הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56278

⸱

6 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, and the Center for Kidney Research and Therapeutics at the Feinberg Cardiovascular Research Institute, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Surgery-Organ Transplantation, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3School of Biological Sciences and Medical Engineering, Southeast University

במאמר זה

סיכום

אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.

תקציר

השתלת איברים, הפונקציה ואריכות ימיהם של השתל באורח קשה להסתמך על ההצלחה של שליטה דחייה אימונולוגי תגובתיות נגד אנטיגנים לויקוציטים אנושיים (הלע). הנחיות histocompatibility מבוססות על בדיקות מעבדה anti-הלע חסינות, המציג כמו קיימים גם או דה נובו שנוצר הלע נוגדנים המהווים מכשול השתלת הגדולות. בדיקות הנוכחי בנוי על פלטפורמה חרוזים יחיד-אנטיגן (SAB) באמצעות סט קבוע של אנטיגנים שנבחרו מראש ~ 100 הלע רקומביננטי כדי לחקור להשתלות סרה. עם זאת, אצל בני אדם קיימים מגוון גדול של סוגי הלע, עם אין שני אנשים שאינם תאומים זהים אשר יכולים לשתף אותו צירוף של רצפי הלע. ואילו טכנולוגיות מתקדמות הלע הקלדת ורצף ישירה בדיוק יכול ללכוד כל אי-התאמות ברצף ה-DNA בין תורם הלע של הנמען, וזמינותו SAB, בשל מגוון מוגבל בייצוג רצף, אין אפשרות לזהות במדויק alloantibodies ובמיוחד נגד התורם הלע התאמות. אנחנו ביקשו לפתח שיטה משלימים באמצעות טכנולוגיה שונים כדי לזהות ולאפיין התורם נגד נוגדנים הלע על בסיס אישי. הכלי ההקרנה הוא מערך פפטיד מותאם אישית של התורם נגזר הלע רצפי דורשים בדיקה שלאחר ההשתלה סרה של הנמען איברים כדי להעריך את הסיכון לדחייה בתיווך נוגדנים. על מערך יחיד עבור זוג התורם-נמען אחד, עד 600 פפטידים ייחודי מתקבלות של התורם הלע חלבון רצפים, כל פפטיד נושאת משקעים שאינם תואמים אחד לפחות ברצף חומצה אמינו 15. בניסויים הטייס שלנו כדי להשוות בין אנטיגן תבניות עבור קדם והשתלות שלאחר סרה על מערכים אלה, היינו מסוגלים לזהות אנטי-הלע אותות עם הרזולוציה המתאימה גם מאפשרת לנו לאתר את epitopes החיסון המעורבים. אלה אישית אנטיגן מערכים לאפשר זיהוי ברזולוציה גבוהה של epitopes הלע תורם ספציפי בהשתלת איברים.

מבוא

איברים טיפול זה מבוצע באופן שגרתי ברחבי העולם הציל חייהם של מיליוני אנשים. השתלת איברים מוצקים מתרחשת בחולים כ-100 לכל מיליון אנשים בארה ב מדי שנה, בעוד מספר גדול עדיין נמצאים על waitlists לקבל תורם איברים עקב מחסור חמור האספקה (על פי המידע הנמסר על ידי איבר המין השתלת רשת - OPTN/בוועדה ורכש: optn.transplant.hrsa.gov). איברים להשתלות הוא מאוד מווסתות על מנת לצמצם בזבוז איברים, להציל חיים, אבל בכלים מדעיים נהגו ליידע את התקנות האלה מוגבלים היעילות. למשל, הקהילה המדעית מזהה באופן מלא ארצות רב-צורתיות מאוד של מולקולות הלע, בדיקות גנטיות מדויק של ה-DNA באמצעות הקלדת ברזולוציה גבוהה המבוססת על רצף הקלדה (SBT) פותחו בשנים האחרונות1, 2. עם זאת, שיטות בדיקה alloantibody טרם מסוגל לייצר במגוון עצום של רצפים הלע נפרדים כמו אנטיגן הגששים. במבחן סטנדרטי כיום משתמשת לוח מחזוריים של אנטיגנים allelic ~ 100 זה המורכב מעובדים וריאציות נפוצות של הלע, A, B, C, DQ, DP וד ר רצף אוכלוסיות האדם3,4,5,6. לעתים קרובות, רצפים הלע של התורם בפועל אינם כלולים בלוח של הבדיקה, מכריח ההשתלות לרופאים ומנתחים להסיק תגובתיות תורם ספציפי המבוסס על קווי דמיון משותפים בין רצפים בפועל של התורם המתאים "תקני" מבחן להגדיר7,8. כתוצאה מכך, זה לפעמים מאתגר לבצע אומדן אמין של דחייה סיכון לפי נוגדנים בדיקת תוצאות9,10,11,12. לכן, חדש באופן אישי בדיקות הניתנות להתאמה אישית עבור alloantibodies הן בדחיפות13,14.

