הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56260

⸱

8 בנובמבר 2017

 ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

במאמר זה

סיכום

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

תקציר

תאי גזע עובריים, המושרה pluripotent ניתן לחדש את עצמי, להבדיל לתוך מספר סוגי תאים של הגוף. תאים pluripotent הם לפיכך חמד לחקר רפואה רגנרטיבית, נמצאים כיום ניסויים קליניים עבור מחלות עיניים, סוכרת, מחלות לב והפרעות אחרות. היכולת להתמיין סוגי תאים מיוחדים בשילוב עם ההתקדמות האחרונה הגנום עריכה טכנולוגיות כולל מערכת CRISPR/רשויות אישורים מספק הזדמנויות נוספות תפירת הגנום של iPSC ליישומים מגוונים כולל מחלת דוגמנות, טיפול, ממתח מסלולים של בידול, שם כמה. בין הטכנולוגיות העריכה זמינים, CRISPR/Cas9 מ הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס התפתחה ככלי של בחירה עבור עריכת בייעודי לאתר של הגנום האיקריוטים. CRISPRs הינם נגישים בקלות, זול ויעיל מאוד של הנדסת עריכות יישוב. המערכת מחייבת של נוקלאז Cas9 מדריך רצף (20-mer) ספציפי אל המטרה גנומית סמוכים 3-נוקלאוטיד "הגולה" protospacer-צמוד-מוטיב (פאם) עבור המיקוד Cas9 מיקומה גנומית הרצוי, לצד מכשיר מעקב איגוד אוניברסלי Cas9 RNA ( יחד הנקראת RNA מדריך בודד או sgRNA). כאן אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול לדור יעיל של iPSC מזין-עצמאית, ללא טביעת רגל. ומתארות מתודולוגיות לעריכה הגנום של iPSC באמצעות את מתחמי ribonucleoprotein (RNP) Cas9. הגנום עריכת פרוטוקול יעיל, יכול להיות מרובב בקלות על-ידי sgRNAs טרום-complexing עבור יעד אחד או יותר עם החלבון Cas9 ואספקה בו זמנית לתוך התאים. לבסוף, אנו מתארים גישה פשוטה עבור זיהוי ואפיון של iPSCs בעריכה הרצוי. יחדיו, האסטרטגיות מחולקת לרמות צפויים כדי לייעל את הדור ועריכה של iPSC ליישומים סעפת.

מבוא

תכנות מחדש של תאים סומטיים האנושי המדינה pluripotent על ידי ביטוי של התכנות גורמים יש מהפכה מחקר תאי גזע עם יישומים מידול המחלה, רפואה רגנרטיבית ו פיתוח תרופות. מספר שיטות התיכנות נגיפי זמינים עבור משלוח של התכנות גורמים ותפיק iPSCs, אבל התהליך עבודה אינטנסיבית, לא יעיל מאוד1. השיטות ויראלי, אבל יעיל, הם קשורים לבעיות של נגיף אינטגרציה ו- tumorigenicity-2,-3,-4. כתב יד זה, אנו מדווחים על השימוש של וירוס סנדאי cytoplasmic התכנות גורמים מתן ו הקמת קווי ללא טביעת רגל iPSC חוסר אינטגרציה של כל רצפי וקטור ויראלי לתוך הגנום שלהם5. סנדאי וירוס הוא וירוס רנ א הוא מדולל מחוץ לתא הציטופלסמה ~ 10 קטעים לאחר הזיהום ומייצרת גורמים התיכנות בשפע, שמוביל מהיר ויעיל התכנות6,7. IPSCs הוקמה יכול ואז ניתן בקלות לקביעת נטולת מזין בינוני כדי למנוע את השימוש בעכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) כ מזין תאים8.

בפרסום זה, בנוסף חלוקה לרמות את הוירוס סנדאי מתווכת התכנות, אנו מתארים גם פרוטוקול משופרת עבור עריכת iPSCs, אשר יש הפוטנציאל לספק תאים אנושיים ללא הגבלה עם שינויים גנטיים הרצוי למחקר. השתמשנו בטכנולוגיה CRISPR/Cas9 עבור השינוי של iPSCs, אשר נמצא כעת בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים כולל תוספות לדפוק על הדלת, הסתרה, מחיקות גנומית רחבת היקף, במאגר הספרייה הקרנת לגילוי גנים, הנדסה גנטית של מודל אורגניזמים רבים, ו ג'ין טיפול9,10,11. טכניקה זו כוללת הקמת מתחמי של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת-נגזר נוקלאז Cas9 20-מר מדריך RNAs להשיג זיהוי המטרה באמצעות בסיס תיאום עם רצף גנומית היעד הסמוכים סמוכים ב נוקלאוטיד protospacer 3' רצף מוטיב (פאם). נוקלאז Cas9 המניע של נוקלאוטידים הפסקה נטושים זוגי ~ 3 מאתר פאם, אשר לאחר מכן תוקן בעיקר עד סוף שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) לשביל המוביל שהתוספות או המחיקות מסגרת קריאה פתוחה, ובכך פונקציונלי הסתרה של הגנים12.

