אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

קיימים פרוטוקולים מרובים כדי להעריך את הפוטנציאל (CTL) cytolytic של CD8⁺ או CD4⁺ T-cell. ההערכה יכול להיעשות בקלות במבחנה תחת תנאים מבוקרים^1,2,3. בנוסף, מודלים מחלה זיהומית, כגון LCMV, בחנו בסגנון קלאסי CTL פונקציה באמצעות באופן שונה CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר) שכותרתו התאים היעד בו CFSE^שלום-תאים עם תוויות פעמו עם פפטיד, CFSE^הלאו-שכותרתו היעד תאים נשארו unpulsed. התאים אז מוזרק ביחס של 1:1, שקובעת אובדן CFSE^היי-תווית פעמו מטרות באמצעות cytometry זרימה⁴. חיסון דגמים דחייה גם השתמשו אסטרטגיות דומות עבור הערכה של ויוו להרוג על ידי שני CD8⁺ ו CD4⁺ T תאים כמו גם תאי NK^5,6. זה וזמינותו עוצמה, אך מחייב שימוש מדבקים זה פריים המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד.

פרוטוקול זה, מצד שני, דורש אין זיהום מוקדמת של המחשב המארח, במקום מנצל אסטרטגיה חיסון לשפר את המערכת החיסונית לפני הזרקת היעד. לחיסון זה מורכבת ניסוח על בסיס מים של חיסון פפטיד המחייב מתן immunostimulatory קוקטייל בשם covax⁷, המורכב קולטן דמוי אגרה 7 (TLR7) אגוניסט (imiquimod קרם), של אנטי-CD40 היתה ללא-חת נוגדן, interleukin-2 (il-2) שמוביל שילוב סינרגיסטי של סוכנים immunostimulatory ההתמחרות פפטיד ספציפי לקרקע ואת התגובה החיסונית חזקה. ככזה, וזמינותו הזה מספק של הבדיקה מהירה של CTL פונקציה כמו החיסון ניתנת יחד עם התאים עבור הערכה של תפקוד רק שלושה ימים לפני הזרקה של תאי היעד. בנוסף, לקרקע covax הוא מספיק חזק, כי ניתן לראות את קיבולת הריגתו של תא T אנטיגן ספציפי להתקפת בין 4 ו- 24 שעות לאחר ההזרקה.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא לזהות את ציר הזמן ויוו עבור הגילוי של הריגת היעד המתאים אנטיגן והן את ההשערה הנבדקת. יש לבצע הערכה זהירה, כשלל וריאציות אנטיגן כוח, כמו גם שינויים גנטיים במקצועות תאי-T עלולה לגרום דיפרנציאלית בפונקציה CTL המחייב של זיהוי תזמון שונה היעד ההרג. בנוסף, בזמן הריכוז המתאים של פפטיד עבור חיסון מוטבה עבור מלנומה אנושית אנטיגן glycopeptide 100 (hgp100_25-33) ו אובלבומין_257-264 (ביצית_257-264)^8,9 _, שימוש אחר מודל אנטיגן אשר עשוי להיות מתאים יותר ממחקר נתון ידרוש יותר אימות. בשל הבדלים קיבולת של אנטיגנים היעד לעורר CTL לתפקד אפקטור בשילוב עם covax כמו אדג'וונט הצפויה, אופטימיזציה של ריכוז המינון il-2 ותדירות המינון עשוי להיות חיוני להשגת המטרה הרצויה. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה של הפונקציה ויוו , ניתן להתאים כל אנטיגן נתון.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת טקסס MD Anderson Cancer Center.

1. הכנה של פפטיד של חיסון

1. להמיס את פפטיד lyophilized עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) הריכוז המתאים, מערבולת ב-30 s.
   הערה: עבור_25–hgp100₃₃, הריכוז הסופי הוא 1 מ"ג/מ"ל, עבור ביצית_257–264, הריכוז הסופי הוא 0.5 מ"ג/מ"ל. לשקם פפטיד לפני ההזרקה. אל תאחסן אחרי שיחזור.

