הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56237

⸱

23 באוקטובר 2017

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

במאמר זה

סיכום

Oligodendrocytes להפוך Myelinating לקדם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה והישרדות עצביים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול ספציפי אוליגודנדרוציטים ביטוי של חלבונים פלורסנט ב organotypic פרוסות המוח עם הדמיה בצילום מואץ עוקבות. עוד, מוצג הליך פשוט להמחשת המיאלין וללא רבב.

תקציר

נוירונים להסתמך על בידוד חשמלי ותמיכה עם מחלות של oligodendrocytes להפוך myelinating. למרות החשיבות של oligodendrocytes להפוך, הכלים המתקדמים בשימוש כיום ללמוד הנוירונים, רק בחלקו ננקטו חוקרי אוליגודנדרוציטים. תא ייחודיים לסוג מכתים על ידי נגיפי התמרה חושית היא גישה שימושית בחקר דינמיקה אברון בשידור חי. מאמר זה מתאר פרוטוקול להמחשת אוליגודנדרוציטים המיטוכונדריה פרוסות המוח organotypic על ידי התמרה חושית בווירוס adeno-הקשורים (AAV) נושאת גנים מיטוכונדריאלי חלבונים פלורסנט יישוב תחת שליטה תעתיק של האמרגן בסיסי חלבון המיאלין. היא כוללת את הפרוטוקול לעשיית organotypic פרוסות המוח העכבר הילתית. בעקבות הליך של הדמיה בצילום מואץ של המיטוכונדריה לאחר מכן. שיטות אלה ניתן להעביר organelles אחרים, עשוי להיות שימושי במיוחד עבור לימוד organelles נדן מיאלין. לבסוף, אנו מתארים טכניקה זמינים עבור ויזואליזציה של מיאלין מוכתם בפרוסות חי על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe). הליבה דורש אין ציוד נוסף, יכול להיות שימושי לזהות את המיאלין במהלך דימות בשידור חי.

מבוא

חומר לבן של המוח מורכב אקסונים תא העצב עטוף המיאלין, קרום פלזמה מיוחדים המורחבת הנוצרת על-ידי oligodendrocytes להפוך. המיאלין הדרושים לשם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה ואמינה ההישרדות לטווח ארוך של ו דנדריטים, איבוד המיאלין יכול לגרום לבעיות נוירולוגיות. למרות חשיבותם, מאפייני oligodendrocytes להפוך פחות ידוע מושווים עם נוירונים, האסטרוציטים. כתוצאה מכך, פותחו כלים פחות לימוד oligodendrocytes להפוך.

חיים הדמיה של האברונים כגון המיטוכונדריה, רשת endoplasmatic (ER) או מבנים vesicular שונים יכול להיות שימושי ללמוד דינאמי לשינויים organelles לאורך זמן. באופן מסורתי, בוצעה הדמיה של החיים oligodendrocytes להפוך monocultures1,2. עם זאת, oligodendrocytes להפוך ב מונוקולטורה אינם מציגים המיאלין קומפקטי ולאחר organotypic או פרוסות המוח חריפה, לכן, ייתכן אפשרות טובה יותר לומדים לוקליזציה ותנועה של organelles. לוקליזציה של organelles קטן, חלבונים נדן המיאלין יכול להיות מאתגר עקב המרחק הקצר בין סיבי העצב הפעולה באקסון למעטפת מיאלין שמסביב. לפיכך, הנהלים immunostaining מיקרוסקופיים אור לבד אין את הרזולוציה המרחבית להפלות בין organelles נדן המיאלין לבין אלה האקסון סיבי העצב. ניתן לפתור זאת על ידי נגיפי התמרה חושית עם גנים, ממוקדות אברון חלבונים פלורסנט מונע על ידי היזמים ייחודיים לסוג התא. היתרונות הם ביטוי ספציפי תא, דליל, אשר מאפשרת הערכה מדויקת של אברון לוקליזציה ואת הדינמיקה. חיות הטרנסגניים יכול לשמש גם כדי להשיג כזה של אברון, ממוקדות ביטוי ספציפי תא3. עם זאת, הייצור ואת התחזוקה של חיות הטרנסגניים יקר, בדרך כלל אינו מציע הביטוי דליל יכולה להיות מושגת על ידי שיטות ויראלי.

השיטה המתוארת כאן משתמש ויראלי התמרה חושית של oligodendrocytes להפוך עם מיטוכונדריאלי במיקוד חלבונים פלורסנט (dsred או ירוק חלבון פלואורסצנטי, GFP) מונע על ידי האמרגן חלבון בסיסי מיאלין (MBP-mito-dsred או MBP-mito-GFP) לדמיין המיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים פרוסות המוח organotypic. בנוסף, ביטוי אחר החלבון הניאון בציטופלסמה (GFP בהם יחד עם mito-dsred או tdtomato עם mito-GFP) משמש כדי לאפשר ויזואליזציה של מורפולוגיה תאים, כולל את תאי cytoplasmic למעטפת מיאלין. הפרוטוקול כולל את ההליך להכנת פרוסות המוח organotypic (גירסה שונה של הפרוטוקול המתואר על ידי דה Simoni, יו, 20064,5). לאחר מכן נתאר את ההליך הדמיה בצילום מואץ ללמוד תנועה מיטוכונדריאלי. הליך זה משתמש מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם החלפת רציפה של המדיום הדמיה, מלכודת המאפשרת יישום קל של סמים או שינויים אחרים בינוני במהלך דימות. ההליך הדמיה בצילום מואץ יכול להתבצע על כל מיקרוסקופ קונפוקלי, עם ציוד נוסף לשמירה על החיים פרוסות כמפורט להלן. הפרוטוקול מכיל גם כמה טיפים כדי למטב את ההדמיה ולהפחית את phototoxicity.

