עובר, תא אמבטיה פתוח, פלטפורמת החלפה מהירה ומתאם במה) על במת המיקרוסקופ מיד מעל המעבה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1H).

3. הגדרת מיקרוסקופ להדמיית זמן-lapse

  1. קביעת הגדרות לייזר
    1. קביעת אורך גל לייזר לשימוש. השתמש באורך גל שהוא כפול מאורך גל העירור של הפלואורופור המעניין (למשל אורך גל בין 880 ל-940 ננומטר עבור GFP).
      הערה: במחקר הנוכחי, הגדרת אורך הגל עבור GFP הייתה בין 880 ל-940 ננומטר. ככל שאורך הגל גבוה יותר, כך הספק המוצא של הלייזר נמוך יותר.
    2. קבע העברת לייזר. אחוז גבוה של העברת לייזר יהרוג את העובר, השתמש ברמת ההעברה הנמוכה ביותר (מומלץ). עבור מחקרי זמן-lapse של 24 עד 48 שעות, כפי שמוצג כאן, שמור על העברה מתחת ל-5%.
    3. קבע מערכות זיהוי מיקרוסקופ וודא שהמסננים הנכונים עבור הפלואורופור נמצאים במקומם.
      הערה: עבור מיקרוסקופים מרובי פוטונים, ישנן מערכות גילוי מרובות עם רגישויות שונות לפלואורסצנטיות הנפלטת. באופן כללי, למערכת גילוי פנימית יש פחות רגישות מאשר למערכת גילוי חיצונית. עבור קווים טרנסגניים עם רמות גבוהות של ביטוי GFP, מערכת הזיהוי הפנימית מספקת. עבור קווים טרנסגניים עם רמות נמוכות של ביטוי GFP או עם פלואורופורים אחרים (למשל, חלבון פלואורסצנטי אדום), ייתכן שתידרש מערכת זיהוי חיצונית כדי לשמור על אחוז העברת הלייזר ברמה סבירה. ללא קשר למערכת הזיהוי המשמשת, המסננים הנכונים לפלואורופור חייבים להיות במקום.
  2. התאמת הגדרות תוכנה במיקרוסקופ הרב-פוטוני
    1. באמצעות המטרה 5X, אתר את העובר. הרם ידנית את הבמה למיקום הגבוה ביותר, והשתמש במיקוד העדין כדי למקם את העובר באמצע טווח המיקרוסקופ.
    2. הורד ידנית את הבמה, ושנה את יעד ה-5X ליעד הטבילה במים פי 25 (צמצם מספרי NA, 0.95). הרם בזהירות את הבמה כדי להחזיר את העובר לפוקוס.
    3. בתוכנה, לחץ על מצב "xyzt" להשגת תמונות מרובות במרווחי זמן (t) במישור xy על פני עומק של "z". השתמש בתצוגת האפיפלואורסצנציה או השדה הבהיר כדי למצוא את עומק המיקוד באזור העניין, אשר יתחם את מחסנית ה-Z.
      1. בתוכנה, לחץ על כפתור "התחל"; עבור ניסויים אלה, הקצה הצדדי של העין היה תחילתה של מחסנית Z. לחץ על כפתור "סיום"; קו האמצע של העובר היה קצה ערימת ה-Z.
        הערה: גודל הצעד היה 0.3-0.6 מיקרומטר והיו בסך הכל ~200 צעדים עבור גודל מחסנית z של 60 עד 120 מיקרומטר).
    4. לחץ על התפריט להתאמת זמן הרכישה ותדירות ההדמיה. עבור המערכת הנוכחית, ~200 שלבים דורשים כ-5 דקות עבור כל רכישת z-stack. להתאוששות נאותה של הפלואורופור והישרדות העובר, אפשר יחס של לפחות 1:3 בין רכישת z-stack (הפעלת לייזר) לזמן ההתאוששות (כיבוי לייזר).
      הערה: לדוגמה, ערימות z נרכשות כל 20 דקות עם 5 דקות של רכישת z-stack ו-15 דקות של התאוששות. עבור פרוטוקול זה, ניתן להשיג ערימות z גדולות יותר, אך יגדילו כראוי את הזמן בין רכישות z-stack, וכתוצאה מכך פחות תמונות לאורך מהלך ה-time-lapse.
      1. עם הזמן המתאים להתאוששות העוברים, הגדר את הזמן בין ערימות z בחלון המיועד. הגדר את משך הזמן הכולל עבור הניסוי בחלון המתאים.
    5. התאמות סופיות של תוכנה, לייזר ועוברים.
      1. הפעל את הגדרת התמונה החיה כדי לבצע התאמות סופיות בהגדרות הלייזר. כוונן את שידור הלייזר (ראה 3.1.2), פסי מחוון הגבר והיסט בתוך התוכנה כדי לייעל את התמונה הפלואורסצנטית. כמו כן, התאם את כיוון העובר, לפי הצורך, בהתאם לאורך הניסוי, הצמיחה הצפויה של העובר וכו '. ודא שאזור העניין נשאר בתוך המסגרת לאורך כל הניסוי.
      2. כבה את מקור האור האפיפלואורסצנטי מכיוון שהוא כבר לא נחוץ במהלך רכישת זמן-lapse. כסו את הבמה עם קופסת הבטיחות בלייזר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1I). בעת שימוש במערכת הזיהוי הפנימית, תיבת הבטיחות בלייזר מתאימה להגנה מפני אור רקע. לחץ על "התחל".
        הערה: עם זאת, עם מערכות זיהוי חיצוניות רגישות יותר, תיבת הבטיחות לייזר אינה חוסמת מספיק אור רקע, ונדרשים כיסויים נוספים כדי למנוע הפרעה ברכישת התמונה.