פרוטוקול משופר שלנו כוללת את הפרטים עבור התרבות של תאים בלבלב האנושי, שלהם התכנות על mitotically לא פעיל העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) כדי להשיג יעילות גבוהה יותר של התכנות, עיבוד עוקבות לתרבות נטולת מזין על Matrigel, אפיון הוקמה iPSCs, CRISPR מודרכת RNA עיצוב ו הכנה, משלוח לתוך iPSCs כמו מתחמי RNP, תא בודד מיון כדי ליצור שורות המשובטים iPSCs הערוך, קל הקרנת זיהוי של עריכות, ואפיון של תא בודד שיבוטים. מחיקות גנומית נוצרו ביעילות במחקר זה המבוא של חלבונים Cas9, שני CRISPR sgRNA RNP מתחמי לזירוז מעברי זוגי נטוש (DSBs), מחיקה של ההתערבות קטע. שיטה זו הופך לרישית על השימוש של שני מדריכים ליצירת מחיקות מסגרת קריאה פתוחה, יעילות גבוהה של NHEJ שמוביל מספר נמוך של שיבוטים הזה צריך להתאפיין ולאחר סינון ראשוני קל של שיבוטים מאת נימי אוטומטית יחידת אלקטרופורזה, פרגמנט מנתח. אלה הגנום יעיל עריכה שיטות ליצירת מודלים מבוססי תאי גזע מחלות אנושיות תהפוך בקרוב גישה סטנדרטי, לא שגרתית במעבדה תאי גזע כלשהו. לבסוף הגנום מדויק עריכה יהפוך את זה אפשרי ללכת מעבר לתאי גזע המחלה דוגמנות, פוטנציאלי יכול לעזור לעודד טיפולים מבוססי תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פרוטוקול התכנות