לבסוף, מתוארת דרך מהירה ופשוטה כדי להמחיש המיאלין מוכתם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe). זה יכול להיות שימושי לזהות את המיאלין במהלך דימות בשידור חי. בשנים האחרונות, מספר טכניקות פותחו המיאלין התמונה ללא כל מכתים נדרש, אך רוב אלה דורשים ספציפי ציוד ומומחיות6,7,8. ההליך המתואר כאן משתמשת במאפיינים רעיוני של למעטפת מיאלין, היא גרסה מפושטת אורך גל יחיד-עירור של השתקפות קונאפוקלית ספקטרלי מיקרוסקופ (ציון, שבו מספר לייזר אורכי גל משולבים להמחיש מיאלין) 9. הליבה יכול להיעשות על כל מיקרוסקופ קונפוקלי 488 ננומטר לייזר ו- 470-500 ננומטר bandpass פליטה מסנן או מסנן פליטה tunable.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים המתוארים כאן אושרו על-ידי הרשות מחקר נורבגי בעל חיים. הספקים ומספרים קטלוג עבור מתכלים ופריטים אחרים נדרש ציוד זמינים ברשימת החומרים בסוף המסמך.

1. הכנה של פרוסות Organotypic

הערה: המתכון הזה משתמש שני הגורים העכבר ביום כמחנכת 7-9 (p7-9), אשר תשואות 24 פרוסות organotypic מחולק על שתי מנות תרבות שש-. טוב. אלא אם צוין אחרת, כל הפרוצדורות צריך להיעשות בשכונה סטרילי, nitril או ב- latex הכפפות אמור לשמש. יש להשתמש רק תא תרבות מרכיבים כיתה.