הגנים הלע לקודד histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) קולטנים יש פונקציה מפתח תגובות חיסוניות6. הלע גנים ידועים להיות הגנים רב-צורתיות ביותר של הגנום האנושי6. בשל התקדמות מהירה ב- DNA רצף אסטרטגיות על הגנים הלע, גרסאות חדשות allelic (או פשוט המכונה אללים) מתגלים בגיל קצב נפץ15,16. על ידי 2017/03, אללים המאומת 16,755 היה הופקדה למסד הנתונים של IMGT/הלע (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), של אילו 12,351 היו של הכיתה, 4,404 היו של class II קבוצות. בניגוד מוחלט, רק קצת יותר מ-100 אללים שונים מיוצגים וזמינותו אנטיגן יחיד רגיל חרוזים (SAB), אשר משמש באופן שגרתי כדי לזהות alloantibodies השתלת איברים. השיטה SAB בנוי על פלטפורמה Luminex באמצעות cytometry זרימה. מאז וזמינותו מנצל ערכה מחזוריים של אנטיגנים, מלבד קטין variabilities אצווה כדי אצווה בייצור, הבדיקה נסיוב החיסון יכול להיות robustly סטנדרטית על פני יחידים ועל -פני מעבדות5. עם זאת, במבחן זה אין אפשרות ללכוד כל alloantibodies שפותחה במיוחד כנגד אללים התורם, במיוחד כאשר רצפי התורם נעדרים מתוך SAB הגדר. ייצור מותאם אישית של אנטיגנים התורמים המבוססת על רצף נכון אמנם רצוי, נותרו אתגרים טכניים ייעול הייצור הדרושים ובדיקות הליכים.

אנחנו לאחרונה תיאר מתודולוגיה חלופי במחקר היתכנות של השתלת כליות נושאים17. השיטה להשתמש פפטיד אנטיגנים בתבנית המערך דורשים בדיקה מראש, שלאחר ההשתלה סרה של נושאים בודדים. כל המערך היה מותאם אישית נבנה באמצעות נקודה סינתזה שיטת18,19,20,21,22,23 שמייצר פפטיד אנטיגנים, כל 15 חומצות אמינו אורך, לחלוטין המבוסס על הלע אללים התורם איברים בהתאמה של A, B, C, DQA1, DQB1 ו DRB1. סינתזה ספוט מופעל על קרום תאית באמצעות Fmoc-כימיה תקן22 והוא יכול לייצר מאות פפטידים מותאם אישית במקביל מערכת רובוטית אוטומטית לחלוטין19,21. המערך קרום יכול לעמוד מספר סבבי בנוכחות אחר, reprobing מחזורי. מחקר רטרוספקטיבי שלנו17, הבחנו שינויים בדפוסי אנטיגן עם אנטיגן להשתלות מאוחסנות שנאספו בסדרה זמן (קרי, לפני ואחרי השתלת). במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול טכני עבור זרימת העבודה כולל מערך עיצוב, ייצור, חיטוט בנסיוב וניתוח התוצאות. השיטה מיועדת לגילוי alloantibodies נגד epitopes ליניארית ספציפי על הלע מולקולות השתלת התורמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן הלוח מוסדיים סקירה (פרוטוקול IRB #: STU00104680). זרימת עבודה הכוללת של הפרוטוקול מודגם באיור 1.

