מאמר שיטה

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

DOI:

10.3791/56218

⸱

30 באוקטובר 2017

 ,  , 
1Laboratory of Biochemical Genetics and Metabolism, The Rockefeller University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימוטקסיס הוא העברה לאורך כימי מסוים מעבר צבע1. נוגדנים הם ציטוקינים chemotactic לקדם סחר הסלולר עם ירידה לפרטים אנטומיים, זמני2. כימוטקסיס הוא פונקציה קריטית של לימפוציטים, תאים חיסוניים אחרים זה יכול להיות באופן כמותי מוערך ב חוץ גופית. כתב יד זה מתאר שיטות המתירים הערכת כימוטקסיס, גם במבחנה וגם ויוו, עבור סוגי תאים מגוונים כולל שורות תאים ותאים מקורית. ה במבחנה, עיצוב מבוסס על צלחת מאפשר השוואת בו-זמנית בתוך מספר תנאים בזמן אמת, ואת יכולה להסתיים תוך 1-4 ח' במבחנה assay תנאים ניתן לטפל להציג אגוניסטים ו antagonists, כמו גם להבדיל כימוטקסיס chemokinesis, וזו תנועה אקראית. עבור ויוו הערכות סחר, תאים חיסוניים יכול להיות עם צבעי פלורסנט מרובים תוויות, המשמש להעברת המאמצת. תיוג דיפרנציאלית של תאים מאפשר לאוכלוסיות לתא מעורב להיות מוחדרים החיה אותו, ובכך להקטין את השונות, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים עבור ניסוי מופעל כראוי. הגירה לתוך רקמת הלימפה מתרחשת בתוך פחות משעה ולאחר מספר תאי רקמות ניתן לטעום. Cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות מאפשר ניתוח מהיר ולא כמותית של דפוסי הנדידה סוגי תאים מרובים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חסינות חסון דורש התיאום הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית מורכב של מספר עצום של סוגי תאים על מנת להגיב כראוי על פציעה, זיהום, ליצור self-tolerance. מספר הקולטנים כימוקין עשרות וליגנדים המקביל שלהם התגלו, המנגנונים המולקולריים מתן מאופיין על ידי אילו תאים מסוים ויכולה להיות מכוונת לתוך רקמה ספציפית בזמן מסוים. לפיכך, לומד כימוטקסיס והעברה היא מרכיב הכרחי של מחקר באימונולוגיה. אכן, וזמינותו שתואר במבחנה לאחרונה שימשה ככלי מיון לזיהוי קופקטור chemotactic שמאיץ כימוטקסיס של תאי-T לכיוון נוגדנים 19 ו- 21 C-C3. מטרת בשיטות המתוארות כאן הם להתיר הערכות כמותיות של תאים חיסוניים כימוטקסיס במבחנה , בתוך vivo.

וזמינותו קאמרית בוידן (נדידת תאים, הפלישה) היא שיטה זולה, הדירים מהירה להערכת תא העברה4,5. ב וזמינותו סטנדרטי, התא העליון הוא נזרע עם תאים, מופרדת באמצעות הוספה נקבובי מ. התא התחתון, שאליו העברת התאים. בזמן הרצוי, תאים היגרו בצד התחתון של הקדמי יכול להיות קבוע, עבור כימות מוכתמת מיקרוסקופ אור. אולם, מדידות כאלה להגביל איסוף נתונים נקודת סיום יחיד, שמונע את איסוף נתונים דינאמי, באפשרותך לדרוש אופטימיזציה מקיפה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלי לניתוח. . הנה, מספר עיבודים מתוארים כי היתר בזמן אמת, כמותיים, מרובבת מדידות של כימוטקסיס במבחנה.

