אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלת איברים, הפונקציה ואריכות ימיהם של השתל באורח קשה להסתמך על ההצלחה של שליטה דחייה אימונולוגי תגובתיות נגד אנטיגנים לויקוציטים אנושיים (הלע). הנחיות histocompatibility מבוססות על בדיקות מעבדה anti-הלע חסינות, המציג כמו קיימים גם או דה נובו שנוצר הלע נוגדנים המהווים מכשול השתלת הגדולות. בדיקות הנוכחי בנוי על פלטפורמה חרוזים יחיד-אנטיגן (SAB) באמצעות סט קבוע של אנטיגנים שנבחרו מראש ~ 100 הלע רקומביננטי כדי לחקור להשתלות סרה. עם זאת, אצל בני אדם קיימים מגוון גדול של סוגי הלע, עם אין שני אנשים שאינם תאומים זהים אשר יכולים לשתף אותו צירוף של רצפי הלע. ואילו טכנולוגיות מתקדמות הלע הקלדת ורצף ישירה בדיוק יכול ללכוד כל אי-התאמות ברצף ה-DNA בין תורם הלע של הנמען, וזמינותו SAB, בשל מגוון מוגבל בייצוג רצף, אין אפשרות לזהות במדויק alloantibodies ובמיוחד נגד התורם הלע התאמות. אנחנו ביקשו לפתח שיטה משלימים באמצעות טכנולוגיה שונים כדי לזהות ולאפיין התורם נגד נוגדנים הלע על בסיס אישי. הכלי ההקרנה הוא מערך פפטיד מותאם אישית של התורם נגזר הלע רצפי דורשים בדיקה שלאחר ההשתלה סרה של הנמען איברים כדי להעריך את הסיכון לדחייה בתיווך נוגדנים. על מערך יחיד עבור זוג התורם-נמען אחד, עד 600 פפטידים ייחודי מתקבלות של התורם הלע חלבון רצפים, כל פפטיד נושאת משקעים שאינם תואמים אחד לפחות ברצף חומצה אמינו 15. בניסויים הטייס שלנו כדי להשוות בין אנטיגן תבניות עבור קדם והשתלות שלאחר סרה על מערכים אלה, היינו מסוגלים לזהות אנטי-הלע אותות עם הרזולוציה המתאימה גם מאפשרת לנו לאתר את epitopes החיסון המעורבים. אלה אישית אנטיגן מערכים לאפשר זיהוי ברזולוציה גבוהה של epitopes הלע תורם ספציפי בהשתלת איברים.
מבוא
איברים טיפול זה מבוצע באופן שגרתי ברחבי העולם הציל חייהם של מיליוני אנשים. השתלת איברים מוצקים מתרחשת בחולים כ-100 לכל מיליון אנשים בארה ב מדי שנה, בעוד מספר גדול עדיין נמצאים על waitlists לקבל תורם איברים עקב מחסור חמור האספקה (על פי המידע הנמסר על ידי איבר המין השתלת רשת - OPTN/בוועדה ורכש: optn.transplant.hrsa.gov). איברים להשתלות הוא מאוד מווסתות על מנת לצמצם בזבוז איברים, להציל חיים, אבל בכלים מדעיים נהגו ליידע את התקנות האלה מוגבלים היעילות. למשל, הקהילה המדעית מזהה באופן מלא ארצות רב-צורתיות מאוד של מולקולות הלע, בדיקות גנטיות מדויק של ה-DNA באמצעות הקלדת ברזולוציה גבוהה המבוססת על רצף הקלדה (SBT) פותחו בשנים האחרונות1,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן הלוח מוסדיים סקירה (פרוטוקול IRB #: STU00104680). זרימת עבודה הכוללת של הפרוטוקול מודגם באיור 1.
1-ניתוח Bioinformatic של התורם ואת המטופל הלע רצפים
- לאחזר רצפים ממסד IMGT/הלע 15.
- הלע לקבל דוחות הקלדה של התורם איברים וגם הנמען שלו.
הערה: ודא הליכים ראוי להגן על סודיות הרישומים הרפואיים מנוצלים. בדרך כלל, נדרש אישור לוח סקירה מוסדיים (IRB) של פרוטוקול המחקר או את הבדיקה הניסיונית לכל המוסדיים הנחיות IRB. אם הלע דוחות מבוססי ה-PCR הקלדה (של רזולוציה גבוהה או נמוכה) או מבוססי רצפי הקלדה (SBT), עבור ישירות אל....
- הלע לקבל דוחות הקלדה של התורם איברים וגם הנמען שלו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר המקורי באמצעות המערך הקרנת שיטת17, אנחנו נרשם סכום כולל של 5 נושאים השתלת כליה. . השגנו את הלע הקלדת תוצאות של עמיתינו ושל תורמים המתאימים שלהם. נוגדנים allelic titers מבדיקות SAB וההיסטוריה הרפואית שלהם היו גם בפנינו. במחקר פיילוט שלנו מהחולים הללו 5, המצאנו שתי מתודולוגיות שונות: מערך רגיל המורכב פאנל קבוע של פפטידים ומערכים אישיים שהיו מותאמים אישית שנעשו עבור כל זוג התורם ואת המטופל. בעוד השיטה הראשונה איפשר לנו לאמת טכנית את הביצועים של פלטפורמת מערך בהש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
העיצוב של המערך במקום המתואר כאן הוא במחקר ניסיוני היחודיות alloantibody ב השתלת נגד אנטיגנים הלע של תורם איברים. בניגוד וזמינותו SAB הקיימים בשימוש נרחב במרפאה, שיטת מערך אנטיגן יש יתרון גדול בעיצוב גמיש שיכול להכיל את רצפי הלע האמיתי של התורם בודדים. הפלטפורמה החדשה מנצלת את הפוטנציאל של הטכנולוגיה רצפי DNA המתקדם במהירות כי בקרוב יוכלו להפיק קריאות רצף allelic הלע מדויק ללא עמימות16,27 ואת הפוטנציאל של מסדי נתונים ייעודי עבור מאגר הלע רצף15
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין התנגשויות אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים ד"ר שון Li, Li Xing של אוניברסיטת ווסטרן בקנדה לסיוע שלהם אדיב עם ספוט מערך הייצור. אנחנו אסירי תודה לחברי הצוות הליבה Histocompatibility ובבית את מקיף השתלת סנטר של אוניברסיטת נורת'ווסטרן למתן שירותים לדוגמה עבודה זו ייצורם נתמך בחלקה על ידי עזר הלוח של נורת'ווסטרן ממוריאל החולים, ועל ידי קרן הפעלה סגל המסופקים על ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן כדי ג'יי ג'יי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערך פפטידים | INTAVIS מכשירים | ||
| אתנול | סיגמא-אולדריץ' | E7023 | |
| Ponceau S תמיסת | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| חלב ללא שומן | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| עיזים אנטי אנושי IgG– HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc מערכת הדמיית ג'ל | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
מקורות
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