1-ניתוח Bioinformatic של התורם ואת המטופל הלע רצפים

  1. לאחזר רצפים ממסד IMGT/הלע 15.
    1. הלע לקבל דוחות הקלדה של התורם איברים וגם הנמען שלו.
      הערה: ודא הליכים ראוי להגן על סודיות הרישומים הרפואיים מנוצלים. בדרך כלל, נדרש אישור לוח סקירה מוסדיים (IRB) של פרוטוקול המחקר או את הבדיקה הניסיונית לכל המוסדיים הנחיות IRB. אם הלע דוחות מבוססי ה-PCR הקלדה (של רזולוציה גבוהה או נמוכה) או מבוססי רצפי הקלדה (SBT), עבור ישירות אל שלב 1.1.3. אם רצפים, התקבלו רצף גנומית/הלע, ואם הם להשלים, השתמש רצפי אלה ישירות. לעיתים, כאשר הושלמו רק בהקלדה או רצף תוצאות זמינים, בצע בצעד הנוסף 1.1.2. כדי להקצות " חסר " אללים באמצעות הכלי באינטרנט שמתואר בשלב 1.1.2.
    2. פתח השילובים אלל רב-משמעי בעקבות אינטרנט קישור - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html, וחפש באמצעות “ רב-משמעי בכלי החיפוש של שילובים אלל ” פונקציה כדי לאחזר את אללים היפותטי. לאחר מכן, המשך לשלב 1.1.3. כדי להזין את השם אלל.
    3. פתח את הטופס שאילתה אלל IMGT/הלע במקומות הבאים קישור האינטרנט - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html ונושא קלט ’ s אלל שמות (כל אחד בנפרד, כפי שמוצג באיור 2) לתוך “ חיפוש עבור ” התיבה. לחץ על “ חיפוש של אללים עכשיו ” לחצן. הלע אלל שמות צריך להשתמש במערכות למתן שמות סטנדרטי (כלומר A *, א * 01, A * 01:01:01:01, וכינוים כל הקודם כמו A * 01010101).
    4. למצוא את השם אלל תואמות המוצג על המסך. לחץ על לחצן אלל.
    5. להעתיק " חלבון רצף ", והדבק אותה לתוך מסמך טקסט מתחת לשורת הכותרת " > אלל שם ". ביעילות, הוא מסמך טקסט בתבנית FASTA (מהיר-כל) של השם אלל, רצף.
  2. לבצע מבוסס-גנים מרובים במערכים של אללים תורמים, נמען/החולה. ג'ין
    1. אחד (קרי, DQB1 * 03:01:01:01) בכל פעם, להעתיק ולהדביק כל ארבע אללים של תורמים, החולה FASTA הרצף (שני מהתורם) ושניים מן המטופל לתוך מסמך טקסט משולב. בנקודה זו, חשוב לציון באופן שונה התורם אלל בשמות משמות אלל החולה (אפשרויות כוללות שימוש דיפרנציאלי העליון לעומת מקרים התחתונה; או ליצור סיומת קידומת או סיומת הבחנה לכל שם אלל בנפרד לסמן התורם vs. החולה אללים). סדר קלט של הרצף אינה חשובה כי בעקבות יישור הצו גרר בהתאם לרמות של דמיון בין כל זוג של רצפים.
    2. העתק והדבק רצפי FASTA לעצב (כפי שנראה באיור 3) מלמעלה לתוך “ להזין את רצף הקלט ” תיבת באתר אומגה האשכול: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. לחץ על " להגיש את העבודה שלך " באמצעות ההגדרות הרגילות של פרמטרים: כגון " PROTEINŔ, " Clustal עם מספרי ". לבצע יישור על-ידי לחיצה על " שלח ". ישור של הרצף ארבע מוצג על המסך ( איור 4).