ללימודים ויוו , משמש נקודת סיום פונקציונלית, כלומר הצטברות תאים בתא רקמות נתון ספציפי. תאי התורם מראש שכותרתו יוכנסו חיות נמען באמצעות העברת המאמצת. אלה בתאי התורם לאחר מכן ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות הנמען. הציג גם היא אסטרטגיה משותפת תיוג המאפשר קביעת סחר לסוגי תאים שונים בתוך חיה נמען בודד. שיטה זו מבטלת את הווריאציה בין בעלי חיים הזרקת תאים, ואת חשבונות עבור הפיזיולוגיות השתנות בין בעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו על-ידי אוניברסיטת רוקפלר ' s אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. כל החיות שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.

1-ב חוץ גופית כימוטקסיס

  1. תרבות THP-1 תאים 6 בשנת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI 1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 מ מ) (להשלים מדיה), שמירה על הצפיפות בין 0.5-1.0 x 10 6 תאים למ"ל.
    2. צלחת
  2. תרבית תאים 35 מ מ, תווית 3.5 x 10 תאים 5 THP-1 לכל תנאי עם acetoxymethyl calcein (calcein-אם; 2.5 מיקרומטר) או אחרים מתאימים הפלורסנט בתקשורת מלאה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
    הערה: צבעי חייב להיות קרום התא-חדיר ותואמת לחיות תאים תיוג.
  3. חם מראש קורא צלחת כדי 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: בנוסף בקרת טמפרטורה, פונקציונליות התחתון-קריאה נדרש גם. ראה שלב 1.10.2 עבור אלטרנטיבה קורא צלחת על כימות של נדידת תאים.
  4. בעוד תאים הם תיוג, להכין את צלחת assay והרכבים נמוך. צלחת
    1. שימוש בתרבות רקמה 24-. טוב, בתנאי אחד לכל טוב. לבצע כל תנאי דולר.
    2. 750 להוסיף µL של האנק ' s Buffered תמיסת מלח (HBSS) באגירה מלאה עם 25 מ מ HEPES ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) לצלחת 24-. טוב. זה משמש התנאי שליטה הבזליים.
      1. שימוש אחרים בארות תנאים השוואה, תמיד שמירה לנפח הכללי בתא התחתון-750 µL.
        הערה: בדוגמה זו, האדם מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) משמש הפקד חיובי עבור כימוטקסיס 7.
        1. להרכיב התערובת מגיב על-ידי שילוב HBSS עם 25 מ מ HEPES, BSA (0.1%) ו MCP-1 (75 ng/mL). להשתמש בסרום שור למבוגרים (2.7% v / v) עם MCP-1 כפקד חיוביים נוספים של.
          הערה: ריכוז כימוקין כימוקין יהיה תלוי על ציר chemotactic במחקר. Lyophilized MCP-1 resuspended מים מזוקקים עם BSA (0.1%) כדי להפוך פתרון מניות עם ריכוז סופי של 50 μg/mL. זה יכול להיות מדולל במים לפתרון עבודה של 10 μg/mL. להוסיף 5.6 μL של פתרון זה לתא התחתון.
    3. בתום ההרכב של התאים התחתון, במקום הוספה נקבובי כל טוב, ולהבטיח הכרטיסיות של הקדמי ליישר עם החריצים של הצלחת-
      הערה: בחר את גודל הנקבוביות המתאים עבור מוסיף. עבור ומונוציטים ו לימפוציטים, גודל הנקבוביות של 3 μm מבצע טוב. כמה סוגי תאים ו/או מערכות כימוקין עשויים לדרוש משטח מצופה מטריקס עבור העברה אופטימלית. לדוגמה, למדידת THP-1 כימוטקסיס מונוציט לכיוון MCP-1, fibronectin או מוסיף מצופים קולגן מומלצים. צלחת קורא עבור כימות, הוסף חייבת להיות ציפוי impermeant-אור, כגון פוליאתילן terephthalate, כדי למנוע גילוי של אי-העברת תאים העליונה הקאמרית 8.
  5. לאחר המקננת תאים למשך 30 דקות עם calcein-AM, להעביר תא ההשעיה צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה תאים ב- 1000 g x עבור 2 דק לבדוק חזותית תאים כדי לאשר ספיגת של calcein-אם ( איור 1).
  6. הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק. רחץ תאים עם תוויות ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
  7. Resuspend תאים ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. לספור תאים, לכוונן את עוצמת הקול כך התאים נמצאים ריכוז סופי של 1.0-1.5 x 10 6 תאים למ"ל.
  8. 250 לוותר על μL של התליה תא לתוך תותב (העליון קאמרית).
  9. לאחר כל צ'יימברס העליון היו מלאים, בעדינות להרים את הצלחת לבדוק את החלק התחתון לנוכחות של בועות אוויר שעלולות לפגוע ההעברה וזיהוי. כדי להסיר בועה, נסה תחילה הסרת ואז מיצוב מחדש את תותב. אם לא מוצלח, שימוש במחט 27 G לנקב את הבועה ולאחר מכן מקם מחדש את תותב.
  10. למקם את הצלחת לקורא צלחת מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס.
    1. רכוש קריאות קרינה פלואורסצנטית מלמטה במרווחים 1-3 דקות. בעת השימוש calcein-AM, הגדר קרינה פלואורסצנטית אורכי גל עירור, פליטה-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. בהתאם למערכת כימוקין וסוג התא, כימוטקסיס מתרחשת בדרך כלל יותר מ 1-4 h ( איור 2 א).
    2. כחלופה מדידות רציף באמצעות קורא-צלחת, תמונה הבארות באמצעות הפוכה פלורסנט במיקרוסקופ ( איור 2B) מסוגל עירור וזיהוי של אור-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. השתמש הגדלה נמוכה כדי ללכוד את רוב החלק התחתון של הקדמי. לכמת תאים על-ידי עיבוד התמונות עם ImageJ או תוכנה דומה 9.