  1. אוטוקלב בקבוקים, כלי חיתוך (מספריים גדולים 1, מספריים קטנים 1, 1 מרית שטוחה גדולה, 1 קטן מרית מעוגל, מחודדים, מלקחיים 1, ראה חומרים רשימת לפרטים), זכוכית פיפטות, טיפים פיפטה והמטליות רקמות המשמש להכנת פרוסה.
  2. כל מחצית פיפטות זכוכית יש להשתמש עם הפתח גדול, מתנתקים הקצה הצר.
    1. את התוצאה עם גם יהלום העט (אם זמין) סביב פיפטה מתחת לנקודה שבה הכוס מתחילה הצטמצמות. ואז למקם הקצה המחודד של פיפטה הכפפות nitrile או דומה. בזהירות שובר לך את הטיפ על ידי כיפוף פיפטה תוך דחיפת זה נגד ספסל עבודה.
    2. לאחר מכן להקהות את הקצה השבור על ידי שפשוף על פיסת נייר או להמיס מעט מבער בונזן. פיפטות שבור משמשים להעברת המוח לחתוך פרוסות עם הקצה השבור הפך את הנורה גומי ו סוף נגיעה את הפתרון/הפרוסות הפתוח הגדול.
      הערה: זה לא עושים את כיסוי סטרילי זה והוא יכול להיעשות מספר ימים מראש.
  3. להכין מאכלים תרבות.
    הערה: ניתן לבצע זאת היום לפני לחתוך או לפחות שעתיים לפני חיתוך.
    1. ממברנות טפלון לחטא (PTFE) (" קונפטי "). להשתמש מלקחיים סטרילי שני כדי להסיר קונפטי אחד מן החלקים הפלסטיק הכחול שמסביב ולחטא בטבילת פעמיים לתוך צלחת פטרי המכיל אתנול 96% (EtOH). ואז הניח קונפטי במול בצלוחית מעוקרים גדולים לייבוש.
      הערה: הקונפטי הם ממברנות PTFE הידרופילית דומה ממברנות הכיסויים תרבות. השימוש של קונפטי מסייע הדמיה חיה כי פרוסות יחיד ניתן בקלות להעביר מהמכסה הגדרת למיקרוסקופ ע י הרמת הקונפטי עם מלקחיים (ראה 4.8. לפרטים). לחלופין, פרוסות המוח יכול להיות תרבותי מבלי הקונפטי (בה הפרוסות יצרף ישירות למוח של תרבות הקדמי). במקרה זה, עליך לבתר את תותב קרום עם איזמל להעביר את הפרוסה לאמבטיה מיקרוסקופ.
    2. להוסיף 1 מ"ל של תרבות בינוני (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) כל אחד טוב של המנות תרבות שש-. טוב.
    3. תרבות המקום להוסיף מכל קידוח באמצעות מלקחיים סטרילי. להימנע בועות אוויר בין הוספה של המדיום תרבות.
      הערה: כדי לחסוך את הכסף ואת הסביבה, זה אפשרי לעשות שימוש חוזר את הכיסויים תרבות. זה יכול להיעשות על ידי שטיפה יסודית מזוקקים H 2 O (dH 2 O) ואחריו הדגירה ב 70% EtOH למשך תקופה מינימלית של 24 שעות עד חוזר. בעת הכנת תרבות חדשה, לייבש את הכיסויים בצלחת תרבות תא תחת אולטרה סגול (UV) אור עבור 15-30 דק...
    4. במקום שני קונפטי (מעוקר ויבש) על כל אחד מוסיף התרבות. למקם את הקונפטי לעבר הקצוות של התוספות כדי לקבל חפיפה מינימלית.
    5. ! תחזירו את הצלחות בחממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO 2.
  4. בועה לנתיחה קר בינוני (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) בגז bioxide (95% O 2 /5%CO 2). כדי להשאיר את הפתרון סטרילי, להתחבר הצינור של בלון גז מסנן סטרילי מזרק (0.22 µm גודל הנקבוביות). מסנן
    1. כמה הקצה השני של המזרק לרכבת התחתית סטרילי מחובר פיפטה זכוכית סטריליים. מקם את פיפטה מזכוכית בפתרון, לכסות עם מצלמות-מיקרוסקופים והפעל את הגז. לשמור על המדיום לנתיחה על קרח
  5. מארגן את חותך/לנתיחה.
    הערה: באופן אידיאלי, הליך זה צריך להיעשות בשכונה סטרילי. אם הדבר אינו אפשרי, ניתן להשאיר את vibratome על ספסל עבודה. במקרה זה, מומלץ להשתמש מסיכת שיער net והפנים.
    1. באמצעות תער קצוות יחיד, לחתוך חתיכה מלבנית (כ 2 ס"מ x 0.5 ס מ) של agarose ג'ל (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) ונדבקים זה לבמה vibratome כך הצד הארוך פונה הלהב vibratome.
    2. נקי כל המשטחים החלקים vibratome עם 70% EtOH ולנגב עם מגבונים רקמות בלוק.
      הערה: חשוב כי כל החלקים יהיה במגע עם רקמת המוח יבשים לחלוטין מאז EtOH עלולה לגרום נזק לתאים.
    3. סכין גילוח סטרילי לצרף vibratome ולבצע בדיקת רטט אם vibratome יש פונקציה זו.
    4. המקום כלי חיתוך בלוק בשכונה יחד עם רקמות בלוק מגבונים, ארבע צלחות פטרי קטן, אזמל קצה עגול, 2 פיפטות זכוכית עם גומי נורות, פיפטות זכוכית open-end שני (ראה pt. 1.1), סופר דבק (ריסס עם EtOH).
    5. יוצקים בינוני לנתיחה מבעבע בתוך הסירה vibratome, פטרי קטן של ארבעה.