  3. לסמן תורם ספציפי אי-התאמות.
    הערה: במיוחד יצוין כי הרצפים allelic שניתנו כאן היו מבוססות על תוצאות הלע להקליד, לא רצף. לכן, אין סיכון רצף הרלוונטיים וריאציה בזוג התורם-נמען מסוים עשויים לפספס. אפשרות לפתור בעיה פוטנציאלית זו יותר, יותר מרכזי השתלות לאמץ הקלדת ברזולוציה גבוהה מדויקת ולכוון רצפי DNA.
    1. העתק, הדבק את הטקסט יישור לתוך מסמך טקסט, ליצור מסמך חדש. אם התבנית של הקובץ מיושר מופר, לתקן את התבנית על-ידי שינוי סגנון הגופן ואת גודל: תמיד להשתמש " Courier New " גופן בגודל קטן כדי להתאים את השורות. שמור את המסמך לאחר יפתרו את בעיות העיצוב.
    2. לבדוק ידנית את רצפי מיושר לזהות את כל שאריות לא תואמת באופן ייחודי שייך התורם. לסמן את כל שאריות אלו תורם ספציפי באמצעות צבע גופן הבחנה.
    3. למתוח קו תחתון תחת כל האותיות בקטע התורם ' s רצף זה להרחיב את שאריות 14 שניהם למעלה – ומחושבים במורד הזרם של אי התאמות מסומן תורם ספציפי (כמו 15 פפטיד חומצת אמינו מינוס 1 שאריות לחוסר ההתאמה).
  4. להפיק 15-מר פפטיד רצפי סדרות חופפים.
    הערה: הסיבה לבחירת 15-מר פפטידים היה מבוסס על הידע הכללי של טיפוסי epitopes להיות 4-9 חומצות אמינו אורך. לכן, כאשר אנחנו מוחלים " החלון נע " הליך עם גודל צעד של חומצות אמינו 4 ( איור 1), הבחירה שלנו באורך 15 חומצת אמינו נשארו 15-4 = 11 חומצת אמינו חפיפה בין כל פפטידים שכנות בסדרה. בתיאוריה, חפיפה 11 חומצת אמינו זו מספיקה לכסות כל מערכת החיסון epitopes של עד 9 חומצות אמינו אורך, כך epitope לא יהיה בטעות " לפצל " לשניים רק חלקי רצפים במערך.
    1. להשתמש רצפי בקו תחתון את תבניות להפיק ברצף קצר 15 רצפי חומצות אמינו בסדרה חופפים על ידי שאריות 4 בין כל שני סיקוונסים ומייד בסמוך בסדרה.
    2. העתק והדבק רצפי חומצות אמינו 15 אלה לתוך גיליון אלקטרוני ( איור 5) בתבנית עמודה מלווים בסימון עמודות הכוללות לשמות המקבילים של אללים התורם. עמודה נוספת כדי לכלול שאריות aa עמדות עשויה להיות שימושית.
  5. חזור על השלבים מ 1.1.3. כדי 1.3. עבור כל אלל הלע (קרי, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 ו DP) של התורם, הזוג הנמען להפיק את רצפי קצר aa 15 של התורם.
  6. העתקה והדבקה של כל העמודות לתוך גיליון אלקטרוני מאסטר כדי ליצור עמודה מתמשך זמן רב של כל הרצף aa 15 מתוך כל אללים התורם. תרשום את המספר הכולל של שורות (עבור הרצפים פפטיד) במסמך.