2. המאמצים העברה של מאתר לימפוציטים

  1. הכנה תאי התורם
    1. Anesthetize בשבוע 8-12-C57BL/6J הישן תורם זכר עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של. לאשר עומק ההרדמה המתאימה על ידי הבוהן-קמצוץ.
    2. הנח את העכבר במצב פרקדן. עושים חתך קו האמצע עם איזמל ואתר הטחול בחלל הצפק השמאלי העליון. לסלק כל הטחול, למקם את המדיה מלאה (RPMI בתוספת 10% FBS עד 25 מ מ HEPES; 1 mL/טחול) על קרח. המתת חסד התורם מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש.
    3. לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה (1 מ"ל /spleen) באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-
    4. להוסיף 4 כרכים של אמוניום כלוריד האשלגן (ACK) פירוק מאגר ואת תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי lyse אריתרוציטים.
    5. Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע. אם אריתרוציטים נשארים בגדר, resuspend במאגר פירוק ACK, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    6. Resuspend התאים בתקשורת מלאה-ריכוז של 2-5 x 10 7 תאים למ"ל, ואז מסננים התליה תא דרך רשת ניילון 40 µm כדי להסיר שאריות תאים.
    7. תווית 1 x 10 7 תאים/נמען עכבר עם תואם הפלורסנט חיים תאים, זה יוסיף להישמר על קיבוע עוקבות, כגון 5-chloromethylfluorescein diacetate (ריכוז סופי 2 μM) 10 . דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
      הערה: כדי לעקוב אחר אוכלוסיית תא אחד או יותר, השתמש אחרים צבעי פלורסנט עם אוכלוסיות תאים נוספים. For example, חלק של תאי התורם יכול להיות מסומן באמצעות בנזואיל 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) אמינו) tetramethylrhodamine (ריכוז סופי 2 μM) 11-
    8. להוסיף 4 כרכים HBSS בתוספת 25 מ מ HEPES, ולאחר מכן צנטריפוגה ב g 1,000 x עבור 2 דקות ו להשליך תגובת שיקוע. Resuspend צנפה ב HBSS בתוספת HEPES 25 מ"מ עד ריכוז סופי של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ל....
      1. אם משתמש אחד או יותר הפלורסנט, לשמור על אוכלוסיות תאים מופרדים עד מייד לפני הזרקת.
      2. העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים של כל צבע פתרון מקבע (1 מ"ל) פיצויים cytometry זרימה עוקבות.
  2. העברה של לימפוציטים
    1. עזים ומתנגד בשבוע 8-12-בת C57BL/6J זכר הנמען עכברים עם איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. חלות וטרינרי משחה חיה ' s עיניים כדי למנוע ייבוש.
    2. בקצרה מערבולת תורם תאי (1 s), העברת 1 מ"ל הזרקת מזרק עם G 27, 0.5 ב המחט, שילוב אוכלוסיות תאים עם תוויות באופן שונה, אם הדבר ישים.
      1. העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים מעורב פתרון מקבע (1 מ"ל) עבור ניתוחים cytometry זרימה עוקבות.
    3. מקום חיות לתורם בשכיבה. הפעילו לחץ מתון סימטרית על העור הגבי לעין, גורם של גלגל העין לבלוט מעט.
    4. לכוון את המחט medially, להזריק 100 µL של התורם תא השעיה רטרו-orbitally לתוך עכבר לכל הנמענים. גם יכול להיות מוזרק התאים דרך הווריד זנב של.
