פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה כדי לנטר את התא התמדה ואת biodistribution של האדם נגזר שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום תיוג במודל חולדה דלקת מפרקים ניוונית (קואה) הברך באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
על מנת לתמוך היישום הקליני של האדם נגזר שומן mesenchymal טיפול בתאי גזע (haMSC) עבור דלקת מפרקים ניוונית בברך (קואה), בדקנו את היעילות של תאים התמדה ואת biodistribution של haMSCs במודלים של בעלי חיים. להדגים שיטה לתייג את קרום התא של haMSCs עם lipophilic הפלורסנט. לאחר מכן, הזרקה תוך-מפרקיות של התאים עם תוויות בחולדות עם קואה בניתוח המושרה נוטרו באופן דינאמי על-ידי יישום ויוו מערכת הדמיה. אנחנו נוקטים את lipophilic carbocyanines עשה (DilC18 (5)), אנלוגי דיל (dialkylcarbocyanines) פלורסנט מרחיקת אדום, אשר מנוצל לייזר אדום כדי להימנע עירור של autofluorescence ירוק טבעי מן הרקמות הסובבות. יתר על כן, האדום-העביר ספקטרום הפליטה של מותר לדימות רקמות עמוק בבעלי חיים וההליך תיוג גרם ללא אפקטים ציטוטוקסיות או פגיעה תפקודית haMSCs. גישה זו הוכח להיות שיטה מעקב יעיל אחר עבור haMSCs במודל קואה חולדה. היישום של שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע את דרך ניהול אופטימלי ואת המינון של MSCs ממקורות אחרים במחקרים קליניים.
מבוא
דלקת מפרקים ניוונית בברך (קואה) היא הפרעה ניוונית הנובעות אובדן סחוס במפרק ודלקת מתקדמת, אשר הפך מרכזי מחלה כרונית אצל הקשישים ברחבי העולם1. עם זאת, טיפולים שוטפים באמצעות תרופות אנטי דלקתיות, תוספי הפיזי ניתוחים רק עשוי לספק הקלה זמנית לכאב סימפטומטי2.
האדם הנגזרות שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) הפכו להיות תרופה משובי מבטיח עבור דלקת מפרקים ניוונית בברך, בשל התמיינות multipotent שלהם פוטנציאל התחדשות הסחוס לבין מאפיינים immunomodulatory3, 4. לעומת מסלולים תרופתי לחקור מנגנונים של פעולה ויוו, מעקב אחר haMSCs בשידור חי במו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים היו אושרה על ידי בעלי חיים מוסדיים מקומיים אכפת ועדת האתיקה, במאמץ לצמצם את סבלם של בעלי החיים. פרוטוקול הבאים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) על אנשים התשיעית שנגחאי ’ s בבית החולים המסונף לקבוצת שנחאי ג'יאוטונג של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת עם הפרוטוקול מספר [2017] 063.
1-הקמת מודל דלקת מפרקים ניוונית בברך עכברוש Surgically-Induced
- עבור הליך כירורגי, שימוש בשבוע 8-12 בן זכר חולדות ספראג Dawley (SD) עם משקל הגוף בין 250 עד 300 ג'
- עזים ומתנגד החיות עם tiletamine 40 מ"ג/ק"ג, zolazepam 40 מ"ג/ק"ג דרך זריקה תוך שרירית.
- למקם את החיה במיקום הלט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בתערובות לזירוז דגם קואה, מ מ בוצעה ב המפרק ברך ימין של חולדות SD (איור 3). 8 שבועות לאחר הניתוח, חולדות הוקרבו, הסעיפים טורי של המפרקים בברך הוערכו עם שתי H & E ו- Safranin O/מהיר ירוק מכתים (איור 4). עבור H & E מכתים, פני השטח של הסחוס במפרק הציג גבולות גסים בברכיים ניתוח מאשר המפרק נורמלי בלי ניתוח. עבור Safranin-O/Fast ירוק מכתים, אנחנו נצפתה ירידה פרוטאוגליקן (צביעת אדום) והגדילה fibrillated קולגן (צביעת ירוק) בניתוח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תקני בטיחות ולימודים biodistribution של טיפול בתאי גזע נחוצים בדחיפות לפני שנוכל להביא משובי בתאי גזע לטיפול קואה מהספסל אל המיטה. עם זאת, הסביבה פתולוגי של המחלה ממלא תפקיד חשוב התמדה ו biodistribution של המושתלים haMSCs10. לאחרונה, הקבוצה שלנו הוכיח כי הזרקה תוך-מפרקיות של haMSCs שהתמידו עוד בסביבה קואה פתולוגיים מאשר זריקות תחת תנאים נורמליים8. זה אפשרי כי microenvironment ואת ניוונית דלקתית יכול לגייס את גזע mesenchymal לתיקון, לאחר מכן טובה השמירה של1.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
מנג Li, מינג Hao, ון וונג נמצאים העובדים הנוכחי ומחזיקים אופציות מקבוצת וההתערבות הסלולר (סימול: CBMG). המחברים אחרים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
תודות
המחקר הנוכחי נתמכה על ידי שנגחאי חדשנות מימון (1402H 294300) בחסות המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי העירייה (CN) כדי ד ר ון וונג. ברצוננו להודות ד ר גואנג-דונג ג'ואו (הלאומי רקמות הנדסה מרכז של סין) שלו סיוע וייעוץ טכני מדעי עבור כתב יד זה. אנחנו רוצה גם להודות מר Huitang שיה (החולים שנגחאי התשיעית לאנשים בבית) על עזרתו רווחת בעלי חיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת הרדמה לבעלי חיים Matrx VMR Midmark | VIP3000 | ||
| 4-0 תפר | שנחאי Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang מוצר לבריאות בעלי חיים ושות', בע"מ | אף אחד 0.9 | |
| % תמיסת נתרן כלורי | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | ||
| פניצילין | שנחאי Kangfu כימי פרמצבטיקה ושות', בע"מ | ללא | |
| בופרנורפין | טיאנג'ין מכון מחקר פרמצבטי פרמצבטי ושות', בע"מ | ללא | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | מדלל לריכוז סופי של 10% ב-PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | מדלל לריכוז סופי של 20% בתמיסת PBS |
| 0.1% Hematoxylin, Mayer' s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% תמיסת Eosin Y, אלכוהולי | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM מעבד רקמות | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 הטמעת רקמות Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| מיקרוטום סיבובי אוטומטי לחלוטין | Leica | RM2255 | |
| DiD | בדיקות מולקולריות, Life Technologies | V-22887 | |
| D-MEM גלוקוז גבוה | סיגמא-אולדריץ' | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 ס"מ צנטריפוגה פטרי | V118877 | ||
| צנטריפוגה | בקמן | אופטימה MAX-TL | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | אולימפוס | BX53 | |
| 0.4% תמיסת טריפאן כחולה | סיגמא-אולדריץ' | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50)1000000188 | ||
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| מזרק היפוסרמי סטרילי לשימוש חד פעמי 26G | שנחאי Misawa התעשייה הרפואית | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 תוכנה | PerkinElmer | None |
מקורות
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