2. תכנון מותאם אישית מערך פריסת הייצור

  1. צור גיליון אלקטרוני של רצפי פפטיד עם אלל המתאימים אציליים. המערך כולל 20 שורות ועמודות 30 והוא יכול להכיל עד 20 x 30 = 600 מקומות פפטידים. בהתאם למספר הכולל של פפטידים טלקוה צעד 1.5 מתורם מסוים אחד, המבוסס על ניסיון העבר עם שתי דוגמאות זה ניסינו ליו ואח. 17, המערך ספוט 600 יכול להכיל את כל רצפי שנוצר מ ~ 2 ההשתלות נפרד מקרים.
    1. לתכנן בצורה הגיונית ביותר eדרך fficient כדי להתאים את ערכות של פפטידים בתוך הפורמט 600-ספוט של המערך.
    2. אם נושא אחד או יותר יכול להתאים לתוך מערך שלם אחד, להוסיף שורות ריקות לאחר התורם הראשון ' s רצפים כדי להתאים את המספר הכולל של שורות ניתן לחלק לפי 30 (מספר המקומות בשורה במערך).
    3. מייד לאחר השורה הריקה שעבר על הקבוצה הראשונה של רצפים, הדבק העמודה כולה רצף תוכן מהתיק ההשתלה השניה.
    4. חזור על שלבים אלה עד במערך מלא, אין עוד מקרים יכולים להתווסף מבלי לחרוג המקומות 600. אם שורות ריקות שלמות נותרו כדי למלא בתחתית, " להעביר " השורה הריקה למקם בין התורם שתי קבוצות. זה נותר בין המקרים שטח רחב גורם חיתוך של קרום לאחר סיום של הסינתזה יותר קל - בעקבות צעד 3.2. מתחת.
  2. לתכנת את פפטיד רצפים בהקשר של פריסת מערך. התוכנית של סינתיסייזר המקום לוקח תבנית טקסט של הרצף (שורה אחת אחת פפטיד רצף), אשר ניתן לקבל ישירות על-ידי שמירת הגיליון המתקבל משלב 2.1.4 כמסמך טקסט פשוט (ללא עמודות נוספות לשמות אלל, aa עמדות וכו).
    3. סינתזה
  3. בניהול מערך פפטיד אוטומטית באמצעות סינתיסייזר המקום. כל הפעולה של הסינתזה מפורט Kudithipudi et al. 21. שימו לב כי Fmoc סינתזה של שני מערכים לוקח ~ 4-5 ימים.

3. החללית ואת Reprobe אנטיגן מסידרה זמן של הפרט השתלת הנמען.

הערה: המערך 600-spot ממברנה יש את הממדים ~ 7 ס"מ x 13 ס"מ. לאחר הסינתזה, מערכי של ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר כמו ממברנות יבשות לפחות 2 שנים כאשר מפני אור ישיר. למנוע קיפול מוגזמת של קרום כדי לשמר את תוחלת החיים שלה לשימוש חוזר.