  1. דור של iPSC אנושי מתאי הלבלב אנושי ראשוני
    1. מעיל 6-באר צלחת עם קולגן קר 1.5 mg/mL ולאפשר לו ג'ל ב 37 ° C עבור ה 1
    2. צלחת בתחילת המעבר האנושי בתאי הלבלב הראשי השלישי Prigrow בינוני (~ 1-1.5 × 10 5 תאים) על קולגן מצופה צלחת 6-טוב על יום-2 להשיג כ 2.5 × 10 5 תאים או לפחות 60% confluency לכל טוב ביום התמרה חושית (יום 0). לצורך המחקר הראשונה, צלחת לפחות 2-3 בארות להגיע באר אחת עם confluency הרצוי ביום 0. להשתמש לפחות טוב כמו פקד לספור את התאים.
    3. ביום של התמרה חושית (יום 0), לחמם 1 מ"ל של Prigrow השלישי בינוני באמבט מים עבור כל טוב להיות transduced. לקצור את התאים מפקד אחד לפקד טוב ב 1 מ"ל של 10% FBS מדיום באמצעות 1 מ"ל של טריפסין/EDTA במשך 5 דקות או עד לנתק התאים לבצע ספירת תאים. כדי להפוך את 10% FBS בינונית, להוסיף DMEM, 10% FBS, 1%-גלוטמין, 1% נתרן פירובט ו 1% חומצות אמינו שאינן הכרחיות.
    4. ספירה, לבדוק את הכדאיות של התאים באמצעות הדלפק תא, לחשב את הנפח של כל וירוס צריך להגיע ליעד בהתבסס על מספר ווירוסים כייל התא. השתמש ריבוי של זיהום (MOI) של קוס (kos) = 5, hc-Myc = 5 ו- hKlf4 = 3 עבור התאים בלבלב.
    5. סט אחד הפשרה סנדאי וקטור צינורות במחסן-80 ° C על קרח ולהוסיף בזהירות את נפחי מחושב כל אחד הצינורות וקטור סנדאי שלוש 1 מ"ל של Prigrow השלישי בינוני, מראש התחמם עד 37 ° ג פיפטה בעדינות כדי לערבב את הפתרון. באר אחת לתוך צלחת 6-ובכן מספיקה transducing עם וקטורים ויראלי סנדאי ליצירת תאים מחדש.
    6. תשאף המדיום Prigrow השלישי את התאים, ולהוסיף לאט את התערובת וירוס התיכנות הבארות המכילות את התאים. דגירה התאים לילה בחממה 37 ° C עם אווירה humidified של 5% CO 2.
    7. בקפידה למחוק את התערובת וירוס על תאים והחלף בינוני Prigrow השלישי טרי ביום המחרת, 24 שעות לאחר התמרה חושית. התרבות התאים עבור 5 d ולשנות את המדיום כל יום חלופי.
    8. ביום 5, להכין MEFs על 0.1% ג'לטין מצופה מראש 10 ס מ תרבות מנות (1.3 x 10 6 תאים/מאכל). לגדול MEFs ב T175 מבחנות עד ליום 4 ולחשוף ואז ביום 5, התאים 6,000 rads ממקור קרינה-γ לפני זריעה של תאים 13 או שימוש המקור MEF מסחרי.
    9. ביום 6, להשתמש 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא עבור 10 דקות כדי לנתק את התאים transduced, לוחית רישוי כולן על מנות MEF השלישי Prigrow בינוני עם מעכב רוק (5 מ מ מניות, הסופי 10 מיקרומטר), דגירה בין לילה בחממה 37 ° C עם atmosphe humidified re של 5% CO 2.
    10. לשנות המדיום השלישי Prigrow בינוני hESC למחרת. להכנת 500 מ"ל של hESC בינונית, להוסיף DMEM/F-12, 20% (v/v) נוקאאוט סרום חלופי (KOSR), bFGF ng/mL 5; 1 מ מגלוטמין; 100 מיקרומטר חומצות אמינו שאינן חיוניות, 100 מיקרומטר מרקפטואתנול. מחליף המדיום בעדינות כל יום עכשיו.
    11. להתבונן הלוחות באופן קבוע על התפתחותה של התא גושים או מושבות מעידה על תאים מחדש. התאים טרנספורמציה טופס אגרגטים המשובטים עם מורפולוגיה המרוצף, גרעין גדול, nucleoli. לסמן את סבירות ' iPSC ' מושבות ולבדוק את אותם באופן קבוע לצמיחה.
    12. כמעט ארבעה שבועות לאחר התמרה חושית כמו מושבות מוכנים האיסוף או ההעברה, להכין 24-ובכן MEF צלחות על ידי ציפוי 1.3 x 10 6 תאים/ג'לטין לצלחת מצופה מראש כמו קודם להעברת מושבות יחיד.
