הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

13.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56228

⸱

6 באוקטובר 2017

 , 
1Department of Chemistry, W.M. Keck Science Department of Claremont Mckenna, Pitzer, and Scripps College

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

תקציר

עבור כל אנזים, שיטות חזקות, כמותיים נדרשים עבור אפיון של אנזימים הן מקומיים והן מהונדסים. עבור ה-DNA polymerases, לסינתזת DNA ניתן לאפיין באמצעות של במבחנה DNA סינתזה assay ואחריו לזיהוי בג'ל. המטרה של זה וזמינותו היא לכמת סינתזה של דנ א טבעי והן שהשתנו דנ א (M-DNA). גישות אלה שימושיים במיוחד ליישוב oligonucleotides עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית של צעדים בודדים במהלך סינתזה oligonucleotide אנזימטיות. שיטות אלה הוחלו על ההערכה של מערך של ומאפייני הביוכימי biophysical כגון מדידת מצב יציב קצב קבועים של צעדים בודדים של סינתזת ה-DNA, שיעור שגיאה לסינתזת DNA, זיקה מחייבת את הדנ א. באמצעות שינוי רכיבים כולל, אך לא מוגבל, ששונה nucleoside triphosphates (NTP), מ- DNA ו/או מוטציה DNA polymerases, התועלת היחסית של המצע-DNA פולימראז זוגות ניתן להעריך בצורה יעילה. כאן, אנו מפרטים את הבדיקה עצמה, כולל השינויים חייבים להיעשות כדי להכיל את הדנ א תחל אנרגטיקה תיוג אסטרטגיות כגון-סגול fluorescently הנקרא DNA. בנוסף, שתוארו הצעדים הטכניים מכריע עבור ג'ל אקרילאמיד מוזג, פועל, אשר לעתים קרובות ניתן טכנית מאתגר.

מבוא

ה-DNA polymerases לבצע לסינתזת DNA מדויק ויעיל, חיוני לשמירה על תקינות הגנום. היכולת שהמנגנון מאות נוקלאוטידים בשנייה ובלי שגיאות גם עושה כלים חיוניים polymerases DNA ביולוגיה מולקולרית וביוטכנולוגיה. עם זאת, מאפיינים אלה גם להגביל את היישומים של סובסטרטים M-DNA; באופן כללי, polymerases DNA טבעי אינו יכול לסנתז סובסטרטים רבים מ- DNA ערך פוטנציאלי, ככל הנראה בשל כדי לחץ סלקטיבי גבוה נגד שימוש תקני מצעים ויוו. קבוצות רבות פיתחו גישות אבולוציה מכוונת ליצירת מוטציה polymerases DNA מסוגל M-DNA סינתזה1,2,3,4,5; מאמצים אלה הרחיבו את התועלת ביוטכנולוגי של ה-DNA-6,-7,-8.

כדי להעריך את היכולת של מוטציה polymerases DNA לסנתז M-DNA, אנחנו9,10, ועוד11,12,13 בדרך כלל להשתמש במבחנה מדידות של דנ א פעילות פולימראז, אשר מתוארים בכתב היד. בניסויים אלה, DNA polymerases הם incubated משותפת עם תוויות פריימר/תבנית דופלקס ותערובות טריפוספט nucleoside; המוצרים מוערכים על ידי אלקטרופורזה בג'ל. בהתאם ספציפי השאלה ניסיוני, מוטציה DNA polymerases, תחל ששונה, תבניות ששונו או ששונה nucleoside triphosphates יכול לשמש, הפעלת האבחון הביוכימי שיטתית של פעילות האנזים מוטציה.

מבחינה היסטורית, מבחני האלה צריכים לסמוך על 5' רדיואקטיבי בתווית כדי לעקוב אחר לסינתזת DNA; בדרך כלל, היו בשימוש 32P ו- 33P; בדרך כלל, תיוג מושגת באמצעות T4 polynucleotide קינאז11. עם זאת, עקב סופיים שלמים עלות גבוהה יחסית רדיואקטיבי תוויות וסילוק בטוח שלהם, הקבוצה שלנו משתמש במקום זאת סינתטי 5'-סגול fluorophore הנקרא DNA. שימוש של imager ג'ל-סגול בעלות נמוכה יחסית, הבחנו דומה זיהוי גבולות. מחקרים קודמים באמצעות תוויות רדיואקטיבי (שלא פורסמו תוצאות). אנחנו בהצלחה שפירטתי בעבר תצפיות9, לא הבחנו הבדל כמותי גדול עם קצב בעבר נמדד קבועים (שלא פורסמו תוצאות).

כדי לנתח את הגודל של ה-DNA, וכך, היקף לסינתזת DNA, אנו מסתמכים על לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה שיטות שפותחו במקור עבור רצף סנגר14 לפני כניסתו של נימי אלקטרופורזה15. המרחק של ההפרדה או ניידות יכול לשמש יחידת מידה משקל מולקולרי; פורמט גדול, ג'לים לזיהוי אנכי ניתן להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המאפשרים תצפית כמותית של ה-DNA oligonucleotides באורכים משתנים.