    5. בהדרגה לשלוף את המחט הזרקה, הנח העכבר לבד בתוך כלוב ההתאוששות. צג חיה עד זה שהכרתו; שהחלמת באופן מלא פעם לשוב החיה דיור חברתי.
  3. איסוף וניתוח
    1. לאחר 1 h, עזים ומתנגד הנמען עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. הקציר הטחול (או רקמות אחרות עניין) (שלב 2.1.2.) של כל הנמענים העכבר ומקום לתוך המדיה מלאה (mL/נמען 1). המתת חסד מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש.
      הערה: מרווחי לפני הקציר רקמות יגדל הצטברות רקמת דרך לפחות 24 ח'
    2. לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-
    3. להוסיף 4 כרכים של פירוק ACK מאגר, דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge התליה תא ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.
      4. מאגר
    4. תאים resuspend מכתים (תמיסת מלח באגירה פוספט בתוספת 1% FBS). לספור תאים ולהתאים את ריכוז הסופי של 3 x 10 7 תאים/מ ל.... להעביר 100 µL תא השעיה 96-ובכן סביב הצלחת התחתונה.
    5. הכתם תאים עבור סמני הרצוי (ראה טבלה של החומרים) לניתוח על ידי cytometry זרימה. מוסיפים נוגדנים fluorophore מצומדת (ראה טבלה של החומרים) נגד הסמנים הרצויים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. להוסיף 100 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    6. Resuspend בגדר ב 200 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.
    7. Resuspend בגדר ב 125 µL מכתים מאגר ולרכוש דוגמאות שימוש cytometer זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים.
      הערה: הצבע הירוק הוא נרגש על ידי 488 ננומטר לייזר, הפליטה ומתגלה עם מסננים ודיקרואיק זוהר 505 ו- 530/30. הצבע הכתום נרגש 561 nm ו הפליטה מזוהה באמצעות מסנן ודיקרואיק זוהר 582/15.
      1. שימוש הציל תאים מכל 2.1.8.2 כדי לפצות על כל הפלורסנט.
        הערה: באמצעות פיצוי מבוסס-חרוז עם fluorophores תואמים את עירור ואת ספקטרום הפליטה של צבעים תיוג תגרום פיצוי שיוצרת.
      2. השתמש תאי קלט ששמרת משלב 2.2.2.1 במדויק לקבוע את היחס שבין באופן שונה עם התווית תאי קלט אם משתמש אחד או יותר שכותרתו האוכלוסייה ( איור 3). לחשב רקמות ספציפיות ההעברה המבוססים על היחס של תווית לתאים ללא תווית ( איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת שימוש calcein-אם צבע, בדיקה ויזואלית של תאים יאשר תווית ספיגת (איור 1). קריאות פלורסנט אוטומטיות יעקבו הגירה כמו תאי המעבר אל החלק התחתון של הקדמי לאורך זמן. נתונים אלו מראים בבירור אינדוקציה של נדידת תאים לכיוון MCP-1, כמו גם על הגדלת של תגובה זו על ידי סרום (איור 2 א). בהתאם על כוחו של הגירוי נודדות, יש פער לפחות 15 דקות לפני עלייה אות. האות פלורסנט ייתכן שיא ולאחר מכן בהדרגה ירידה. זה מייצג ירידה נטו מספר התאים הקפדה על הח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימות של נדידת תאים חיסוניים יכול להתבצע באמצעות פשוטה, מהירה מבחני גם בתוך vitro וגם ויוו. נדגים את כימוטקסיס במבחנה של ומונוציטים האדם בתגובה שיפוע MCP-1 ו הגדלת מאת סרום. In vivo, splenocytes מאתר התורם באופן שונה עם תווית, בעקבות העברת המאמצת, ששוחזרו מחיות הנמען.