      1. הכן מטריקס ממברנה (למשל, Matrigel) על ידי aliquoting שזה מבוסס על הגורם דילול שבאישור של ניתוח. להוסיף aliquot אחד מ 25 ל DMEM/F-12 את המעיל 6 4-טוב צלחות (1 מ"ל/טוב), תקופת דגירה בטמפרטורת החדר (RT) לפחות שעה לפני השימוש. לבחור באופן ידני 12-24 מושבות באמצעות פיפטה-טיפ סטרילי כדי תשאף אותם ולהעביר אל הצלחות MEF 500 µL בינוני hESC.
      2. תשאף התקשורת בתוך הבאר בעדינות לשבש או להפריד את המושבות. גם לבחור 24-48 המושבות של מטריקס מצופה קרום. ובכן 24 צלחות. עבור לוחות מצופה קרום, להשתמש mTeSR1 (בתוספת 10 מיקרומטר רוק מעכב) עבור 24 שעות ולהחליף כל יום. בתוך 6-10 ד' של איסוף מושבות, הם מוכנים להעביר את הצלחות ממברנה 24-ובכן ו/או 12-ובכן חדש עבור משובט הרחבה.
    13. במידת הצורך, נתק את המושבות על MEFs באמצעות 1 מ"ג/מ"ל collagenase למשך 20 דקות, לשטוף פעמיים עם hESC/mTeSR1, העברת ממברנה מצופה לוחות 12 או 24-ובכן. אם יש מספיק מושבות החזקה גוברת על קרום מטריקס מהשלב 1.1.12, להקפיא את המושבות על MEFs באמצעות iPSC קפוא המדיה לפי היצרן ' הנחיות s.
    14. לנתק את המושבות עמיד מצופה על הקרום בשלב 1.1.12 באמצעות µL 500 של dispase עבור 20 דקות, צלחת שוב על מטריצה ממברנה מצופה לוחות 12-. טוב. לגרד באופן ידני את כל תאים או מזהמים MEF מזין תאים להעשיר עבור pluripotent שיבוטים על הקרום.
    15. הרחב השיבוטים לאחר 6-8 d על ידי הגדלה על קרום מצופה לוחות מאת בריא עם פתרון dispase כמו לפני ציפוי אגרגטים תאים קטנים על קרום טרי מצופה צלחת 6 או 12-ובכן. שינוי mTeSR1 בינוני מדי יום. מאפיינים מהעותקים reprogrammed על ידי phosphatase אלקליין מכתים, immunostaining לניתוח pluripotency סמנים (OCT3/4 ו- NANOG), FACS של סמני פני pluripotent, מבחני בידול. לגדול ו תרבות השיבוטים על צלחות מצופה קרום עבור כל מבחני כולל CRISPR עריכה כפי שהוסבר לעיל, אלא אם כן פתרון ציפוי אחר מוזכר במפורש.
  2. IPSCs אפיון של זכויות
    1. מכתים Phosphatase אלקליין
      הערה: ערכת מסחרי משמש כאן. עיין בטבלה חומרים.
      1. צלחת בשם האדם iPSCs על צלחת 24-ובכן והתרבות במשך 4-5 d בשינוי מדיה מדי יום.
      2. להפעיל את פרוטוקול מוכתמים, תשאף המדיום תרבות ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 1 x עם 0.05% Tween 20 (PBST).
      3. להוסיף 0.5 מ של פתרון בערכה של התאים ואת תקופת דגירה-RT של 2-5 דקות לשאוב הפתרון ולאחר מכן לשטוף את התאים קבוע עם PBST. אל תאפשר הבארות להתייבש.
      4. להוסיף 0.5 מ ל שזה עתה הוכנו AP המצע פתרון לכל טוב על ידי ערבוב פתרון A, B ו- C. Incubate את התאים בחושך (עטוף בנייר כסף או במיכל חשוך) בטמפרטורת החדר במשך 5-15 דקות
        הערה: מקרוב לפקח שינוי הצבע, לעצור את תגובת כאשר הצבע הופך בהיר כדי למנוע כתמים שאינם ספציפיים.
      5. לעצור את התגובה על ידי כ רפה בעברית הפתרון המצע AP ושטיפת הבארות פעמיים עם 2 מ ל 1 x PBS.
      6. להתבונן המושבות מתחת למיקרוסקופ, ללכוד את התמונות 4 X או 10 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כלשהו עם מצלמה.
    2. Immunostaining
      1. צלחת iPSCs האנושי צלחת 24-ובכן ותרבות עבור 4-5 יח בשינוי מדיה מדי יום.
      2. לשטוף את התאים פעם בקצרה עם PBS, תיקון עבור 20 דקות עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS.
      3. שלוש פעמים בשביל 10 דקות (3 x, 10 דקות) עם PBS ב RT.