      הערה: שלב זה צריך להיעשות רק מיד לפני ניתוח מאז בינוני מנקודה זו ואילך אינו מבעבע או שמר על קרח
  6. Dissect ו הר המוח.
    הערה: כדי לקבל פרוסות בריא, שלב זה חייב להתבצע במהירות ובדייקנות. קצת תרגול נחוץ.
    1. המתת חסד חיה #1 על ידי שיבוש neckor בהתאם להנחיות מקומיות, ואז לערוף עם גדול המספריים.
    2. שימוש קטן, מספריים, מסירים את העור על ידי ביצוע חתך הסאגיטלי מן הצוואר האף ובמהירות למשוך הצידה כדי לחשוף את הגולגולת.
      1. חתך לאורך התפר המשונן ואחריו חתכים לרוחב על החלק הפנימי של עצמות המצח, את התפר lamboid (הגבול בין המוח הגדול, המוח הקטן).
      2. להשתמש מלקחיים לכופף פתיחת הגולגולת בכל צד. עצבי מנותקים מן המוח על-ידי הוספת מרית מעוגל, חדה תחת בצד הגחוני של המוח בעדינות העברה רוחבית המרית.
    3. להשתמש תער קצוות יחיד כדי להפוך הפרונטליים לחתוך rostral במוח הקטן.
      הערה: החתך הזה יקבע את הזווית שבה נחתכים לפרוסות. יש, לכן, להפוך את זווית ישרה-
    4. להעיף המוח מתוך הגולגולת, לתוך צלחת פטרי קטן המכיל לנתיחה בינונית.
    5. חזור על צעדים 1.6.1.-1.6.4. חיה #2, המקום לחלק את המוח הזה ב פטרי השני.
      הערה: בעלי החיים אינם סטריליים. לבצע את הקרע בצד אחד של מכסה המנוע ולאחר מכן להעביר לצד השני, נקי, ברגע השכל הוסרו ממנו הגולגולת.
    6. לשנות כפפות.
    7. המוח צרף לשלב vibratome: להוסיף שכבה דקה של דבק סופר על הבמה מול הג'ל agarose הנטען. . תחזיק את המוח #1 עם גדול שטוח מרית עם טרי חתוך (סימטרית) נוגע המרית ו את מול הצד הבטני (ולהיות הכי קרוב ככל האפשר כדי) הג'ל agarose.
      1. אז הנח בעדינות את המוח על גבי הדבק על-ידי דחיפתו את המרית ערכת מלקחיים. ודא שהשארת מספיק מקום עבור המוח #2-
        הערה: זה חשוב כי המוח מחוברים היטב על הבמה, אך ללא דבק מוגזמת, כמו זה יכול לחסום החיתוך.
    8. מיד לאחר הרכבה של המוח #1, השתמש המרית גדול כדי להוסיף כמה טיפות של דיסקציה בינוני על המוח. זה להחזיק את המוח לח, להקשיח את הדבק, למנוע ממנה נדבקות צידי המוח.
    9. חזור על שלבים 1.6.7 ו 1.6.8. למוח #2-
    10. לצרף את הבמה על גבי הספינה vibratome.
  7. גזור 230 מיקרומטר עבה הילתית פרוסות עם משרעת 1-1.5 מ מ, תדירות של 85 הרץ והמהירות של 0.2 מ מ/s. פרוסות לאסוף כ בין 1.4 מ מ rostral מ מ 2.1 סימטרית כדי Bregma.
    1. פרוסות לאסוף לאחר כל פרוסה נחתך באמצעות זכוכית open-end מכשור ניסוי ברטט (pt. 1.1). העברה פרוסות צלחת פטרי המכילות בינוני לנתיחה. השימוש אזמל מעוגל לחתוך לפרוסות לשני חלקים, חלוקת את שתי ההמיספרות.
  8. כאשר כל הפרוסות נחתכים, מניחים פרוסות לתוך הכלים תרבות.
    1. לקחת את המנה תרבות (אחד בכל הפעם) מתוך החממה.
    2. באמצעות פיפטות זכוכית open-end את, להעביר בזהירות פרוסה אחת לכל אחד הקונפטי.
      הערה: הפרוסות כדאי להשתטח באמצע הקונפטי. פעולה זו דורשת מיומנות מסוימת. עם זאת, אם כמה פרוסות אינם מושלמים, עדיף להשאיר אותם מאשר לבלות זמן. בניסיון להעביר אותם כפי זה חשוב לקבל את כל הפרוסות לתוך החממה מהר ככל האפשר.
    3. להשתמש פיפטה מזכוכית (החוד) כדי להסיר בעדינות עודף בינונית מבלי לגעת הפרוסה.
      הערה: פרוסות צריך לא להיות שקוע בנוזל בתקופת הדגירה. לכן, עליך להיות aspirated בינוני עודף כך הפרוסות חשופים לאוויר (בשכבה דקיקה של מדיום עדיין יכסה את הפרוסות). פרוסות שנותרו שקוע בנוזל בדרך כלל להיות לא בריא או למות (4 ו התצפיות).
    4. להעביר את המנה חזרה בחממה, ברגע כל הקונפטי פרוסה אחת.
    5. חזור על שלבים 1.7.8.-1.8.4. עבור המנה #2-
  9. לשנות את המדיום תרבות.
    הערה: זה צריך להיעשות יום לאחר בציעת (יום 1 במבחנה, DIV1) ולאחר מכן כל 2-3 ימים.
    1. מחממים תרבות בינוני באמבט מים או החממה.
    2. בשכונה סטרילי, להשתמש שאיבה ואקום או פיפטה רגיל עם טיפ סטרילי מחוק לגמרי תרבות בינוני מכל קידוח. זאת על-ידי בעדינות המפנה את המנה (על-ידי כ- 30 מעלות), הצבת את הטיפ פיפטה בקצה תותב תרבות.
    3. להסיר כ 800 µL מכל קידוח (להשאיר רק מספיק בינוני לשמור בתחתית תותב מכוסה בינוני). לאחר מכן, באמצעות פיפטה נקי, להוסיף 800 µL של המדיום מחומם מראש מכל קידוח. ואז למקם את הכלים בחזרה בחממה התרבות התא.