  1. נוזלים המערך קרום עם אתנול והמחש כתמים פפטיד צבעונית עם צבע מאכל פונסו ס מערך
    1. נוזלים הקרום נושאת את פפטידים בעקבות הליך stepwise אופטימיזציה ב- Li. et al. 24.
      1. לטבול את הקרום מערך ב- 20 מ ל 100% אתנול.
      2. הוסף 20 מ"ל מים כדי לדלל את הפתרון 50% אתנול, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות מזוקקים
      3. לשנות את הפתרון טבילה 40 מ ל 100% מים שלוש פעמים וגם דגירה 15 דקות בכל פעם.
      4. שטיפת במאגר ראוי לעבוד, למשל, 20 מ של TBST (טריס באגירה תמיסת מלח עם 0.1%), שלוש פעמים במשך 5 דקות.
    2. צבע מאכל פונסו S מכתים של המערך להמחיש peptides סינתטי
      1. להוסיף 20 מ של פתרון S צבע מאכל פונסו ניסח מראש ישירות המערך רטוב, תקופת דגירה של ~ 30 s ברעידות.
      2. בניהול מזוקקים מים באופן רציף על פני קרום מבטל את כתם צבע מאכל פונסו S צבע רקע. במהלך התהליך, פפטיד כתמים של צבע אדום עשוי להיות גלוי.
      3. להפריד בין חלקיו של המערך עבור כל תורם על ידי חיתוך בזהירות בין המקטעים של המערך במקרים בודדים. לסמן את הכיוון של כל מערך.
  2. מערך לחסום מראש.
    1. לחסום הקרום ב- 20 מ של 5% שומן חלב מומס מאגר TBST. פתרון זה מבוסס על חלב עוד יותר מבטל את צבע מאכל פונסו S צבע הכתם. להחליף את המאגר חלב מספר פעמים על מנת להשיג את התמונות פפטיד הברור ביותר.
    2. למטרות שמירת רשומות, לצלם תמונה של תמונת צבע מאכל פונסו S של המערך בעזרת מצלמה ידניים (למשל איור 6).
    3. ממשיכים חסימה של הקרום בחלב דל שומן 5% ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בטמפרטורת החדר במשך שעתיים עם נדנדה.
  3. Incubate מערך עם השתלת נסיוב.
    הערה: זה צריך להיות ציין כי תופעה הידועה prozone או האפקט הוק העלולות לנבוע הפרעות המשלים תלוית בניתוח נוגדנים בסרום. כדי לעקוף בעיה זו, צעד pretreatment סרום אופציונלי יכול להיחשב עם איון או EDTA או חום הדוגמאות סרום.
    1. להסיר חסימה מאגר ולשטוף את הקרום עם 20 מ של TBST שלוש פעמים ביום המחרת עבור 5 דקות בכל פעם.
    2. µL להוסיף 20 של הסרום גולמי של הנמען 20 מ ל 2.5% חלב במאגר TBST, דגירה עם הקרום במשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר. שימו לב כי בסבב הראשוני הזה של חיטוט, מומלץ כי סרום שלאחר ההשתלה שעברה (או סרום סביר ביותר sensitized) בסדרת הזמן משמש קודם כל. זה מבוסס על ההנחה כי דגימות קודמות בסדרה, בעיקר מן נקודות הזמן שלפני ההשתלה, יש פחות מגוון alloantibodies הנוטים לפתח עם הזמן. בדרך זו, כל אפשרות של הפרעה לאותות מן " carry-over " בין חיטוט סיבובים יכול להיות ההלניסטי alloantibody האמיתית המתפתחת תגובתיות עקב תגובות מערכת החיסון נגד השתל.
  4. דגירה עם נוגדנים משניים וקונטה המערך באמצעות 20 מ של TBST.
    1. לרחוץ את הקרום שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
    2. Incubate עם עז נגד IgG-HRP (חזרת peroxidase) נוגדנים משניים-דילול 1:10,000 במאגר TBST בתוספת חלב 1% עבור ה 2 אחר
  5. שטיפת ולפתח את האבן החשופה.
    1. לרחוץ את הקרום שלוש פעמים עם TBST 10 דקות בכל פעם.
    2. Chemiluminescence בצע משופרת (ECL) באמצעות 5 מ של פתרון הלומינול טריים מעורבבים עם 5 מ ל תמיסה לפתח הקרום (עבור 1 דקות).
    3. ECL להמחיש אותות באמצעות של imager מתאימים (קרי, מערכות הדמיה ChemiDoc או תכלת C600).
  6. סרוק ולכמת את האבן החשופה.
    1. להציל את התמונות המפותחות ( איור 7, תמונה נמוכה יותר) ולבצע כימות עוצמת ספוט.

4. משווים בנסיוב תגובתיות בין סדרה זמן קליני.