באופן קולקטיבי, הניסויים האלה הם שיטה חזקה אפיון פולימראז. לאור הזמן הרגיש של תגובות, הכנה וטיפול הכרחי להשגת תוצאות לשחזור. עוד יותר, ואילו הג'ל אקרילאמיד היא דרך יעילה מאוד למדוד לסינתזת DNA, כמו גם רבים אחרים DNA שינוי תגובות, עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול כאן בתקווה תאפשר למשתמשים לבצע ניסויים אלה תוך הימנעות הטעויות הנפוצות ביותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1-פעילות Assay

הערה: קיימים שני טיפוסי סוגים של מבחני זה פועלים בדרך כלל כדי לאפיין polymerases DNA בשיטות המתוארות כאן. הם נבדלים בין אם הם מאפיינים איכותית הכוללת סינתזה (הכולל שלבים רבים לסינתזת DNA) או אם הם באופן כמותי מתמקדים צעדים בודדים. אנו מתארים את הצעדים הדרושים עבור כל אחד מאלה שלהלן.
הערה: בגלל ההרכבה של חומרים מורכבות יחסית, לניסויים רגיש זמן, אנו ממליצים כי כל החומרים הם מורכבים מראש. המתכונים של כל מרכיבי וזמינותו קריטי מפורטים להלן. ספקים מסחריים עבור הרכיבים המפורטים בטבלה של חומרים.

  1. 10 x SF מאגר מתכון (10 x SFB)
    הערה: מבחני שלנו, אנחנו בדרך כלל להשתמש העיגול N-מסוף של ה-DNA פולימראז מלך Thermus aquaticus, הידוע בכינויו Stoffel קטע (SF) 16 , 17. המתכון הוא המאגר המועדפת עבור 3 , SF 13. מאגרים אחרים יכול להיות מוחלף בהתאם פולימראז DNA ספציפיים.
    הערה: הריכוז הסופי של 10 x SF מאגר הרכיבים הם 500 מ מ טריס pH 8.5, 65 מ מ MgCl 2, 0.5 מ"ג/מ"ל BSA, 500 מ מ אשלגן כלורי (s), ומים הנדסה גנטית. המידות הן עבור 1 מ"ל מאגר SF, וזה מספיק עבור מבחני 100-200, בהתאם קנה המידה. ניתן לאחסן את החומר הממתן ללא הגבלת זמן ב-20 ° C.
    1. לשלב 0.5 מ של 1 מ' טריס, 65 µL של 1 מ' MgCl 2, µL 50 של BSA 10 מ"ג/מ"ל, g 0.0373 של אשלגן כלורי (s) ב- mL 1.5 צינור. להוסיף µL 385 מים הנדסה גנטית כדי להגיע נפח סופי של 1 מ"ל.
  2. x 1 מאגר אחסון מתכון (1 x SB)
    הערה: הריכוז הסופי של 1 x מאגר הרכיבים הם 50 מ מ טריס pH 7.5, 1 מ"מ DTT, EDTA 0.6 מ"מ ו- 50% גליצרול. המתכון הופך 20 מ ל 1 x SB.
    1. לשלב 0.012 גרם DTT, 100 µL של 0.5 M EDTA, ומלא צינור חרוטי 50 מ עם 40 מ ל 100 מ מ טריס (pH 7.5) כדי להפוך 2xSB. מיקס מאת vortexing.
    2. להעביר 10 מ"ל של SB x 2 צינור חדש 50 מל חרוט, לדלל עם גליצרול על-ידי הוספת 10 מ ל גליצרול החדש חרוט.
  3. Quenching מאגר כתום (QBO) מתכון
    הערה: כאשר משתמשים בתוויות רדיואקטיבי, משתמשים לעתים קרובות יעסיק bromophenol כחול ו/או קסילן cyanol כמו צבע מעקב על התקדמות אלקטרופורזה. עם זאת, צבעי אלה בחולשה לזרוח באזור הקרוב אינפרא אדום, מתנגש עם האות ה-DNA. לפיכך, אנו משתמשים כתום G במקומם לתגובות כל המכילים דוגמאות. אמנם מצאנו כתום G מתאימה למעקב ג'ל טעינה, מצאנו כתום G להיות פחות עקבי כמו צבע העוקבת אחר התקדמות אלקטרופורזה; לכן, נוכל להפעיל מסלולים ריקים המכילים bromophenol כחול על המסלולים החיצוניים של הג'ל שאינן מכילות הדגימה כדי לעקוב אחר ההתקדמות ג'ל. µL
    1. µL 950 לשלב של 95% formamide עם 25 של 0.5 M EDTA ומים 25 µL הנדסה גנטית. להוסיף 1 סקופ של G כתום צבע (~ 10 מ ג). מיקס מאת vortexing.
      התראה: Formamide הוא רעיל; ללבוש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כגון כפפות, משקפיים, חלוק המעבדה, והיפטרו כפסולת מסוכנת.