2. התמרה חושית נגיפי

AAVs
  1. רכישה או לעשות עם פלסמיד עניין, כפי שתואר לעיל 10 , 11-
    הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש של AAV serotype 2/8 (AAV 2/8) נושאת מיטוכונדריאלי ממוקד dsred או ה-GFP כמו גן כתב תחת שליטה תעתיק של יזם חלבון בסיסי 12 מיאלין (AAV2/8 MBP_mito_dsred או AAV2 / MBP_mito_GFP 8) לדמיין אוליגודנדרוציטים המיטוכונדריה. AAV 2/8 לשאת GFP או tdtomato מדווח מונע על ידי האמרגן חטיבתי כללי (AAV 2/8 CAG_GFP או AAV 2/8 CAG_tdtomato) משמש כדי להמחיש אוליגודנדרוציטים הציטופלסמה. לפיכך, השילוב של MBP_mito_dsred AAV2/8 עם AAV 2/8 CAG_GFP נותן המיטוכונדריה אדום הציטופלסמה ירוק ב oligodendrocytes, ואילו שילוב AAV2/8 MBP_mito_GFP AAV 2/8 CAG_tdtomato נותן המיטוכונדריה ירוק ו אדום הציטופלסמה. המבנים מתוארים יותר פירוט במקום 13.
  2. ביום 7 במבחנה (DIV7), מגלי oligodendrocytes להפוך עם AAVs.
    שים לב: בצע את תקנות הבטיחות לעבודה עם AAVs. ודא שיש האימונים הנכונים ואישור רמת אבטחה הנדרש. כל הנקודות הבאות צריכה להתבצע ב- cabinet אבטחה Class II שימוש בכפפות עור חלוק המעבדה. כאן, יישום של AAV אל אזור בקליפת המוח הפרוסות מתואר, כי זה אזור המציג את ההתאוששות הטובה ביותר.
    1. Dilute AAV ב מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני. דילולים סביב 2 × 10 9 הגנום עותקים/mL (GC/mL) מומלץ להגיע עם דלילה התמרה חושית של oligodendrocytes להפוך המאפשרת הדמיה של תאים בודדים בתוך הפרוסה. עם זאת, טייס באמצעות titers שונים צריך להיעשות כדי להבטיח צפיפות של oligodendrocytes להפוך transduced מתאים הניסויים ספציפיים. אם שני AAVs שונים משמשים, שהם צריכים להיות מעורב הפתרון אותו ולא להוסיף הפרוסה בו זמנית.
    2. להוסיף µL בסביבות 1.3 מדולל AAV כל פרוסה: לוודא החיצוני של קצה פיפטה יבש. פיפטה 1.3 µL מדולל AAV והחזק את פיפטה מעל קליפת המוח, קרוב ככל האפשר מבלי לגעת הפרוסה עם קצה פיפטה (בערך 1 מ משם).
    3. ואז לאט לדחוף פתרון מחוץ פיפטה. כאשר הפתרון נוגע הפרוסה, הזז את הטיפ פיפטה מעל קליפת להפיץ את הפתרון מעל האזור כולו קליפת-
      הערה: הליך זה צריך להיעשות מהר ככל האפשר כדי להימנע שומרים את הפרוסות למכסה במשך זמן ארוך מהנדרש. לעשות את זה על צלחת אחת באותו הזמן, להחזיר את המנה הראשונה החממה לפני תחילת על צלחת #2. כדי לקבל בהתפלגות משביע רצון של AAV ללא גרימת נזק לרקמת דורש קצת תרגול, יד יציבה.
  3. אם במיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף זמין במעבדה תא, ביטוי חלבונים ניתן לבדוק בזמן בתרבות על-ידי הצבת המנה תחת המיקרוסקופ.
    הערה: המנה לא צריך להישמר מחוץ החממה במשך יותר מ 2-5 דקות.

3. הדמיה זמן לשגות

הערה: ההדמיה יכולה להתבצע בכל פעם רמות הביטוי של הסמנים פלורסנט הן מספקות הפרוסות נראה בריא (בדרך כלל DIV11-14).