4. במהלך רכישת זמן-lapse

  1. מלאו מחדש את תא האמבטיה הפתוח במדיה עוברית דולג זמן כל 8-12 שעות (לפחות פעמיים ביום) במהלך רכישת זמן-lapse דרך דלתות ההזזה בקופסת הבטיחות בלייזר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1I).
  2. לפני פתיחת דלתות תיבת הבטיחות בלייזר, ודא שהמיקרוסקופ אינו רוכש באופן פעיל תמונה.
    הערה: השימוש בתנורי חימום ובמערכות מדיה במחזור אינו הכרחי לניסויי הדמיה בזמן-lapse הנמשכים 24 עד 48 שעות. ואכן, קשה לשלוט בטמפרטורות של תנורי חימום בשלב ובשורה, ובמהלך רכישת התמונה העובר מפגין קצב התפתחות הולם בטווח טמפרטורות שבין 25-28 מעלות צלזיוס. יתר על כן, מערכות מדיה במחזור נוטות לעלות על גדותיהן ועלולות לפגוע בציוד. לפיכך, כל העוברים מבוימים באופן שגרתי לאחר הרכישה.

5. עיבוד לאחר הרכישה

  1. בתוכנה, לחץ על תפריט "קובץ" ובחר "שמור".
  2. פתח את הקובץ בתוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת החומרים). הדגש את סדרת התמונות הנכונה. בתוכנה, בחר בתפריט "תהליך". לחץ על 3D Deconvolution ו-"Apply" כדי לבטל את הפיתול של כל z-stack.
    הערה: הקובץ גדול; לכן, שלב זה עשוי להימשך שעות רבות.
  3. בתוכנה, תחת תפריט "תהליך", לחץ על "הקרנה מקסימלית". לחץ על "החל" כדי ליזום הקרנה מקסימלית ליצירת תמונה אחת לכל ערימת z. ייצא כל קובץ מוקרן מרבי (תמונה אחת לכל ערימת z) כ-tiff.
  4. ייבא קבצי tiff בודדים לתוכנת עיבוד וידאו. בחר את כל קבצי ה-tiff וגרור אותם לעורך הווידאו. התאם את האורך של כל תמונה בסרטון ל-0.1 שניות. ייצא וידאו כקובץ mov או mp4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה בצילום מואץ פוטון רב זריחה להפיק סדרה של קטעי וידאו שגילה את דפוסי ההגירה של תאי הרכס העצבי הגולגולת להצמיח המקטע הקדמי של העין Tg (sox10:EGFP), Tg (foxd3:GFP) ודפי ואסטתיים דג זברה קווים. לדוגמה, העברת sox10 -תאי הרכס העצבי חיובי בין 12 ו-30 hpf מן הקצה של הצינור העצבי לתוך האזור ואסטתיים (Video 1, איור 2). תאי prosencephalon, mesencephalon להעביר הגבי ו הגחון לעין המתפתח כדי לאכלס את מזנכי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה בצילום מואץ פוטון מרובות מאפשרת ויוו המעקב של אוכלוסיות תא ארעי, נודדים. טכניקה חזקה זו ניתן ללמוד תהליכים עובריים בזמן אמת, במחקר הנוכחי, התוצאות של שיטה זו משופרת הידע הנוכחי של נדידת תאים הרכס העצבי ופיתוח. מחקרים קודמים הדמיה בצילום מואץ לנצל בדרך כלל סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. 29 , 30 , 31 , 32 . כאן, אנו מציגים את השימוש טכניקה פוטון מרובות, שבו יש יתרונות רבים על פני ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה כלכלית באמצעות מענקים מן העין המכון הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים (K08EY022912-01) ואת החזון לחקר הליבה (P30 EY007003).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים תומאס שילינג על בחביבות gifting של Tg (sox10:eGFP)-דגים, מרי הלורן עבור הדג(foxd3:GFP) Tg gifting בחביבות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיכלי גידול עם חוצציםחציית ZHCT100 Aquaneering(1.0 ליטר) פוליקרבונט שקוף עם מכסה והכנסה
M205 FA Combi-ScopeLeica Microsystems CMS GmbHמיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי - FusionOptics ו-TripleBeam
נתרן כלורידMillipore (EMD)7760-5KGשק PE כפול. CAS מס' 7647-14-5, מספר EC 231-598-3
אשלגןכלורי Millipore (EMD)1049380500אשלגן כלורי 99.999 Suprapur. CAS מס' 7447-40-7, מספר EC 231-211-8.
סידן כלוריד דיהידראטפישר סיינטיפיקC79-500; 500 גרם CAS מס' 10035-04-8