2. בידוד של Splenocytes מכל עכבר מהונדס

הערה: תא בידוד מן הטחול חייב להתבצע בצורה סטרילית.

1. המתת חסד OT-1 העכבר הטרנסגניים בשיטה שאושרו CO₂ חנק, להסיר את הטחול.
   הערה: העכבר הטרנסגניים המתאים מנוצל בשלב זה ספציפי פפטיד של בחירה.
   1. הנח את העכבר בצד ימין שלה. תרסיס בצד השמאלי של העכבר עם 70% אתנול (EtOH). משוך את העור בעזרת מלקחיים, לחתוך את העור באמצעות מספריים כירורגיים; הטחול יהיה גלוי בתוך חלל הצפק. בעדינות לפתוח את החור בצפק לגשת הטחול. להסיר את הטחול באמצעות מלקחיים.
2. Disaggregate הטחול על-ידי הצבתו במסנן מיקרומטר 70 בצלחת פטרי בינונית 2 מ ל- A (PBS עם 1% סרום שור עוברית (FBS)) ו לנפץ את הטחול עם סוף פומפה.
   1. לאסוף את splenocytes צלחת פטרי והמקום צינור חרוטי 50 מ. לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מ של מדיום פעמיים כדי לאסוף את כל התאים. הוסף בינוני למעלה מ 25 ל ' centrifuge את התאים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ב 475 x g.
3. וארוקן את התאים, resuspend 1 מ"ל / לכל מאגר פירוק של תאי הדם האדומים (RBC) טחול. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק להוסיף 10 מ"ל של מדיום A, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר 475 x g... Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום A, הסרת לכלוך על-ידי סינון התליה תא דרך מסנן מיקרומטר 70 לתוך נקי 50 מל חרוט.
4. לספור תאים באמצעות trypan blue ושל hemocytometer. Resuspend תאים ב- PBS ריכוז סופי של 10⁶ -⁶ תאים/מ ל. עבור ביצית_257–264 ספציפי להרוג, resuspend ב- 10⁶ תאים למ"ל, עבור hgp100_25–33 ספציפי להרוג, resuspend-⁶ תאים/מ.
   1. ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב ג x 475 וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- 15 מ"ל PBS קר כדי לשטוף את התאים. חזור על השלב לשטוף פעם נוספת. ספין התאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב ג x 475 וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב- PBS קר על-פי אמצעי האחסון הסופי שנקבע בשלב 2.4.
   2. תא בודד ההשעיה להעביר צינור microcentrifuge 1.5 mL ולשמור על הקרח עד זריקה לתוך עכבר C57/BL6 הנמען.

3. הזרקה של Splenocytes מן העכברים הטרנסגניים

1. את המקום העכבר הנמען C57/BL6 restrainer עם הצד הגבי. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. לנהל µL 100 של תא בודד השעיה (סעיף 2) דרך הווריד לווריד הזנב באמצעות מחט 27 G עם הצד שיקוע פונה כלפי מעלה.

4. Covax ניהול

הערה: אם תאים מוזרקים בשעות אחר הצהריים, covax ובחולים למחרת בבוקר בתוך 18 h של הזרקת תאים.