2. Assay בניהול

  1. איכותי אפיון פעילות הכוללת
    הערה: בשביל זה assay, אנחנו בדרך כלל לשמור על ריכוז קבוע של M-NTPs, משתנים זמן. המטרה היא להעריך את מאפייני הכוללת של החלבון מאשר למדוד בשום צעד בודד. כדי להכין תגובה אחת, אמצעי שווה של שני רכיבים נפרדים, המיקס דופלקס (שמתואר בשלב 2.1.1) ואת המיקס dNTP (שמתואר בשלב 2.1.2), להיות מוכן בנפרד, משולבים מכן לתת את הנפח הסופי של 49 µL. התוספת של אנזים 50 x µL 1 תיזום ואז התגובה. ניתן לקחת נקודות זמן משתנה; בדרך כלל, אנחנו להרוות-0, 5, 15 ו- 60 דקות. מיקס דופלקס
    1. הכנה של DNA
      הערה: המיקס דופלקס מורכב מ 10 x מאגר SF, פריימר oligonucleotide, תבנית oligonucleotide ומים הנדסה גנטית. הנפח הכולל נוספו כל התגובה הוא 25 µL. 1 µL של האנזים יתווספו לתערובת בסיס מיד לפני אתחול של הניסוי-
      הערה: מבחני שלנו, אנחנו בדרך כלל לשימוש תבנית 45-mer, פריימר של 18-מר או 23-מר. בעוד ניתן להשתמש במספר באורכים שונים, אנו נוטים להשתמש באורך כזה כי המוצרים (החל נוקלאוטידים 18 עד 45 נוקלאוטידים) נפתרות בקלות ברמה נוקלאוטיד יחיד באמצעות פרוטוקולים שתואר ג'ל אלקטרופורזה. כפי oligonucleotide מוצרי להגדיל אורך, זה יכול להיות מאתגר כדי לפתור את המוצרים ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד.
      הערה: בניסויים שלנו, אנו משתמשים 5 '-סגול הפלורסנט תווית סטרנד פריימר לבחון את המוצרים פריימר. אנו רוכשים מותאמים אישית oligonucleotides מסונתז הנושאת את השינוי; עם זאת, תווית זו ניתן לשלב באמצעות מספר כלשהו של אסטרטגיות תיוג שלאחר סינתטי. Oligonucleotide התבנית אינו מסומן, אז הוא לא ציין באמצעות םלצה ג'ל. עבור שני oligonucleotides, אנו מאחסנים את oligonucleotides-100 מיקרומטר ב- 10 מ מ טריס (pH 8), 1 מ"מ EDTA.
      הערה: כי אנחנו הם צופים רק את המפתח, עודף כפולה של תבנית משמש כדי להבטיח כי כל תחל (המין DNA זה הוא בחן) הם annealed לתבנית. ריכוז דופלקס הסופי של התגובה הזו היא 40 ננומטר.
      הערה: צבעי פלורסנט-סגול הם לעיתים קרובות רגישים קצת אור; במידת האפשר, נכסה את פריימר (וגם כל פתרון המכיל את המפתח) בנייר כסף. זה כולל את הג'ל לזיהוי בזמן בו פועל.
      הערה: בהמשך היא דוגמה מייצגת סינתזה של 2 ' F M-DNA.
      1. לדלל פריימר 1 ותבנית 1 (ראה טבלה של חומרים עבור רצף) 1 מיקרומטר כל במים אלקטרופורזה.
      2. כל תגובה assay, צינורות נפרדת, לשלב 5 µL של 10 x מאגר SF, 2 µL של 1 מיקרומטר פריימר 1, 4 µL של µL תבנית 1 ו- 13 1 מיקרומטר של הנדסה גנטית מים תואם הצנטרפוגה תרמי צינורות.
      3. Anneal דופלקס thermocycler באמצעות התוכנית הבאה: 98 ° C למשך 2 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 50 מעלות למשך 5 דקות, 40 ° צלזיוס למשך 5 דקות, להחזיק על 25 מעלות צלזיוס. התוכנית מסוים עשוי להשתנות בהתאם הטמפרטורה מחזק של פריימר/תבנית דופלקס. בדרך כלל, אנו מעדיפים לכלול צעד אחד לפחות 5 דקות בטמפרטורה מחזק ולאחר מכן עוד צעד 5-דקות בטמפרטורה 5-10 מעלות מתחת הטמפרטורה מחזק.
    2. הכנת תערובת x dNTP 2
      הערה: בהתאם הניסוי, זה אפשרי להשתמש dNTPs משתנה, ריכוזי dNTPs. בדרך כלל, אנו משתמשים 50-200 מיקרומטר התגובה.
      1. להכין פתרון 25 µL המכיל 100 מיקרומטר של כל 2 ' F-NTP. לאחסן את M-NTPs-100 מ מ.
    3. הכנת 50 x דילול חלבון
      הערה: לאחסון לטווח ארוך, אנזימים צריכים להישמר ב-20 ° C ב- 1xSB. בעת הסרת מהמקפיא-20 ° C, יש לשמור אנזימים על קרח בכל עת לפני תוספת לתערובת הראשית. אנזים דילולים צריכה להיעשות טריים מן המלאי מרוכזים כל יום. המניה האנזים מרוכז להחזיר למקפיא-20 ° C מיד לאחר השימוש.
      הערה: כי אנחנו בעיקר להעריך מוטציה polymerases ה-DNA, אנחנו רק להשתמש אנזימים הביע, מטוהרים במעבדה שלנו באמצעות שיטות הוקמה 9 , 10. עבור polymerases שנרכש באופן מסחרי, המשתמשים צריכים להיות זהיר של האופטימלית מאגרים עבור חלבונים שונים ותאימות שלהם עם המאגרים המתוארים בזאת.
      הערה: ריכוז האנזים משתנה עבור כל ניסוי. . הנה, אנחנו מראים דוגמה מייצגת עבור 2 ' F-DNA סינתזה.
      1. כדי להפוך פתרון אנזים 10 ננומטר, לדלל 1 µL של אנזים into SB 1 x כדי להפוך ריכוז האנזים הסופי 50 x. הריכוז של הפתרון 50 x צריך להיות 500 ננומטר. לדוגמה, אם ריכוז האנזים מניות 50 מיקרומטר, להוסיף 1 µL מניות אנזים 99 µL 1 x SB.
        הערה: מאז האנזים מאוחסן בדרך כלל גליצרול 50%, הפתרון הוא צמיגה למדי. גם אם באמצעות פיפטות ומדויקים, אנו ממליצים pipetting µL פחות מ 0.5, שוקל את החשיבות של דיוק ונכונות במהלך אנזים דילול.
    4. חניכה של assay
      1. לקבוע את הטמפרטורה של אמבט יבש ל-50 מעלות צלזיוס
      2. 24 להוסיף µL של דופלקס annealed מערבבים (ראה שלב 2.1.1) כדי µL 25 של x dNTPs 2 (ראה שלב 2.1.2).
      3. 9.8 להסיר µL של התערובת ב. צעד 2.1.4.2 ולהוסיף 20 µL של QBO (ראו סעיף 1.3 למתכון). Aliquot הזה משמש " אין אנזים " לשלוט, יש לקבל עבור כל הפעלה.
      4. להוסיף 0.8 µL של אנזים 50 x (ראה שלב 2.1.3.1) לתערובת דופלקס/dNTP. פיפטה למעלה ולמטה עם micropipette נפח גדול לערבב ביסודיות.
      5. אחרי 5, 15, ו- 60 דקות, להרוות את התגובה על-ידי הסרת 10 µL של כל פתרון התגובה והוספת לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 20 µL QBO (המתוארת בסעיף 1.3).
      6. ברגע מתרצה, תגובות ניתן לאחסן מתחת רדיד ללא הגבלת זמן-4 ° C או-20 ° C.
        הערה: עבור אפיון כמותי של צעדים בודדים של M-DNA סינתזה, assay דומה מאוד ניתן להפעיל באופן כמותי לקבל פרמטרים קינטיקת מיכאליס-מנטן. Assay זו משתמשת כל החומרים אותו. ניתן למדוד פרמטרים קינטיקת מיכאליס-מנטן עבור dNTP; במקרה זה, ההבדל המשמעותי ביותר הוא, במקום הוספת המיקס דופלקס dNTP מיקס, זה מוסיף את התמהיל דופלקס עם אנזים סדרה של 2 פתרונות x dNTP. באופן דומה, ניתן למדוד פרמטרים קינטיקת מיכאליס-מנטן עבור ה-DNA דופלקס. מסוים התנאים חייבים להתקיים כדי לספק את ההנחות הדרושים לשימוש את משוואת מיכאליס-מנטן. תנאים אלה, המכניקה הבסיסיים של וזמינותו, מוסברים היטב הקודם השיטות בסעיף 11-