  1. להפשיט את המערך.
    1. בנקודה זו, לשמור על קרום רטובה כל הזמן.
    2. להתפשט הקרום על ידי המקננת עם 20 מ של מאגר הפשטת מסחרי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. ואז אני חוזר את החסימה (שלב 4.2) ואת השלבים (שלב 4.3) החקרנית באמצעות נסיוב שונה של המטופל נלקח בנקודת זמן שונות.
  2. בלוק הפשיטו ממברנה.
    הערה: בעקבות להתפשט, הקרום חוזר לסיבוב נוסף של חיטוט של נסיוב שונה מן המטופל אותו בסדרה זמן.
    1. לחסום את הקרום באמצעות מאגר חלב 5% כמו קודם (ראה שלב 3.2).
  3. Reprobe של נסיוב שונה מאותה הסדרה זמן (חזור על שלבים מ- 3.3-3.6; בדוגמה באיור 7, התמונה העליונה).
    הערה: המערך הפשיטו יכול לשמש לאחר מכן כדי reprobe היכנס סרום. מאז פפטידים נמצאים covalently מצומדת למטריקס התומכים של הקרום, הראינו כי המערך ניתן להשתמש בהם עבור עד 20 סיבובים של בנוכחות אחר, reprobing מחזורי מבלי לאבד את perfo שלהrmance.
  4. אחסון לטווח ארוך של מערכי.
    1. חנות הקרום במאגר TBS בתוספת 0.02% אזיד הנתרן w/w כמו משמר. להשתמש בשקית פלסטיק אטומה לאחסון לטווח ארוך. ב 4 ° C תחת הגנה מפני אור ישיר, קרום רטוב ניתן לאחסן במשך לפחות שנתיים.

5. חדרי קירור והקפאה וניתוח

  1. באופן ידני ביאור פפטידים אנטיגן חיוביות.
    1. לאתר נקודות מציג אותות נוגדנים חיובי ולקבוע את כל העמדות ברשת שלהם.
    2. לסמן על השורות המתאימות של גליון העבודה הראשי עבור פפטידים חיובי.
  2. לאחזר רצפים פפטיד ברשימה גליון העבודה הראשי ( איור 7, הרשימה התחתונה). על פי עקרון העיצוב המתוארים שלב 1.4.1., כתמים טורי שכנות לשתף חופפים באופן משמעותי רצפים (15-4 = 11), ולכן תגובתי epitopes עשוי להיות משותף על ידי פפטידים בסדרה רצופים.
    1. לסמן מספרים חיוביים המתרחשים ברצף.
  3. לקבוע אורך epitope מינימלי עבור כל פפטיד בסדרה.
    1. סימון כל רצפי epitope שעשויות להיות משותף המבוסס על חפיפת מקטעים של פפטידים תגובתי.
  4. מבנית דגם אנטיגן epitopes.
    1. להשיג אב טיפוס הלע קריסטל מבנים מן בנק מידע החלבונים נמצאו במקומות הבאים קישור האינטרנט: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. להציג את האבטיפוס הלע מבנה Pymol (הורד מ- www.pymol.org).
    3. מפה " או דגם גילה התורם אנטי epitopes למבנים תלת-ממדי של מולקולות הלע אב-טיפוס על-ידי הדגשת הרצף פפטיד תגובתי ( איור 8). לחץ על " תצוגה ", ואז " רקע ", ובחר " לבן ". כדי לשמור את התמונה, ללכת " קובץ " ואת " שמור תמונה בשם ", בחר את תבנית הקובץ " png ".
  5. לדווח על תוצאות והקצה epitopes תגובתית אללים התואם.
  6. השווה מערך תוצאות על פי התוצאות יחיד-אנטיגן חרוזים (SAB), אם הוא זמין.
    הערה: הבדיקה SAB באמצעות אנטיגנים allelic יחיד מודד נוגדן תגובתיות לקראת פאנל קבוע של חלבונים הלע. פפטידים בודדים המראים נוגדן תגובתיות שייכים מסוים אללים הלע זה, אם כללה גם בחלונית ' שבת ', מאפשרות השוואה ישירה בין המערך לבין התוצאות SAB. המחקר הקודם שלנו 17 הראו רמה גבוהה של מתאם בין התוצאות, רומז כי epitopes פפטיד באופן משמעותי לתרום תגובתיות הכללית של SAB. בנוסף, התוצאות מערך חושפים גם רמות חומצת אמינו היחודיות.
    1. קבל SAB תוצאות מהמעבדה הלע אשר מספק מידע המציין אם, אילו אללים התורם תגובתי שלאחר השתלה סרה של המטופל. תוצאות שלב 5.5. בהתבסס על המערך ניתוח גם לספק מידע בנוגע אללים התורם המתאים חיובי עבור תגובתיות alloantibody.
    2. ית SAB להשוות תוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר המקורי באמצעות המערך הקרנת שיטת17, אנחנו נרשם סכום כולל של 5 נושאים השתלת כליה. . השגנו את הלע הקלדת תוצאות של עמיתינו ושל תורמים המתאימים שלהם. נוגדנים allelic titers מבדיקות SAB וההיסטוריה הרפואית שלהם היו גם בפנינו. במחקר פיילוט שלנו מהחולים הללו 5, המצאנו שתי מתודולוגיות שונות: מערך רגיל המורכב פאנל קבוע של פפטידים ומערכים אישיים שהיו מותאמים אישית שנעשו עבור כל זוג התורם ואת המטופל. בעוד השיטה הראשונה איפשר לנו לאמת טכנית את הביצועים של פלטפורמת מערך בהש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