שימוש בקורא צלחת יש את היתרון של דגימה מספר נקודות זמן (לעתים קרובות כמו כל 30 s) אוטומציה של כימות של העברת תאי. זה obviates הצורך לבחור נקודה פעם והערכת הימנעות שיטות יותר שדורשת ספירה ידנית ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית ברנרד שוורץ ל' עבור הרופא מדענים האוניברסיטה רוקפלר, הקרן לפיתוח טיפולית רוברטסון באוניברסיטה רוקפלר, ואת מרכז ע ש סאקלר וההתערבות ומחקר תזונה- אוניברסיטת רוקפלר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific11875-093
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
סרום בקר עובריATCC30-2020
בקבוק תרבית תאיםCorning353136
Calcein AMThermo Fisher ScientificC1430עירור: 485 ננומטר, פליטה: תא 520 ננומטר
צלחת תרבותקורנינג1007
צלחת 24 בארקורנינג353504
פלואורובלוק פיברונקטין הכנסקורנינגCB354597
צינור חרוטי 15 מ"לקורנינג352097
סרום בקר אלבומיןטכנולוגיית איתות תאים9998S
רקומביננטי אנושי MCP-1Peprotech300-04
סרום בקר למבוגריםSigmaB9433
HBSS עם סידן ומגנזיום; ללא פנול אדוםThermo Fisher Scientific14025-092
קורא צלחות SpectraMax M2eמולקולריים
אולימפוס IX71 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךאולימפוס
איזותזיההנרי שיין בריאות בעלי חיים11695-6776-2הרדמה איזופלואורן
מסננת תאים 40um ניילוןFalcon Corning352340
ACK מאגר ליזינגאיכותי ביולוגי118-156-101
CellTracker כתום CMTMR צבעThermo Fisher ScientificC2927עירור: 541 ננומטר, פליטה: 565 ננומטר
CellTracker ירוק CMFDA צבעתרמו פישר מדעיC2925עירור: 485 ננומטר, פליטה: 520 ננומטר
5 מ"ל מזרקמזרק BD309646
מזרק TB 1 מ"ל מזרקBD 309625
קו תאים THP-1 ATCCTIB-202
סגול מבריק 421 נגד עכבר CD3 נוגדן100228עירור: 405 ננומטר, פליטה: 421 ננומטר
סגול מבריק 605 נגד עכבר CD19 נוגדןBiolegend115540עירור: 405 ננומטר, פליטה: 603 ננומטר
צלחת תחתונה עגולה 96 בארותCorning353077
LSRIIBD Biosciencesזרימה ציטומטר
מכשירים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
  2. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  3. Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
  4. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  5. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  6. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  7. Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
  8. Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
  9. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  10. Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
  11. West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
  12. Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VitroIn Vivo

מאמרים קשורים