3. ג'ל אלקטרופורזה

הערה: מכיוון לשפוך את הג'ל הוא זמן רגיש, כל החומרים הם מורכבים מראש. המתכונים של כל מרכיבי וזמינותו קריטי המפורטים להלן; ספקים המפורטים בטבלה של חומרים.

  1. הכנת אקרילאמיד אקרילאמיד 20% ג'ל.
    הערה: המתכון הזה גורם 1 ליטר של אקרילאמיד תערובת; כ- 120 מ של פתרון זה משמש לכל ג'ל. לאחסן את הפתרון הזה בטמפרטורת החדר תחת נייר כסף עד שנה אחת.
    זהירות: לזיהוי היא העצבים. חשוב ללבוש כפפות, חלוק מעבדה במהלך כל השלבים של ג'ל למזוג. אם לזיהוי על כפפות, להחליף מיד את הכפפות. אם אקרילאמיד לא polymerized, מקום החומרים מזוהמים בשקית אשפה לזיהוי שכותרתו.
    הערה: מעורבבים מראש אקרילאמיד 40% המכיל אקרילאמיד 38.67% ו- 1.33% bis-אקרילאמיד עבור מונומר ליחס מחדש של 29:1 היה בשימוש בפרוטוקול זה.
    1. שוקל 17 גר' אבקה TBE מעורבבים מראש. שוקל 6 חלקים נפרדים של 70 גרם של אוריאה (סה כ 420 גרם).
      הערה: יש להוסיף את שתנן חלקים. מצאנו אותו הכי טוב לחלק את זה לחלקים שש.
    2. להגדיר את גביע פלסטיק 2 ל' על צלחת מערבבים. להוסיף מוט יחיד מלהיב גדול הספל. לכסות את. הספל עם נייר כסף כאשר ערבוב למניעת ניתזים.
    3. להוסיף 500 מ של 40% אקרילאמיד פתרון לתוך הספל. ודא כי הפתרון הוא ערבוב.
    4. הוסף בעבר שקל-אאוט TBE. הוסף aliquot אחד של אוריאה. לאפשר פתרון לערבב. אוריאה מתמוסס באיטיות, עשויים להופיע מעורפל ולבן על תוספת הראשונית. לאט לאט מוסיפים את aliquots הנותרים של אוריאה לתוך התערובת במשך השעה הבאה. לתת את הפתרון לערבב עד שזה ברור לחלוטין וחסר צבע.
      הערה: בדרך כלל, לאפשר זאת כדי לערבב בין לילה. אם הפתרון עדיין לא התפרקה, להוסיף aliquots קטן של מים ולחכות שתנן להתמוסס.
    5. התוספת של שתנן להגדיל את נפח קרוב למים 1 ל' הוספה כדי להגביר את עוצמת בדיוק 1 ל'
    6. חנות 1 ליטר בקבוק זכוכית מגדלת או מכסה בקבוק זכוכית עם רדיד אלומיניום-
  2. שתשפוך של ג'ל אקרילאמיד.
    הערה: בעת טיפול צלחות זכוכית, להיות זהירים כדי למנוע מגע בין הזכוכיות כל משטח קשה. דבר זה חשוב במיוחד כי טיפול אגרסיבי עלול לגרום סדקים קטנים על הכוס; ייתכן סדקים אלה לא יהיו גלויות עד הג'ל פועל, אשר מתרחשת בטמפרטורה גבוהה. אנו משתמשים הפקק טבעות כדי למנוע קשר זה לא רצויים.
    1. נקיים לוחות
      1. ברכישת שני 33 ס מ x 42 ס מ ג'ל צלחות, אחד מחורץ, לוח unnotched אחד. מניחים צלחות על הפקק נפרד טבעות.
      2. צלחות יש לשטוף ביסודיות עם מים וסבון. ודא כי אין סבון פסים או כתמים ג'ל השאיר מאחור.
      3. רשום באיזה צד של חרוזים צלחת פחות מים. . הצד הזה הוא הג'ל פונה.
        הערה: אם הג'ל מופעל בצד השני של הצלחת, זה עלולה להפוך את העברת ג'ל מאתגר.
    2. יבשה לוחות
      1. להשתמש מגבות נייר להתייבש שני הפנים של כל צלחת-
      2. השתמש המגבים המשימה העדינה ומייבשים את שאר אזורי. תשומת לב מיוחדת על הקצוות של צלחות שבו יוחל הקלטת.
      3. שטפו צלחות זכוכית עם אתנול ~ 70%, ונגבו עם פעילות המגבים.
      4. לוודא שאין אין סיבים מגבת נייר או טיפות מים. אלה יכולים לגרום בועות כאשר מוזג את הג'ל.
    3. להוסיף מפרידי
      1. לרכוש מפרידי 0.75 מ מ. להפעיל את האצבעות בכפפה מתחת למים DI ורטוב בעדינות קפיציות עם האצבעות בכפפה.
        2. צלחת
      2. המקום מפרידי לאורך זמן קצות מחורץ. לנקות את כל המים הוא התיז על שאר הלוחות. ודא מפרידי מיושרים עם לוח הזכוכית ולא לתלות מעל הקצה.