      4. Saturate אתרים שאינם ספציפיים עם 10% נורמלי עז או חמור סרום (NS, בהתאם הנוגדן משני בעלי חיים גדלה ב) ב- PBS למשך 40 דקות ב- RT. עבור רק תאיים epitopes, לכלול 0.3% TX-100 ב- PBS (TX/PBS) כדי permeabilize.
      5. שטיפת 3 x 5 דקות עם PBS ב RT.
      6. לדלל את הנוגדנים OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5, SOX17 בריכוז של 5% טרי NS ב- PBS דגירה עבור 2 h ב- RT או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס
      7. לשטוף x 3 עבור חמש דקות עם PBS ב RT.
      8. לדלל המתאים משני אלקסה 488 עבור חיל הים או נוגדנים 568 ב- 5% NS/PBS דגירה תאים עבור 1 h RT.
      9. לשטוף x 3 עבור 5 דקות ב- RT.
      10. תקופת דגירה עם דאפי ב- PBS של 10 דקות ושטוף 2 x עבור 5 דקות RT. בשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצלם תמונות.
    3. לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית התא מיון (FACS)
      1. iPSCs האנושי צלחת צלחת 6-ובכן ותרבות עד המושבות להיות 80% confluent (לפחות 10 5 תאים /sample) בשינוי בינוני mTeSR1 היומי-
      2. ביום של הניסוי, לבודד את התאים ואת מביצועם כדי השעיה תא בודד, כפי שהוסבר לעיל בפרוטוקול. תשטוף עם 10% FBS בינונית.
      3. עבור סמני פני השטח, resuspend של 0.5-1 מ ל 10% FBS בינוני ולשמור על קרח
      4. עבור סמני תאיים, resuspend ב 1 מ"ל של 4% מחברים/PBS דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 10% FBS בינוני. Resuspend 0.1% TX/PBS דגירה למשך 15 דקות על קרח. לשטוף שוב עם 10% FBS בינוני. Resuspend ב 0.5-1 מ ל 10% FBS בינוני ולשמור על קרח
      5. להוסיף 50 µL של התליה תא ל 50 µL של 10% FBS המכיל בינונית מומלץ כמות TRA-1-60, TRA-1-81 או נוגדנים SSEA-4, תקופת דגירה של 30 דקות לח' 1
      6. לשטוף פעמיים עם 10% FBS.
      7. Resuspend ב µL 100 10% FBS בינוני המכיל נוגדנים משניים פלורסנט, תקופת דגירה של 30 דקות לשטוף פעמיים עם 10% FBS ו resuspend נפח מתאים של 10% FBS. ניתן להבחין את התאים הפועלים של תאים מתים על ידי צבע יודיד propidium שמתווסף < 1 µg/mL כדי להעריך תא אפופטוזיס במהלך התהליך.
    4. בידול Tri-השושלת
      1. זרע שתי צלחות 6-ובכן עם 1.5-2 x 10 6 iPSCs/טוב mTeSR1 בינוני עם 10 מיקרומטר רוק מעכב.
      2. מאפשרים לתאים לגדול במשך 2-3 d בשינוי מדי יום mTeSR1 בינוני עד הבארות 80-90% confluent.
      3. האאקטודרם אינדוקציה, הוסיפו אינדוקציה עצבי בינוני (נים) על פי היצרן ' הוראות s ב- 2-3 בארות של הלוחות 6-ובכן.
      4. לשנות את המדיום RPMI המכיל 2% B27 תוספת פחות אינסולין ו- 12 מיקרומטר CHIR99021 עבור אינדוקציה והמזודרם ב 2-3 בארות של צלחות 14. הוסף RPMI היחיד המכיל 2% B27 תוספת פחות אינסולין עבור מיקרומטר להוסיף 5 הבא ה 24 IWP4 למדיום RPMI עם 2% B27 תוספת פחות אינסולין עבור ה 24 הבא. לאחר 72 h, להחליף את המדיה RPMI המכיל 2% B27 תוספת שמוביל הדור של מכה cardiomyocytes ד 2-3
      5. עבור אינדוקציה האנדודרם, לשנות את המדיום בבארות הלוחיות 6-טוב כדי MCDB 131 בתוספת 1.5 g/L סודיום ביקרבונט, 1 x Glutamax גלוקוז 10 מ מ, BSA 0.5%, 100 ננוגרם למ"ל GDF8, 5µM של CHIR99021 עבור ה 24 תרבות המדיום אותו מבלי CHIR99021 עבור 2-3 d 15.
      6. לעקוב אחר הפרוטוקול immunostaining מ שלב 2 עבור כל שושלות שלושה ולבדוק אם הביטוי של סמנים רלוונטיות.