  1. לוודא המיקרוסקופ, זלוף וחימום מוגדרות כראוי כך פתרון דימות מבעבע מחומם, יכול להיכנס ולצאת האמבט.
    הערה: פתרונות שונים קיימים עבור חדרי אמבט. גרסה פשוטה מוצג כאן.
    1. הפוך בועודפים של האמבטיה על ידי קהות מחטי מזרקים (בנט על ~ 45°) המצורפים אל צידי האמבטיה על ידי blu-טקטיקה/fun נעץ.
    2. להבטיח כי אבובים ועובר בקבוק מבעבע ברציפות פתרון דימות, דרך משאבת סחרור, דרך הצינורית חימום של יחידת חימום ולאחר מכן כדי מחט מזרק כניסת באמבטיה.
    3. צינור אחר להתחבר לשקע מחט מזרק. הצינור הזה ואז עובר דרך את משאבת סחרור, חזרה אל הבקבוק של הדמיה פתרון (או בקבוק פסולת).
  2. בועה הדמיה פתרון (מתכון של ריאגנטים ' טבלה) בגז bioxide.
    הערה: זה אמור להיות started לפחות 15 דקות לפני הדמיה ולהמשיך לאורך כל הניסוי.
  3. התור על משאבת סחרור, דוד שמש, פתרון לרוץ דרך האמבטיה להשגת טמפרטורה אופטימלית אמבט (37 ± 0.5 ° C). להבטיח כי החיישן מדחום מחובר יחידת הטמפרטורה שקוע בפתרון אמבטיה-
  4. להפעיל את המיקרוסקופ, קרינה פלואורסצנטית המנורה ואת לייזרים המתאים.
  5. סט למעלה אור מתאים נתיב עבור המדגם.
    הערה: זה משתנה בהתאם בדיקה וההתקנה של מיקרוסקופ. הידע הכללי של אופן השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי נדרש, לא יטופל כאן.
  6. השתמש מטרה טבילה במים עם הגדלה המתאים ואת מפתח נומרי (נ. א). אנו משתמשים מטרה תוכנית-עדשה אפוכרומטית טבילה במים (נ. א. 1.0) 40 x.
  7. פתח חריר להשגת מקטע אופטי של-2-2.5 מיקרומטר עבור צילומי הווידאו. זה מקטין את המופע של המיטוכונדריה לזוז בפוקוס במהלך זמן לשגות.
  8. העברת organotypic פרוסה לאמבטיה:
    1. להוסיף טיפה של הדמיה פתרון או תרבות בינוני פלסטיק קטן פטרי.
    2. בשכונה סטרילי, להשתמש מלקחיים סטרילי כדי להעביר פרוסה אחת organotypic הקרום להוסיף עד הטיפה. המלקחיים צריך רק לגעת הקונפטי, לא את הפרוסה.
    3. לשים את המכסה הפטרי.
    4. מיד לשים את המנה תרבות המכיל את שאר הפרוסות בחזרה בחממה.
    5. להביא צלחת פטרי המכילות פרוסה על המיקרוסקופ.
    6. לבטל את משאבת סחרור בעת העברת פרוסה מיקרוסקופ לאמבטיה. תחילה, השתמש מלקחיים להרים קונפטי עם פרוסה של פטרי לחלק העליון של בית המרחץ (הקונפטי יצוף). ואז המקום את שני קצות המלקחיים בכל צד של הקונפטי, כך הם נוגעים הקונפטי בלי לגעת הפרוסה, ודחף את הקונפטי דרך הפתרון לתחתית האמבט. מרכז הקונפטי באמצע האמבטיה.
    7. להשתמש מלקחיים כדי למקם את נקודת העיגון hold-down (נבל) על גבי הקונפטי בלי לגעת הפרוסה.
      הערה: נבל הוא עוגן הפלטינה בצורת פרסה המשמש כדי למנוע את הפרוסה צף או נסחף באמבטיה. עבור פרוסות חריפה, פתילים דקות לרוץ מצד אחד של הנבל השני (דמוי נבל מוזיקה). פרוסות organotypic, הנבל צריך להיות שהראת, שיתאים לגודל הקונפטי בצורה כזאת, כי זה יכול. להניח על גבי הקונפטי בלי לגעת הפרוסה.
    8. להדליק משאבת סחרור.
  9. להוריד את המטרה עד המדגם.
  10. בחר תא ואת אזור התמונה.
    הערה: להימנע מחשיפה מוגזמת של התאים לייזר אור כמו זה יכול לגרום תא רעילות (ראה טיפים הנקודות להלן).
    1. להשתמש עיניות, את מנורת פלורסנט כדי למצוא אוליגודנדרוציטים בריאים למראה עם הביטוי הנכון. בדרך כלל, oligodendrocytes להפוך שיש להם ביטוי חזק של החלבון הניאון מופיעים לא בריא. Oligodendrocytes להפוך לא בריא יהיו תהליכים עם מראה הנטול צורה, וכל המיטוכונדריה יופיעו בקיעים. Oligodendrocytes בריאה, סומא והתהליכים מופיעים חלק ויש המיטוכונדריה באורכים שונים (אם כי בדרך כלל הרבה יותר קצר מאשר נוירונים, האסטרוציטים 13 , 14 , 15).
    2. למקם את התא של הריבית באמצע שדה הראייה.
    3. שימוש " חיים " לתפקד בתוכנה (עבור לייקה, Zeiss מיקרוסקופים) כדי לזהות את התא על המסך, בחר אזור מעניין, למשל, חלק של התא המכיל מספר תהליכי הראשי או עטיפות המיאלין, או תהליך יחיד או מעטפת המיאלין.
      הערה: כדי להיות מסוגל תמונה כמו הרבה של התהליכים/מרתה ככל האפשר, בחר אזורים שמכיל שתהליכים שכב יחסית שטוח בכיוון x-y.
    4. להגדיל תחום התעניינות (בדרך כלל לייצר תמונה בגודל פיקסל של 0.14 - 0.30 מיקרומטר).
    5. שימוש " אזורים " הכלי, צייר מלבן מסביב לאזור ובחר את האפשרות לסרוק רק האזור הנבחר. סריקה זמן, ובכך חשיפה ללייזר, הוא מופחת על ידי רק לסרוק את האזור הנבחר.
      הערה: אזורים אופקיים מלבני ייסרקו מהר יותר אזורים אנכי עקב מספר קצר של קווים סרוקים הדרושים. אם אזור המלבנית האנכית נסרק, הפעם סריקה יכול להיות מופחת על ידי סיבוב השדה סריקה ב- 90 מעלות (באמצעות הכלי סיבוב).