    4. חותם ג'ל
      1. לבשתי כפפות יבש. יבש את הקצוות של הזכוכית שוב עם המשימה העדינה המגבים.
      2. יישר את הצלחת unnotched העליון מעל לצלחת מחורץ, לאט לאט למטה להקיש את הצלחות אחד נגד השני. בדוק שוב כדי להיות בטוח כי מיושרים הקצוות של כל הצלחות.
      3. באמצעות ג'ל הקלטת, מקם את הקלטת על פני כל הקצוות חוץ העליון. ודא כי הקלטת מיושרים באופן שווה, סגור בחוזקה. סרט יכול להיות מיושם בתנועה אחת, או כל צד יכול להיעשות באופן אינדיבידואלי. חותכים את הקצוות של הקלטת עם סכין גילוח.
      4. להוסיף רובד נוסף של הקלטת לחלק התחתון של הג'ל. . כך את הקלטת, סביר להניח הג'ל ידלוף כאשר מוזג.
      5. קליפ בצדדים של הכריך זכוכית עם המלחצות לבן. להוסיף 3 קליפים לכל צד, וקובצי 4 לתחתית.
    5. לשפוך את הג'ל
      1. לעשות 3 מ"ל של 10% אמוניום persulfate פתרון (APS) על ידי המסת 0.3 g קירור, דילול עד 3 מ ל מים אלקטרופורזה.
        הערה: 1.2 מ של APS צורך לכל ג'ל. תאריך הצינור לאחר הפיכתה. פתרון APS תפוג בעוד שבועיים, יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס
      2. העברת µL 125 של tetramethylethylenediamine (TEMED) לרכבת התחתית נפרדת microcentrifuge.
        הערה: TEMED הוא רעיל; ללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי כגון כפפות, משקפיים ו- lab מעיל בכל פעם טיפול.
      3. לרכוש בקבוק מים ולהסיר את המשפך המחודד. למדוד את 125 מ ל מים משורה ולהוסיף הבקבוק. סימון מפלס המים בחלק החיצוני של הבקבוק עם סמן קבוע. למחוק את המים. הבקבוק שפריץ ששונה חוזר ללא הגבלת זמן עם ניקוי נאות (ראו להלן).
      4. להגדיר את הטבעות פקק ליד הכיור כך שאין מקום לשים את הג'ל ברגע הוא שפך. מקם את הכריך צלחת כאן. לשים פקק בכיור אז יש מקום לשבת את הצלחות בזמן הג'ל נשפך. ניתן למזוג הג'ל לתוך הכריך צלחת זכוכית בזווית, כך התחתון ישען על הפקק ואילו העליון ינוח על קצה הכיור. ודא שאין כריות מתחת באזורים אלה למקרה לזיהוי נשפך הנהגים
      5. המקום APS פתרון והפתרון TEMED בצד השני של הכיור, עם רוקן להשפריץ בקבוק. מקם את המסרק היטב עם מספר וולס הרצוי לצד הכיור עם הצלחות. לשים 4 תופסנים בקרבת מקום.
        הערה: בשלב הבא של ההליך הוא זמן מאוד רגיש. היה מוכן לעבור במהירות בין השלבים. יש כמות מוגבלת של זמן להביא את התערובת בין הלוחות לפני זה polymerizes. כל הרכיבים (micropipettes מוגדרת מראש על אמצעי האחסון הנכון, פתרונות, צלחות זכוכית) מסודרים בקפידה לשפוך את הג'ל מהר ככל האפשר. אם הפילמור איטית רצוי, יכול להיות חצוי ריכוזים APS, TEMED; זה, עם זאת, ידרוש זמן רב יותר הפילמור.
      6. שופכים את הפתרון ג'ל 20% אקרילאמיד לתוך הבקבוק שפריץ לנקודה המסומנת. שופכים קצת יותר פתרון ג'ל מעל הקו המסומן, כך שאין מספיק פתרון במקרה של דליפות קטנות. . זה בערך 120 מ ל ג'ל פתרון.
      7. 120 להוסיף µL של TEMED, 600 µL של APS לפתרון לזיהוי ג'ל בתוך הבקבוק שפריץ באותו זמן. להוסיף במהירות של 600 µL נוספים של APS הפתרון לזיהוי ג'ל.
      8. קאפ במהירות את הבקבוק מים ואת מערבולת. מקם את הכריך הצלחת בכיור.