1. הנח את העכבר בתיבת הרדמה ברור עם 1-3% איזופלוריין. אחרי עכברים הם מורדם לחלוטין, להעביר הקונוסים האף מחובר את סעפת בבית הבליעה הרדמה העכברים. לשמור על עכברים מאופקת עם הצד הגבי למעלה.
   הערה: ההרדמה אושר על ידי צביטה הבוהן קצרה כדי לוודא שתגובת הנסיגה היא לא elicited. החוק הפדרלי מגבילה את השימוש איזופלוריין גודל וטרינר מורשה.
2. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. מזריקים µL 100 של פפטיד פתרון (מתוך סעיף 1) subcutaneously באמצעות מחט 27 G עם המזרק לחדור 4-5 מ מ לתוך האזור בסיס הזנב, הצד שיקוע המחט פונה כלפי מעלה.
   הערה: עכברים הם חוסנו באגף אחד עם הזרקה תת עורית בבסיס של הזנב¹⁰.
3. להזריק 100 µL, אנטי-CD40 נוגדנים (מניות 0.5 מ"ג/מ"ל) לרוחב באתר הזרקת החיסון.
4. בזהירות החל imiquimod קרם 50 mg/עכבר על האתרים חיסון. מרחו קרם imiquimod על פני השטח עד הקרם אינה גלויה, נספג באופן מלא.
5. מזריקים µL 100 של 100,000 IU/mL rhIL-2 חלבון intraperitoneally (i.p.) על אזור הבטן התחתונה. להתבונן עכברים במשך 5 דקות אחרי שהם יתאושש לגמרי מן ההרדמה.
   הערה: ניסוי מושהה בנקודה זו במשך 3 ימים.

5. בידוד של המטרה Splenocytes של תיוג עם CFSE

הערה: תא בידוד מן הטחול חייב להתבצע בצורה סטרילית.

1. המתת חסד העכברים C57BL/6 לפי שיטת חנק של₂ CO שאושרו. הסר spleen(s) כמו שלב 2.1.1. Disaggregate הטחול ולשטוף splenocytes כמו צעדים 2.2.1 - 2.2.3. Lyse כדוריות דם אדומות כמו צעדים 2.3 - 2.3.2.
2. להסיר תאים עבור ספירה באמצעות של hemocytometer, לחישוב ריכוז סופי של תאים ב- 10⁶ תאים למ"ל בפתרון תיוג CFSE (המתוארים בשלב 7). ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות-475 x ג וביופסיה תגובת שיקוע.

6. פפטיד הפועמים של יעד Splenocytes

הערה: פפטיד הפועמים חייב להתבצע בצורה סטרילית.

1. Resuspend תאים על 10⁶ תאים למ"ל בתקשורת מלאה (RPMI 1640 מדיה עם 10% FBS, 1%-גלוטמין (L-זאת שוב), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת)). לחלק את התאים 2 צינורות (conicals 15 מ"ל). תווית כל שפופרת פעמו או unpulsed.
2. הוסף פעמו פפטיד כדי ברכבת התחתית. תווית. עבור ביצית_257–264 הפועמים, להוסיף 1 µg/mL, hgp100_25–33 הפועמים, להוסיף 2 µg/mL.
   הערה: התאים unpulsed עוברים הדגירה זהה של התאים פעמו רק בלי תוספת פפטיד.
   1. דגירה תאים + פפטיד ב 37 ° C עבור 1 h.
3. להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה (RPMI 1640 מדיה עם 10% FBS, 1%-גלוטמין (L-זאת שוב), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת)) כדי כל שפופרת לשטוף שניהם פעמו ו unpulsed התאים היעד. ספין התאים הנותרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות-475 x ג וביופסיה תגובת שיקוע.

7. הכנת CFSE עבור תיוג יעד Splenocytes

1. להכין פתרון תיוג CFSE במהלך לתא הכביסה בשלב 6.3; התאים פעמו יסומנו כסעיפים CFSE^{. היי} , את unpulsed כמו CFSE^הלאו. להכין 1 מ"ל של פתרון תיוג CFSE 10⁶ תאים.
   הערה: CFSE הוא רגיש אור, צריך להיות מוגן מפני אור בכל עת.
   1. להכין CFSE^היי -תיוג מדיה על-ידי הוספת 1 uL/mL CFSE (פתרון מניות 5 מ מ) עבור ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר/mL בתקשורת RPMI 1640 עם 2% FBS.
   2. להכין CFSE^הלאו -תיוג מדיה על-ידי הוספת 1 uL/mL CFSE (פתרון מניות 0.5 מ מ) עבור ריכוז סופי של 0.5 המדיה RPMI מיקרומטר/mL 1640 עם 2% FBS.