  11. כוונון עוצמת הלייזר ורווח כדי לקבל תצפית טובה על המיטוכונדריה.
    הערה: השתמש את עוצמת הלייזר מינימלי הדרוש. במידת האפשר, הפעל את רווח במקום הגדלת עוצמת הלייזר. בנוסף לגרימת תא רעילות, עוצמת הלייזר גבוהה מדי מלבין את האובייקטים שבעורך לאורך זמן, וכך מצריכים עלייה נוספת של עוצמת הלייזר או לצבור במהלך סריקה. עוצמת הלייזר נדרשת ורווח יהיה תלוי את רמת הביטוי של המיקרוסקופ. עם מיקרוסקופ קונפוקלי LSM700, אנו משתמשים בלייזר nm 555-כוח של 20-40 µW תמונה dsred או tdtomato, 488 ננומטר לייזר משמש ב- 20-30 µW לשיקוף GFP (לייזר כוח נמדד על הפתח האחורי של המטרה). רווח שוכן גבוה עבור הדמיה בשידור חי, בדרך כלל בטווח של 800-700 עבור ה-GFP, 850-980 עבור dsred ו- tdtomato. רווח גבוה עלול לגרום רעש רקע נוסף, אשר יוסר על ידי הגדלת ההיסט דיגיטלי (אופסט ערכים להניח בדרך כלל בין 0 ל- 15). מניסיוננו, שימוש MBP_mito_GFP מספק יותר טוב אות לרעש מאשר MBP_mito_dsred.
  12. בחר מהירות הסריקה.
    הערה: לצמצם את זמן סריקה באמצעות סריקה במהירות גבוהה, על ידי ציור של אזור הסריקה קטן (ראה הצבע 4.10.5 להלן). . זה גם ניתן להציל סריקה הזמן על ידי ביצוע סריקה דו-כיווניים. עם זאת, לא מומלץ עקב באיכות התמונה.
  13. סט התדירות והמשך של הקלטה זמן לשגות, למשל לכידת תמונות כל 2 שניות עבור סכום כולל של 20 דקות עבור הדמיה מיטוכונדריאלי ב oligodendrocytes להפוך.
    הערה: התדירות והמשך צריך להיות מוגדר על פי הניידות של האובייקטים של ריבית. תדר גבוה יותר תחשוף את הדגימה יותר לייזר אור, אבל עצמים הנעים מהר יותר גם דורשים משך סה כ קצר יותר של קטעי וידאו בצילום מואץ (למשל במיטוכונדריה נוירונים, אשר לנוע בתדירות גבוהה יותר במהירות גבוהה יותר מאשר במיטוכונדריה oligodendrocytes, בדרך כלל הם צילמו כל שנייה עבור סכום כולל של 2 דקות 16)-
  14. להתחיל בצילום מואץ ההקלטה.
    הערה: המיטוכונדריה עשויה לנוע מחוץ לפוקוס ו/או להיסחף מהאזור שבעורך במהלך ההקלטה. כדי למזער את התנודות והתנועה, להתאים בועודפים של האמבטיה להפחית מהירות המשאבה במידת הצורך. שינויים קטנים בפוקוס בדרך כלל עדיין מתרחשות. לפיכך, ניטור רציף של המסך במהלך דימות נדרש, עם שינויים קטנים של המוקד במהלך ההקלטה.
  15. ללכוד את z-בערימה של התא כולו עבור זיהוי עתידי של התא, עם תמונה תהליך.
    הערה: עבור רזולוציה טובה יותר, חריר מאופס 1 יחידה אוורירי עבור z-המחסנית.
  16. אופציונלי: לדמיין את המיאלין וללא רבב.
    הערה: ב oligodendrocytes transduced עם GFP (cytoplasmic), עטיפות המיאלין בדרך כלל ניתן לזהות כקווים ישרים של הציטופלסמה (הרכסים cytoplasmic) מחובר לתהליך העיקרי (ראה איור 2 A ו- B). עם זאת, אם הביטוי GFP חלש מדי או סמן cytoplasmic אינו בשימוש, זה אפשר לדמיין את המיאלין על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות (CoRe) כפי שמוסבר כאן.
    1. להגדיר נתיב אור חדש בתוכנה עם לייזר עירור-488 ננומטר וללכוד הנפלטים אור סביב אותו גל, למשל 470-500 ננומטר.
    2. התאם לייזר כוח ולהשיג עד המיאלין יהיה גלוי (עיין בדוגמה < מחלקה חזקה = "xfig "> איור 3). באמצעות מיקרוסקופ LSM 510 Meta, בדרך כלל נשתמש בחזקת לייזר µW 7-12 (נמדד על הפתח האחורי של המטרה).
  17. אופציונלי: הכנה של פרוסות immunostaining.
    1. אם התא שבעורך חייב להיות מזוהה לאחר immunostaining, לכידה של תמונת הגדלה נמוכה (10 x) של התא ולציין את מיקומו בתמונה על ידי ציור חץ או דומה. כדי לסייע בזיהוי של התא, מומלץ גם לשרטט מפה ידנית של כל פרוסה, המציין את מיקומו של התא.
    2. תיקון פרוסה ב 4% paraformaldehyde (PFA) על שייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר.
      התראה: PFA מזיק. להשתמש מגן ללבוש ולהשתמש רק בשכונה מאוורר.
    3. לדלל 1:10 ב- PBS מקבע ולהשאיר ב 4° C עד לתחילת אימונוהיסטוכימיה כמתואר 17.
      הערה: למרות פרוסות יכולים להישאר לשבועיים מדוללת למשך מספר שבועות, קרינה פלואורסצנטית עשויה לדהות. ביצוע אימונוהיסטוכימיה תוך 10 ימים קיבוע מומלץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוסות המוח Organotypic היו תרבותי, transduced כמתואר לעיל הראה בהתפלגות דלילה של קורטיקלית oligodendrocytes להפוך לבטא mito_dsred ו- GFP. Immunostaining עם נוגדנים נגד Olig2 ו- MBP אישר כי הביטוי היה ספיציפית oligodendrocytes להפוך (איור 1).