      9. מתחילים לזרום. . זה אמור לקחת 1-2 דקות על מנת למנוע הפילמור. לאט אבל בהתמדה, להוסיף ללחץ של הבקבוק מים אז הפתרון ג'ל יוצא באופן שווה. אם הפתרון מתחיל משפריץ ומתפשטים מהבקבוק שפריץ, לשחרר את הלחץ אז הבקבוק הופך בניפוח ולאחר לחדש לשפוך. Watch לוודא כי הפתרון ג'ל מכסה בכל התחומים, ואת זה לא דולף מכל הצדדים. כדי להסיר בועות אוויר, לשנות את הזווית של הלוחות. הבועות יקפוץ בראש, יפעל מהר יותר אם הזווית היא תלולה. ממשיכים עד הפתרון הגיע העליון של אזור מחורץ, והוא עולה על גדותיו מעט את הקצה מחורץ. להסיר את כל הבועות אוויר.
        הערה: אם הכריך צלחת דליפות, או שאין מספיק פתרון ג'ל, הפתרון לא להגיע העליון של הלוחות, לא ניתן להשתמש בג'ל. המתן עד הג'ל יש polymerized, ולנקות בהתאם.
      10. להוסיף את המסרק היטב הכריך צלחת. מקום 4 מלחציים על המסרק לחץ כלפי מטה ולאפשר כתופיים הבארות.
      11. להיפטר במהירות של הפתרון ג'ל שנותרו בבקבוק שפריץ לתוך לזיהוי שכותרתו פסולת. לשטוף החוצה הבקבוק מים עם יהלו מים 2 - 3 פעמים, מבעד לנחיר שפריץ-
        הערה: חשוב לבצע ניקוי זו במהירות כדי למנוע לזיהוי סתימת בבקבוק מים. אם אפילו כמות קטנה של הפילמור מתרחש בתוך הצינור, שפכו את הג'ל הבא גם לאט ולא בהצלחה. להשליך בקבוק מים אם הפילמור מתרחש.
  3. מפעיל את הג'ל אקרילאמיד
    1. בעוד הוא להיות polymerized ג'ל, להכין מאגר הפעלה 1 x TBE. יתמוסס 17 גר' מוצק מעורבבים מראש TBE 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. לנער מאגר עד כל TBE התפרקה.
    2. להסיר את כל קטעי בינדר הכריך צלחת-
    3. להשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הקלטת טייפ ולהסיר כל הקצוות של הכריך צלחת-
      4. משטחים
    4. נקיים את כל הג'ל polymerized מהזכוכית. להשתמש בסכין גילוח לאורך שולי כדי לגרד את ג'ל הנותרים. לנגב הצלחות עם מגבות נייר ומים כדי להסיר כמה שיותר שאריות לזיהוי ככל האפשר. אקרילאמיד עודף ו/או קלטת יכול לצרוב לעיתים קרובות במהלך בג'ל.
    5. להסיר את המסרק היטב על-ידי דוחף החוצה באופן שווה בשני הצדדים.
    6. השתמש בסכין גילוח לנתק את הג'ל עודף לאורך החלק העליון של הכריך צלחת. פרוסה לאורך הקצה מחורץ של הצלחת-
    7. השתמש מזרק ואת די מים כדי לשטוף את הבארות ולהסיר פסולת בתוך הבארות. ודא כי כל טוב יכול להיות מלא עם מים חסומה על ידי עודף ג'ל polymerized.
    8. למקם את הכריך צלחת המנגנון, כך הצלחת יותר פונה כלפי חוץ, השטח מחורץ פונה פנימה.
    9. הוסף סרטונים קליפ צלחת כריך ואלומיניום לצלחת עם המנגנון. הוסף אל מחוץ לצלחת לקדם ואף של הפעלת.
    10. מאגר TBE להוסיף כדי לכסות את החריצים הבסיס, רק מספיק כדי לכסות את הבארות בחלק העליון. מאגר TBE ניתן לסנן, ולהשתמש בהם שוב כ 5 ג'לים.
    11. צלחות חמות במשך 20 דקות על-ידי הפעלת בג'ל 50 W.
    12. לאחר התחממות הלוחות, לנקות את הבארות. להשתמש מזרק, המאגר TBE המרחצאות להשפריץ המלחים מאגר שנותרו מן הבארות. לעשות את זה מספר פעמים כדי לוודא בארות נקי. אם הבארות אינם נקיים, הלהקות תדבר אל, התמונה לא תהיה interpretable. למרות שזה יכול להיות זמן רב, אנחנו מצאנו אותה לבריאותה של קבלת נתונים טובים.
    13. ליין החיצוני ביותר משני הצדדים, pipet 5 µL של 95% formamide עם bromophenol כחול. . זה הפתרון אותו כמו QBO, אבל עם bromophenol כחול במקום כתום G... פעולה זו תספק תמונה לאן לחתוך את הג'ל עבור הדמיה וגם כמה רחוק למטה ה-DNA יש לרוץ.
    14. עבור כל דגימה להיות מנותח (נוצר בסעיף 2.1.1), להוסיף 3 µL לבאר בודדת של הג'ל. לאחר טעינת כל הדגימות, לחכות 1 דקות לקבלת דוגמאות להתיישב.
      15. כמוסות