בקבוק פולי מגנזיום סולפט (נטול מים)Millipore (EMD)MX0075-1500 גרם CAS מס' 7487-88-9, מספר EC 231-298-2
בקבוק זכוכית מתילן כחול(EMD)284-12; 25 גרם אבקה, כתם ביולוגי מאושר
נתרן ביקרבונטמיליפור (EMD)SX0320-1בקבוק פולי; 500 גרם. אבקה, GR ACS. CAS מס' 144-55-8, מספר EC 205-633-8
N-PhenylthioureaSigmaP7629-25G>98%. מספר CAS 103-85-5, מספר EC 203-151-2
DimethylsulfoxideSigmaD8418-500MLכיתה ביולוגיה מולקולרית. מספר CAS 67-68-5, מספר EC 200-664-3
Tricaine MethanesulfonateWestern Chemical Inc.MS222Tricaine-S
Agarose נמס נמוךISC BioexpressE-3112-25GeneMate מסננת GQA אגרוז נמס נמוך, 25 גרם
תא אמבטיה פתוחWarner InstrumentsRC-40HP
כיסויי זכוכיתFisher Scientific12-545-102כיסוי מעגל. קוטר 25 מ"מ
שומן ואקום גבוהFisher Scientific14-635-5Cצינור במשקל 2.0 ק"ג. DOW CORNING CORPORATION
1658832
פלטפורמת החלפה מהירהוורנר אינסטרומנטסQE-135 מ"מ
מתאם במהוורנר אינסטרומנטסSA-20LZ-AL16.5 x 10 ס"מ
TC SP5 MP מיקרוסקופ רב פוטוניםLeica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire לייזרספקטרה פיזיקה
לייזר כספתLeica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  תוכנהLeica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 גרסה 13.0 x64 תוכנהAdobe
iMovie גרסה 10.1.4 תוכנהאפל
סט מיכל בקבוק פולי ; בפרופיל גבוה זכוכית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
  2. Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
  3. Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
  4. Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
  5. Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
  6. Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
  7. Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
  8. Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
  9. Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
  10. Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
  11. Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984(2010).
  12. Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
  13. Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
  14. Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
  15. Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
  16. Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
  17. Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
  18. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  19. Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
  20. Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
  21. Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
  22. Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
  23. Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
  24. Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
  25. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  27. Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  28. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991(2011).
  29. Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525(2013).
  30. Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
  31. McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  32. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Photon ImagingTime Lapse MicroscopyNeural Crest CellsZebrafish EmbryosSox10 EGFPFoxd3 GFPLaser Scanning MicroscopyFluorescence ImagingEmbryo MountingZ Stack Acquisition

Related Articles