עבור הדמיה בשידור חי, transduced oligodendrocytes להפוך זוהו על ידי שלהם מורפולוגיה אופיינית של כמה עטיפות המיאלין הפעלה במקביל (איור 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול להכנת organotypic תרבויות המתוארים כאן הוא הגירסה ששונתה18 של הפרוטוקול המתואר על ידי דה Simoni יו (2006)5. השינויים החשובים ביותר יש כבר המתוארים להלן. טריס מאגר נוסף המדיום תרבות, אשר משפר את ההישרדות של הפרוסות כאשר מחוץ החממה במהלך התמרה חושית ויראלית ושינוי של המדיום התא. תהליך עיקור עבור קונפטי גם משתנה. בעוד פרוטוקולים אחרים לחטא קונפטי מאת autoclaving, לא מומלץ זה משום שהיא תגרום מספר הקונפטי להתכרבל. הימנעו משימוש קונפטי מסולסל פרוסות גדל על אלה נוטים להיו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים לינדה הילדגרד Bergersen ו Magnar Bjørås עבור גישה לתא מעבדה וציוד, צוות משאבים משותפים של ביולוגיה מולקולרית Janelia עבור פלסמיד והפקה וירוס, קואן Vervaeke לקבלת סיוע עם מדידות חשמל לייזר. עבודה זו מומן על ידי איגוד הבריאות נורבגי, המועצה מחקר נורבגי, הציוד מיקרוסקופ מומן על ידי Norbrain.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרוז סיגמא A9539
BD Microlance 19GBD301500מחטים המשמשות לכניסה ויציאה של
גז דו חמצניAGA105701
נורות פיפטהמותג סיגמא-אולדריץ'Z615927נורות פיפטה
מבער בונסן (מבער פרופאן נוזלי)VWR89038-530
מכלול כבלים לבקרי חימוםוורנר אינסטרומנטס64-0106 בקר טמפרטורה - חלק מדחום
CaCl2fluka21100
CO2 AGA100309CO2 לחממה
כיסוי זכוכית, Corning Thermo מרובע  פישר סיינטיפיק13206778לחיבור מתחת לאמבטיה להדמיה חיה. אוטמים עם דבק או ג'לי בנזין.
D-(+)-גלוקוזסיגמאG7021
מלקחיים עדיניםFinescience11063-07לדיסקציה
עט סופר יהלוםטד פלה בע"מ.54463
פיפטות פסטר זכוכית חד פעמיות 230 מ"מVWR612-1702פיפטות זכוכית
קצה כפול סכין גילוח נירוסטהמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית#7200סכין גילוח לרטט
תמיסת המלח המאוזנת של ארל (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
עיגולי נייר סינוןSchleicher & Schuell300,220נייר סינון המשמש לסינון של PFA
Fun tackLoctite1270884השתמש לחיבור/התאמת מיקום של כניסות ויציאות במגבת
ידיים C-Fold 2נבל 344388
, שטוח לתא RC-41,וורנר אינסטרומנטס  64-1418נבל להחזיק קונפטי באמבטיה. חותכים מיתרים לפני השימוש עם פרוסות אורגנוטיפיות. 1.5 מ"מ, 13 מ"מ, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir, דגם 1.2Heto-Holten96004000Mסרום סוסים למינארי
Gibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
ממברנת LCR, PTFE,  MilliporeFHLC0130קונפטי 
Leica VT1200Leica14048142065Vibratome
MEM-Glutamax עם HEPESThermo  Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Micro Spoon Heyman Type BElectron Microscopy Sciences62411-Bמרית קטנה ומעוגלת עם קצה מושחז לדיסקציה
יחידת מסנן Millex-GP MilliporeSLGPM33RAיחידת מסנן מזרקMillicell
הכנסת תרבית תאים, 30 מ"מMilliporePICM03050תרבית תאים מוסיפה
מודול בקרת 3 מהירויות MinipulsGILSONF155001 משאבה פריסטלטית להדמיה חיה - חלק מודול בקרה (חיבור לראש שני קנלים)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon Delta SurfaceThermo  פישר סיינטיפיק140675לוחית תרבות
מתלה ניסטטיןסיגמא-אולדריץ'N1638
אובייקטיבי W "תוכנית-אפוכרומאט" 40x/1.0 DIC צייס441452-9900-000 מטרת טבילה במים המשמשת להדמיה חיה. (WD=2.5 מ"מ), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldehyde,מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים#19208
תא זלוף PC-RSiSkiYou  15280000Eאמבט להדמיה חיה
פניצילין-סטרפטומיצין, נוזלInvitrogen15070-063
צלחת פטרי 140 מ"מ הגר1075צלחת פטרי גדולה 
צלחת פטרי 92x16 מ"מ סרסטדט 82.1473צלחת פטרי בינונית 
פטרידיש 55x14,2 מ"מVWR391-0868צלחת פטרי קטנה
פוספט חוצץ מלח (PBS)SigmaP4417טבליות PBS
R2 ראש דו-ערוצי GILSONF117800משאבה פריסטלטית להדמיה חיה - חלק ראש דו ערוצי (דורש מודול בקרה)
מרית עגולה/שטוחה, נירוסטהVWR82027-528מרית גדולה לחיתוך
נייר חולVWRMMMA63119אופציונלי, להחלקת פיפטות זכוכית שבורות
מספריים,  17,5 ס"מFinescience14130-17מספריים גדולות לדיסקציה
מספריים, 8,5 Finescience14084-08מספריים קטנים וחדים עבור  דיסקציה
קצה יחיד, להב אבן חןמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית#71972סכין גילוח קצה
יחיד מחמם תמיסה מוטבע יחיד SH-27BWarner Instruments64-0102בקר טמפרטורה - חלק מחמם
יחידת סינון Steritop-GP, 500 מ"ל, 45 מ"מMilliporeSCGPT05REמסנן לעיקור פתרונות
סופר דבק דיוקלוקטיט1577386
להב אזמל כירורגי מס' 22סוואן מורטון בע"מ209להב אזמל מעוגל
בקר טמפרטורה TC324BWarner Instruments64-0100בקר טמפרטורה להדמיה חיה (דורש מחמם תמיסה ומכלול כבלים)
בסיס TrizmaSigma T1503
Trizma HClSigmaT3253
אינקובטור מעטפת מים מסדרה IIForma Scientific78653-2882
קתרין, גרגירית

מקורות

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AAVTime lapse
ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.