8. תיוג של היעד Splenocytes עם CFSE

הערה: תיוג CFSE חייב להתבצע בצורה סטרילית.

1. Resuspend תאי היעד פעמו ו- unpulsed (מתוך שלב 6.3) 10⁶ תאים למ"ל תיוג CFSE מדיה. Resuspend התאים פעמו עם מוכן CFSE^היי-תיוג מדיה והתאים unpulsed עם מוכן CFSE^הלאו-תיוג מדיה.
2. מערבבים תאים ומדיה תיוג CFSE על-ידי היפוך עדין או לטמיון. אינן מתאימות על ידי vortexing דגירה תאים, תיוג CFSE מדיה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות רמיקס התאים בכל 5 דקות.
3. להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה תאי השעיה ו ספין כל תא בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב g 475 x.
4. האחות תגובת שיקוע, resuspend תאים ב- PBS קר 10 מ"ל. לסובב תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 475 x g.
5. חזור על שלב 8.4.
6. לספור את התאים ואת תערובת פעמו פפטיד, CFSE^היי-עם unpulsed, CFSE^הלאותוויות-שכותרתו תאים ביחס של 1:1 להזרקה לתוך עכברים הנמען. לשמור על aliquot של עונה 1 פרק 10⁶ מעורב תאים לשימוש עבור הערכה cytometry זרימה בסיסית (סעיף 11).
   הערה: עוצמת הקול הסופי להזרקה היא µL 100 לכל העכבר. ספירת הסופי הוא 10e6 תאים. אובדן נפח המזרק ואת המחט צריך להילקח בחשבון והוא צריך להיות מוערך 500 µL.

9. הזרקה של תאי המטרה

הערה: לשמור על התווית על-ידי CFSE תאים מוגן מפני אור לפני ובמהלך ההזרקה ככל האפשר.

1. את המקום הנמען עכברים C57BL/6 ב restrainer עם הצד הגבי. תרסיס הזרקת הזנב שטח הבסיס עם אלכוהול איזופרופיל 70%. לנהל µL 100 של תא בודד השעיה לווריד לווריד הזנב עם הצד שיקוע פונה כלפי מעלה.

10. בידוד מחדש של התאים היעד

הערה: העיתוי של שלב זה הוא קריטי, תלויים cytotoxicity CTL את הכוח של אנטיגן לגירוי. להערכת ברצח היעד פעמו_257–264 ביצית, התאים צריכים להיות שנקטפו 4-6 שעות לאחר ההזרקה. מאז התווית על-ידי CFSE תאים הם טחולים רגיש, תהליך אור בחושך.

1. המתת חסד העכברים C57BL/6 הנמען בהתאם לשיטה חנק שאושרו CO₂ .
2. הסר spleen(s) כמו שלב 2.1.1. Disaggregate הטחול ולשטוף splenocytes כמו צעדים 2.2.1 - 2.2.3. Lyse כדוריות דם אדומות כמו צעדים 2.3 - 2.3.2.
3. Resuspend התאים בתא פלורסצנטיות מופעל 1 מ"ל, מיון (FACs) מאגר (1% BSA + PBS) להערכת מאת cytometry זרימה.

11. gating ההיגיון לקבוע CTL פעילות על-ידי Cytometry זרימה

1. לבצע הערכה של CTL פעילות באמצעות פרוטוקול cytometry זרימה רגילה. רוכשים תאים באמצעות ערוץ FITC על cytometer זרימה עם 488 ננומטר לייזר עירור¹¹.
   1. שער על לימפוציטים בשידור חי באמצעות הפרמטרים פיזור (האס) לעומת פיזור קדמי (FSC) בצד. לעבד בתוך השער לימפוציט בשידור חי עבור מכלל האוכלוסייה CFSE-חיוביות.
      הערה: התאים התווית על-ידי CFSE מוזרק יפצה תת קבוצה קטנה של לימפוציטים הכולל נוכח הטחול. התאים CSFE-חיובית צריך להופיע שתי אוכלוסיות נפרדות בסולם יומן.
   2. השתמש בתבנית היסטוגרמה כדי לקבוע את אחוז unpulsed (השמאלי שיא, CFSE^הלאו) ואת פעמו (נכון שיא, CFSE^שלום) אוכלוסיות. אובדן תאי CFSE^שלום מציין פעילות CTL אנטיגן ספציפי.