2. הגנום iPSC עריכה של האדם באמצעות CRISPR-Cas9

  1. חלבון הכנה של Cas9 ו sgRNA
    1. Aliquot Cas9 החלבון לתוך צינורות microcentrifuge בתנאים סטריליים ולאחסן את aliquots על ידי הקפאת הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס
    2. עיצוב 2 מיקוד מדריך RNAs לכל הגן מבוססת על התוכנה מ- MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) או כל אחרים CRISPR מדריך עיצוב webtool. יעד אקסון הראשון או השני של הגן (מבוסס על מסגרת קריאה פתוחה) כדי ליצור הסתרה. בחר שני מדריכים כך הם חתכו ביחד (~ 30-100 bp בנפרד), שאנו יכולים בקלות לדמיין את המחיקה באמצעות אותה קבוצה של הקרנת תחל. בחר המדריכים פלט התוכנה על בסיס ציון איכות גבוה יותר מספר נמוך יותר של חופש-יעד אתרים. עיצוב תחל ההקרנה באמצעות הפיצוץ תחל תוכנית (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). הקרנת תחל צריך להיות לפחות 100 bp מן Cas9 אתרים גזורה גודל המוצר PCR צריך להיות רצוי בין 400-700 bp הגברה קלה יותר על-ידי ה-PCR-
    3. עיצוב oligo שני sgRNA משלימים את DNAs (19-22 נוקלאוטידים אורך בהתאם רצף מדריך) עם Bsa1 לחתוך את האתר בכל קצה. יכול להיות מסונתז באופן מסחרי, annealed כדי ליצור זוגיות-גדיל DNA oligo DNAs. עבור חישול, להוסיף 1 µL כל המדריכים 100 מיקרומטר, 25 µL של חישול מאגר (10 מ"מ טריס, pH7.5-8.0, 50 מ מ NaCl, 1 מ"מ EDTA) ו 23 µL של מים. דגירה ב thermocycler מתוכנתת להתחיל ב 95 ° C וקירור 2 דקות ואז בהדרגה עד 25 ° C מעל 45 דקות
    4. שיבוט µL 2 של קטע שנוצר לתוך באנזים הגבלה Bsa1 מתעכל µL 1 של וקטור pCR2.1 של יזם T7 פנימית עם אתר איגוד Cas9 באמצעות T4 DNA ליגאז לפי היצרן ' פרוטוקול s.
    5. רצף שברי DNA משובטים, כשנוצר נאמנות, במבחנה לתמלל שיבוטים באמצעות ערכת T7 ליצירת מדריך בודד RNAs. לטהר את sgRNAs עם ערכת מסחרי, elute במים נטולי RNase. בדוק את הריכוז רנ א.
  2. תרביות תאים של hiPSCs
    1. תרבות hiPSCs mTeSR1 בינוני, כפי שתואר לעיל, עד שהתאים confluent 40-50%.
    2. שעתיים לפני nucleofection, להחליף את המדיום 2 מ של prewarmed mTeSR1 בינוני המכיל 10 מיקרומטר רוק מעכב.
    3. שעה אחת מאוחר יותר, הכן בארות היעד עבור תאים nucleofected על ידי קרום שואבת, המוכן לעיל, 12-ובכן צלחת והחלפה עם prewarmed 1 מ"ל mTeSR1 בינוני עם 10 מיקרומטר רוק מעכב. לשמור על 37 ° C עבור הדגירה.
      4. תוספת
    4. הכנת nucleofection מאסטר מיקס (סולם כראוי בהתאם הדגימות) עבור כל דגימה על-ידי הוספת 16.4 µL של התא הראשי P3; µL 3.6 של תוספת 1 מתוך ערכת nucleofector; µg 0.5 Cas9 חלבון ו- 0.5 µg של כל sgRNA ב- µL 22 לכל אמצעי אחסון התגובה. pMAX GFP וקטור היה גם nucleofected לפי היצרן ' המלצות s בתאים כדי להעריך את היעילות של תרביות תאים iPSC בערך.
    5. לרחוץ כל טוב עם 2 מ של RT PBS לאחר כ רפה בעברית המדיום המכיל מעכבי רוק מן הבארות iPSC. אז תשאף PBS, להוסיף 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
    6. Resuspend התאים 3 מ"ל של mTeSR1 בינוני, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי להפיק השעיה תא בודד. העברת הפומבית לתאים צנטריפוגה 15 מ"ל צינור המכיל 5 מ"ל mTeSR1 בינונית.
    7. לספור תאים עם מונה תא, לחשב את הנפח הכולל הנדרש 0.5 x 10 6 תאים/תקנים. למקם את הכמות הרצויה של תאים בצינור צנטריפוגה 15-mL, צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב RT, תשאף תגובת שיקוע.
    8. Resuspend כל יחידה של 0.5 x 6 10, בתאים µL 22 של תרביות תאים לערבב מאסטר מוכן בשלב 4. במהירות העברת תאים אל החדר המרכזי של אחד טוב של רצועה nucleocuvette. למקם את הרצועה המכשיר nucleofector ותאי nucleofect באמצעות תוכנית CB150.
    9. לאחר nucleofection, להוסיף במהירות 80 µL prewarmed mTESR1 בינוני המכיל 10 מיקרומטר מעכב רוק מכל קידוח של תאי nucleofected. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    10. בעדינות להעביר תאים מרצועת בארות של קרום מצופים מראש 12-ובכן צלחת המכיל mTeSR1 בינוני עם רוק המדכא מוכן בשלב 3.