    15. לשים על החלק העליון והחלק התחתון אמבטיות פלסטיק. לצרף את החוטים המנגנון. אדום מציין את המטען החשמלי חיובי, אז זה אמור להיות בתחתית כך הדנ א פועל מטה-
    16. חוטים צרף לכוח המקור של מוגדר כ- 50-55 וו בניהול הג'ל במשך כ-3 שעות או עד bromophenol חזית צבע כחול יש לרוץ לפחות 2/3 למטה הג'ל.
  4. הדמיה הג'ל
    הערה: ג'ל זה דק מאוד והוא יכול להיות קשה לטפל. יש לנקוט בזהירות כדי למנוע העתקה מתקליטור ואובדן של הג'ל כולו.
    הערה: בהתאם תווית ה-DNA, זה ייתכן שיידרש באמצעות ג'ל שונות imagers. פרוטוקול זה משתמש צבעי פלורסנט-סגול, בוצעה הדמיה של דגימות imager ג'ל (ראה טבלה של חומרים). הפרוטוקול נכתבה במיוחד imager הזה.
    1. כאשר החזית צבען כחול bromophenol יש לרוץ לפחות 2/3 למטה הג'ל (~ 28 ס מ), ניתן לעצור את הג'ל על-ידי כיבוי החשמל. להסיר את הג'ל המנגנון והמקום על הפקק הטבעות.
    2. להפריד את הצלחות עם מפריד צלחת יתד קטנה. מקם את המפריד הפנימי של החריצים להרים. בזהירות, אל תשתמש בכוח מופרז; החריצים יכולים לשבור אם יותר מדי לחץ.
    3. לאחר שאיבה בין הלוחות משתחררות, בזהירות להרים את הפלטה ולקבוע איזה צלחת הג'ל הוא על. אם הג'ל מקלות על צלחת התחתון, לשלוף את הצלחת העליונה ומניחים על הטבעת הפקק. אם הג'ל על הפלטה להיות מורם, לאט לאט, הג'ל עלולה לסגת צלחת התחתון. אם הג'ל לא נופל, שוב לאט לאט, משוך את החלק הנותר של הג'ל של צלחת התחתון, במקום הפלטה עם הג'ל על טבעת הפקק נפרד.
    4. ברגע הלוחות מופרדים, לראות איפה לצבוע על הג'ל ולהסיר עודפי ג'ל מהחלק העליון והתחתון של הג'ל. בדרך כלל, עם המבנים שלנו, באמצעות פריימר נוקלאוטיד של 18 או 23 או תבנית נוקלאוטיד 45, יש אין דנ א בין bromophenol צבע כחול הקדמי התחתון של הג'ל. לחתוך אנכית מ לצבוע לחלק העליון של הג'ל. החללים בין לצבוע את הקצוות של הג'ל יש גם אין דנ א. לבסוף, חותכים כמה ס מ מתחת השטח היטב הג'ל. ישנם אין חומצות גרעין בצמרת של הג'ל.
      הערה: לחתוך את הג'ל לתוך ביותר האפשרי הגודל הקטן ביותר מקל באופן משמעותי על לעלות על התקן הדימות. אם הג'ל גדול מדי, זה יותר להשפעתם של העתקה מתקליטור בעת העברה. בעוד אנחנו לעיתים קרובות לקצץ את הג'ל לפני הדמיה, אנו ממליצים להשתמש בזהירות בעת גיזום כל הנתונים הרלוונטיים עלול ללכת לאיבוד אם הטיפול אינו תפוס. כדי לבדוק אם להסיר חלקים יכיל נתונים נוספים, אנו נבצע. לעיתים קרובות בסריקה נוספים חלקיו נכרת של הג'ל על מנת להבטיח כי אין נתונים אבדו.
    5. מעיל את הג'ל עם מים כדי למנוע ייבוש.
    6. לנקות את השטח imager. באמצעות פעילות המגבים, לנגב את המשטח עם מים, אתנול. להוסיף מעיל דק של מים על פני השטח שבה יוצבו הג'ל.
    7. להעביר את החלק הרצוי של ג'ל השטח רטוב של Li-פינת
      8. בועות
    8. הסר אוויר על-ידי בעדינות ללחוץ עליהם לצאת מן בג'ל ולאחר ניגוב עם מגב פעילות. היזהרו קל מאוד להעתיק את הג'ל על ידי דחיפת בועות אוויר חזק מדי.
    9. תמונה את הג'ל על פי היצרן ' s פרוטוקולים. לנתח את הג'ל באמצעות תוכנה הזמינים עבור םלצה.
    10. בעוד הוא להיות עם תמונה הג'ל, לנקות מרחב העבודה על ידי הסרת עודפי אקרילאמיד ג'ל, שטיפת צלחות וסינון המאגר TBE חוזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח מוצלח לזיהוי ג'ל של אפיון איכותי של פעילות הכוללת (המתוארת בסעיף 2.1, איור 1) ושל קינטיקה מצב יציב (המתואר בפתק המסקנה של סעיף 2.1, איור 2) מוצגים. ניתוח לא מוצלח לזיהוי ג'ל מוצג גם (איור 3).