לפני הזרקת תאי היעד התווית על-ידי CFSE, תערובת 1:1 תא מופעל cytometer זרימה כדי לקבוע את התדרים בסיסית של CFSEשלום והן CFSEהלאו התאים היעד. איור 1 א מציגה את האסטרטגיה חסימה כדי לזהות שינויים על האוכלוסיות CFSE, דרך שער הראשוני הוא עשה שימוש בפרמטרים FSC ו האס. התאים CFSE-חיובי מוחלט ואז subgated לפני הערכת שינויים בתדר, כמו אוכלוסייה זו הוא קטן יחסית בהשוואה splenocytes אנדוגני ללא תווית. התדירות היחסית של CFSEהי ו CFSEהלאו אוכלוסיות הוא המחושבים על-ידי הגדרת מכלל האוכלוסייה CFSE-חיוביות ב- 100%. ניתוח זה יכול להיעשות באמצעות תבנית מגרש היסטוגרמה או נקודה. דוגמה של התדירות היחסית של אוכלוסיות CFSE לפני הזרקת מוצג באיור 1ב'. יחס זה יהיה רק לעתים נדירות בדיוק 1:1, אבל צריך להיות ביורודיסני. נחיצות לקרקע covax מוצג באיור 1C שבו אני לא הורג אנטיגן פעמו, CFSEהיי התאים היעד נצפית ב- 24 שעות שלאחר ההזרקה. איור 1 D מדגים הריגתו יעיל של אנטיגן פעמו, CFSEהיי-שכותרתו התאים היעד הפסגה שנצפתה לפני ההזרקה היא כמעט מבלי שיבחינו, היחס הוא זז בצורה דרמטית מ 50% 1% בזיהוי. האיור מציג גם קינטיקה של אנטיגן פעמו, CFSEהיי-תווית הרג תא היעד באמצעות הערכת אובדן הזה האוכלוסייה בגיל 6-אייץ ' והן הזרקת דואר 24 שעות ביממה.

איור 1: השוואה של תאים עם תוויות על הבסיס לבין בעקבות הזרקת תאי היעד התווית על-ידי CFSE. (א) האסטרטגיה חסימה עבור הערכה של תפקוד CTL מוצג. בקצרה, לימפוציטים בשידור חי הן פיקוח באמצעות פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס) פרמטרים. תאים CSFE-חיובי הכולל הן subgated בתוך השער תא חי. היחס של CFSEהי ו CFSEהלאו מבוסס על התדר שלהם בהתאמה בתוך מכלל האוכלוסייה CFSE-חיוביות. (B) CFSE הבאה תיוג, התאים היעד מעורב 1:1, שקובעת את היחס של CFSEהי ו CFSEהלאו תאים על-ידי cytometry זרימה. המספרים מציינים התדירות של הפסגות בהתאמה היסטוגרמה (משמאל) והן CFSE vs האס נקודה מגרש (מימין) תבניות. (ג) מדגים את חוסר התאים היעד הורג ללא חיסון מוקדמת עם משטר covax. Splenocytes היו שנקטפו 24 שעות לאחר ההזרקה. (ד) מדגים הריגת פעמו אנטיגן CFSEהיי תאי היעד ב- 6-אייץ ' (תרשימים העליון) ורשום 24 h (תרשימים התחתון) הזרקה. המספרים מציינים את התדירות של הפסגות התווית על-ידי CFSE-היסטוגרמה (משמאל) והן CFSE vs האס נקודה מגרש (מימין) עיצוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.