    11. d לאחר 1, שנה לבינונית mTeSR1 טריים ללא רוק מעכב. קציר תאים 2-3 d לאחר nucleofection למיון החד-תאיים.
  3. תא בודד בידוד של יישוב hiPSCs
    1. יום אחד לפני המיון, להכין 96-ובכן MEF הצלחות על-ידי זריעת 2 x 10 6 תאים/ג'לטין-מצופה צלחת 10% FBS בינוני. כ- 70-80% של השיבוטים לשרוד לאחר nucleofection ו 2-3 MEF צלחות ניתן להכין עבור עריכת ניסוי.
    2. בעקבות הדגירה לילה, לשנות את המדיום לבינונית hESC (כמתואר לעיל) בתוספת 100 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (מעכבי הוסיף בכלי התקשורת כדי לשפר את יכולת הקיום של תא בודד), ו- 5 מ"ג/מ"ל fibronectin לקדם אדהזיה.
    3. להחליף את המדיום-hiPSCs בצלחת 12-ובכן מ mTeSR1 ל mTeSR1 בינונית בתוספת 1 x SMC4 כבר לפחות שעתיים לפני מיון יחיד תא.
    4. תשאף האמצעי hiPSCs ולשטוף את התאים בעדינות עם PBS. מוסיפים µL 500 בפתרון ניתוק התא מכל קידוח, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחר כ רפה בעברית, טוב, מגניב. צור התליה תא בודד על-ידי הוספת 1 מ"ל של mTeSR1 (unsupplemented) מכל קידוח pipetting למעלה ולמטה בעדינות מספר פעמים.
    5. למקם את ההשעיה תא צינור חרוטי 15-mL, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g בתגובת שיקוע RT. וביופסיה, resuspend תאי 1 מ"ל של mTeSR1.
    6. מיון תאי תאים בודדים באמצעות של סדרן התא עם זרבובית 100 מ מ בתנאים סטריליים עם תא אחד בבאר בודדים של הלוחות 96-ובכן מוכן בשלב 1-
    7. ארבעה ימים לאחר מיון, המושבה היווצרות בלאו; בשלב זה להחליף את המדיום תרבות בתוספת 1 בינוני hESC x SMC4.
    8. שמונה ימים לאחר מיון, להחליף בינוני בינוני hESC והתרבות 2 ד
    9. לנתק את המושבות באמצעות 1 מ"ג/מ"ל collagenase עבור 20 דקות ומעבירים אותם אל הצלחות מצופה קרום 24-טוב mTeSR1 עם רוק מעכב. תן שיבוטים תא בודד לגדול ולחלץ את הדנ א הגנומי שלהם לאחר שכפול או להרחיב אותם. השתמש תחל ספציפי ג'ין כדי להגביר את המטרה-DNA על ידי ה-PCR-
    10. שימוש פרגמנט מנתח עבור ערכת הקרנה הראשונית של ה-PCR היעד מוגבר באזור גנומית של שיבוטים כל על-ידי הפעלת אותם באמצעות הג'ל/לצבוע לערבב לפי היצרן ' s הוראות. לאמוד את גודל המקטע שנוצר בתוכנה PROSize על-ידי השוואתה עם הסולם המתאים, אשר מנוהל עם הדגימות. רצף את הצפוי ' נערך ' שיבוטים וניתוח רצפי הנתונים כדי לאשר את עריכת או המחיקות.
    11. עבור המבדילים שיבוטים monoallelic ו- biallelic, להגביר את רצף הערוך עם ה-PCR, שיבוט של וקטור pJET1.2. לשלוח לפחות 8-10 שיבוטים עבור רצף ולבדוק את הרצף לאשר עריכה של אחד או שני אללים.
    12. ברגע iPSC בהצלחה יישוב שיבוטים זוהו באמצעות genotyping, לבחון כדי לאשר כי הם לא איבד pluripotency או צבר העיוותים כרומוזומלית בתהליך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בפרסום זה, אנו עוקבים אחריו פרוטוקול פשוט אך יעיל לדור של iPSC מתאי הלבלב האנושי באמצעות שילוב או ללא טביעת רגל וירוס סנדאי וקטורים. איור 1A מציג ייצוג סכמטי של פרוטוקול זה התיכנות. התאים בלבלב האנושי נרכשו מסחרית, תרבותי השלישי Prigrow בינוני, transduced עם וירוס סנדאי כפי שהוסבר לעיל. Transduced פלך בצורת בתאי הלבלב לא הראתה שינויים מורפולוגיים ~ 5 ימים לאחר התמרה חושית סנדאי וירוס ביום 0, אך אז להיות מעוגל עם גרעין גדול יותר, nucleoli. כמה מושבות הראשונים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תכנות מחדש של תאים סומטיים האנושי iPSCs סיפקה דחיפה גדולה בתחומי מחקר בסיסי ביולוגיה, רפואה אישית, מידול המחלה, פיתוח תרופות, רפואה רגנרטיבית16. שיטות רבות הנוכחי והשימוש בהם נפוץ דור אנוש iPSC דורשים שימוש וירוס עם הסיכון של אינטגרציה לתוך הגנום מארח או וקטורים episomal עם נמוך התכנות יעילות. כאן, אנו מציגים דרך יעילה ליצירת iPSCs נטולת מזין מתאי הלבלב האנושי עם סנדאי-וירוס, מה שמוביל ' חינם ' וטביעת התכנות יעיל. IPSCs האנושית וכתוצאה מכך הן ללא transgenes ויראלי, לשמור על pluripotency, להימנע מש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