שימו לב כי אין סולם זמין מסחרית או סמן מולקולרי משמש. לעיתים, אנו נשתמש בשילוב פולימראז ידוע-המצע ליצירת סמן מולקולרי; עם זאת, חשוב לציין שיש נו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

. הנה, תארנו assay כדי לאפיין את הסינתזה בתיווך DNA פולימראז של M-DNA. באמצעות אינפרא אדום הקרוב תחל דנ א שכותרתו ולאחר שימוש בג'ל לזיהוי denaturing כדי לפתור oligonucleotides בגודל שונה, אפשר להשיג רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ב- oligonucleotides, מאפשר מדידה מדויקת של סינתזה. גישות אלה ניתן למדוד גם את הפעילות הכוללת של האנזים (סעיף 2.1) או למדוד את הפרמטרים קינטיקת מיכאליס-מנטן של צעדים בודדים (שים לב בעקבות צעד 2.1). המעבדה שלנו לאחרונה שימש את שניהם לאפיין אנזימים בעבר מפותחת9 וכן באופן רציונלי מה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי חברת מחקר לקידום מדעי (Cottrell המכללה מלומד פרס #22548) ועל ידי מנרב TriLink (ResearchReward גרנט #G139).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Tris HClPromegaH5123
Tris BasePromegaH5131
MgCl2Fisher ScientificBP214-500
אצטילציה BSAPromegaPR-R3961
KClSigmaP4504
Dithiothreitol (כלומר DTT)מוצרי מחקר בינלאומייםD11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (כלומר EDTA) (תמיסה של 0.5M)Sigma03690-100mL
גליצרולSigmaG5516
FormamideAcrosAC42374-5000
Orange GSigma AldrichO3756
Bromophenol blueFisher Scientific50-701-6973
dNTPsפישר סיינטיפיקFERR0191
M-dNTPs (riboNTPs)פישר סיינטיפיק45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (כל שאר NTPs ששונו)TriLink Biotechnologiesפריימר מגוון
1IDT DNA / TriLink Biotechnologiesסינתזות מותאמותאישיתאנו משתמשים בצבע IR700 שניתן לרכוש כסינתזה מותאמת אישית. בדרך כלל אנו רוכשים את האוליגונוקלאוטידים HPLC מטוהרים. הרצף הוא תבנית 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
1IDT DNA / TriLink Biotechnologiesסינתזות מותאמות אישיתאנו בדרך כלל רוכשים את האוליגונוקלאוטידים HPLC מטוהרים. הרצף הוא 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTATAGTGAGTCGTCGTATTA
אקרילאמידמוצרי מחקר בינלאומייםA1140538.67% אקרילאמיד ו-1.33% ביס-אקרילאמיד
Tris/Borate/EDTA (TBE) מוצקמוצרי מחקר בינלאומיT22020
אוריאה אולטרה-טהורהמוצרי מחקר בינלאומייםU20200
סרט ג'לCBS מדעיGT-72-10
מהדק קפיץ לבן גדול פוליפרופילןCBS ScientificGPC-0001
אמוניום פרסולפט (APS)Fisher ScientificBP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Fisher ScientificBP15020
מרווחים 0.75 מ"מCBS ScientificSGS-20-0740A
33x42 סט צלחות זכוכית מחורצותCBS ScientificSGP33-040A
מפריד צלחות טריזCBS ScientificWPS-100
מסרק לאלקטרופורזה ג'לCBS ScientificSG33-0734
אסדת אלקטרופורזה ג'לCBS ScientificSG-400-33
מיםבמיוחד אנו משתמשים במערכת Milli-Q
מפולימראזותDNA של Milliporeאנו מכינים אותם במעבדה שלנו באמצעות פרוטוקולים שפורסמו.
טהורים

מקורות

  1. Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
  2. Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
  3. Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
  4. Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
  5. Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
  6. Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
  7. Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
  8. Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
  9. Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
  10. Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
  11. Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
  12. Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
  13. Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
  16. Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
  17. Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
  18. Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
  19. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  20. Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235(2016).
  21. Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNADNADNATBE
DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.