העיצוב של המערך במקום המתואר כאן הוא במחקר ניסיוני היחודיות alloantibody ב השתלת נגד אנטיגנים הלע של תורם איברים. בניגוד וזמינותו SAB הקיימים בשימוש נרחב במרפאה, שיטת מערך אנטיגן יש יתרון גדול בעיצוב גמיש שיכול להכיל את רצפי הלע האמיתי של התורם בודדים. הפלטפורמה החדשה מנצלת את הפוטנציאל של הטכנולוגיה רצפי DNA המתקדם במהירות כי בקרוב יוכלו להפיק קריאות רצף allelic הלע מדויק ללא עמימות16,27 ואת הפוטנציאל של מסדי נתונים ייעודי עבור מאגר הלע רצף15

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין התנגשויות אינטרסים הכריז.

תודות

אנו מודים ד"ר שון Li, Li Xing של אוניברסיטת ווסטרן בקנדה לסיוע שלהם אדיב עם ספוט מערך הייצור. אנחנו אסירי תודה לחברי הצוות הליבה Histocompatibility ובבית את מקיף השתלת סנטר של אוניברסיטת נורת'ווסטרן למתן שירותים לדוגמה עבודה זו ייצורם נתמך בחלקה על ידי עזר הלוח של נורת'ווסטרן ממוריאל החולים, ועל ידי קרן הפעלה סגל המסופקים על ידי אוניברסיטת נורת'ווסטרן כדי ג'יי ג'יי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערך פפטידיםINTAVIS מכשירים
אתנולסיגמא-אולדריץ'E7023
Ponceau S תמיסתSigma-AldrichP7170
חלב ללא שומןBio Rad Laboratories1706404
TBSTSanta Cruz Biotechnology10711454001
עיזים אנטי אנושי IgG– HRP ThermoFisher ScientificA18811
Clarity Western ECL SubstrateBio Rad Laboratories1705061
Restore Western Blot Stripping BufferThermo Scientifics21059
ChemiDoc מערכת הדמיית ג'לBio Rad Laboratories1708265 
ביואנליטיים

מקורות

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570(2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203(2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396(2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זיהוי נוגדנים אלו-HLAאפיתופים של HLA ספציפיים לתורםסינתזה של מערך פפטידיםניתוח אי-התאמה של HLAמיפוי אפיתופיםסטים של אנטיגנים בהתאמה אישיתבדיקת סרום לאחר השתלהHLA-DQA1 DQB1
אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.