BT הוא חבר מייסד של לשפץ החיים בע מ

תודות

העבודה במעבדה נתמך על ידי מענק בתר Nandal ד ר דני פחימה, וגראנט גישוש קרן מחקר תאי הגזע מרילנד ל BT (TEDCO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
וקטורים נגיפיים של סנדאי - CytoTune-iPS 2.0 KitInvitrogenA16517הפשרה על קרח; S מס': 1
טריפסין EDTAGibco Life Tech25300-0540.05%, 100 מ"ל; S מס': 2
מעכב סלעים (Y-27632)MiliporeSCM075השתמש ב-10 μ M; מס' S: 3
DMEM/F-12 בינוניInvitrogen11330-032S מס': 4
החלפת סרום (KSR)Gibco10828028S מס': 5
DMEMInvitrogen119600691X; S No: 6
סרום בקר עובריThermo ScientificSH30071.03Aliquot; S No: 7
L-גלוטמין (Glutamax, 100X), נוזליThermo Scientific350500611/100; S No: 8
חומצות אמינו לא חיוניותGibco11140-0501/100; S מס': 9
2-מרקפטואתנולגיבקו2198502355 מ"מ, 1/1,000; S מס': 10
Hausser HemacytometersHausser Scientific02-671-54S No: 11
0.1% תמיסת ג'לטיןSTEMCELL Technologies7903Incubate at 37º C למשך שעה; S מס': 12
נוגדן SSEA-4Santacruzsc-217041/100; S מס': 13
TRA-1-81 נוגדניםאיתות תאי4745S1/200; S No: 14
OCT4 נוגדןסנטה קרוזsc-52791/1,000; S מס': 15
קולגן I, Rat TailLife TechnologiesA10483-01שמור על קור; S מס': 16
Alexa Fluor פלואורסצנטי 488/568 (נוגדנים משניים)InvitrogenA21202/A100421/2,000; מס' S: 17
DPBSHycloneSH30028LS1X; S מס': 18
צלחת תרבית רקמה 100 מ"מFalcon353003S מס': 20
צלחת תרבית רקמה 96 בארותFalcon353078S מס': 21
צלחת תרבית רקמות 6 בארותFalcon353046S מס': 22
היקף ניתוח NikonSMZ745S מס': 23
קולט אדיםNuAireNU-301S מס': 24
15  צינור צנטריפוגה מ"לגריינר ביו-וואן188271S מס': 25
50  מ"ל צינור צנטריפוגהגריינר ביו-וואן227261S מס': 26
נתרן פירובטInvitrogen11360S מס': 28
&בטא;-מרקפטואתנולסיגמאM7522S מס': 29
Prigrow III בינוניABMTM003S מס': 31
רוזנות וסחר; Cell CounterInvitrogenC10227S No: 32
מערכת רנטגן FaxitronCellRadS מס': 33
AccutaseInnovative cell TechnologiesAT-104S מס': 34
CollagenaseLife Technologies17104019מלאי 1 מ"ג/מ"ל; S No: 35
DispaseSTEMCELL Technologies7923S No: 36
hESC מוסמך מטריג'לBD Biosciences354277לדילול, השתמש ב-DMEM/F-12 קר; מס' S: 37
bFGFR & D233-FBמלאי 10 ug/ml; מס' S: 38
ParaformaldehydeEMS157104% מניות ב-PBS; מס' S: 39
TRA-1-60סנטה קרוזsc-217051/100; מס' S: 40
NANOGReproCELLRCAB0004P-F1/100; S No: 41
Tween 20SigmaP9416-100MLS No: 42
ערכת פוספטאז אלקלייןStemgent00-0055S מס': 43
חלבון Cas9PNA BioCP01-50הפשרה ועליון; S No: 44
סרום עז או חמורSigmaD9663/G9023S No: 45
Triton X-100SigmaX100-100MLS No: 46
DAPIThermo ScientificD1306S No: 47
TrisSigma9285-100MLS No: 48
NaCLSigmaS7653-250GS No: 49
EDTASigmaBP2482-500S No: 50
T4 DNA ligaseNEBM0202TS No: 51
Mega Shortscript T7 kitThermo ScientificAM1354S No: 52
Mega Clear kitThermo ScientificAM1908S No: 53
SMC4BD Biosciences354357S No: 54
FibronectinSTEMCELL Technologies7159S No: 55
CloneJET ערכת שיבוטThermo ScientificK1232S No: 56
מנתח שברים TMAdvanced אנליטיS מס': 57
mTeSR1 ערכה בינוניתSTEMCELL Technologies5850חם לטמפרטורת החדר; S מס': 58
הקפאה בינונית mFreSR™STEMCELL Technologies5855S No: 59
מדיום הקפאה CryoStor®STEMCELL Technologies7930S No: 60
MEFsGlobalstemGSC-6301GS No: 61
L-glutamineInvitrogen25030081S No: 62
תאי לבלב אנושייםABMT0159S מס': 63
STEMdiff™ אינדוקציה עצביתטכנולוגיות תאי גזע5835S מס': 64
RPMIThermofisher11875-093S מס': 65
2% B27-אינסוליןThermofisherA1895601S מס': 66
CHIR99021Stemcell Technologies72052S No: 67
IWP4Stemcell Technologies72552S No: 68
2% B27Thermofisher17504044S מס': 69
MCDB 131Life Technologies10372019S מס': 70
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'S8761-100MLS מס': 71
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270-100GS מס': 72
BSAProliant68700S מס': 73
GDF8Pepro-Tech120-00S מס': 74
TUJ1 נוגדןEMD MiliporeAB9354S מס': 75
NKX2-5 נוגדןסנטה קרוזSC-14033S מס': 76
SOX17 נוגדןR & D מערכותAF1924S מס': 77
Propidium iodideThermo ScientificP3566S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™LonzaAAF-1002S מס': 79
FACSAria II (סדרן תאים)BD מדעי הביולוגיהSORP UVS מס': 80
בינוניות

מקורות

  1. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
  5. Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612(2012).
  6. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
  7. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594(2014).
  9. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
  10. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559(2017).
  11. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
  12. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
  13. McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
  15. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
  16. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
  17. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
  18. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPR Cas9 RNPiPSC Footprint freeNucleofectionFragment analyzer kit
דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.