מאמר שיטה

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

14.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56281

⸱

19 באוקטובר 2017

 ,  ,  , 
1The Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

תקציר

המאמצים שלנו כדי לקבוע דפוסי ביטוי ולוקליזציה subcellular של דרוזופילה RNAs על בסיס הגנום כולו, ו במגוון של רקמות, פיתחנו שינויים ושיפורים רבים כדי שלנו המקורי פלורסנט סיטו פרוטוקול הכלאה (דגים). כדי להקל על התפוקה ויחס עלות-תועלת, כל השלבים, מדור בדיקה לאיתור אות, מבוצעות באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter אקסון. Digoxygenin (מחדירים)-הגששים שכותרתה antisense RNA מיוצרים באמצעות שיבוטים cDNA או דנ א גנומי כתבניות. לאחר קיבוע הרקמה, permeabilization, הגששים הם hybridized כדי תעתיקים של הריבית, אז שזוהו באמצעות רצף של נוגדן אנטי החפירה מצומדת כדי ביוטין, streptavidin מצומדת כדי חזרת peroxidase (HRP) ו fluorescently מצומדת . tyramide, המייצרת בנוכחות HRP, בינוני מאוד תגובתי המאגד לאזורים צפופים אלקטרונים של חלבונים סמוכים מיידית. השלבים הגברה ולוקליזציה לייצר אות מקומי מאוד ועמיד המקל על שני לוקליזציה התעתיק סלולרית ו- subcellular. הפרוטוקולים סיפק מוטבו להפקת אותות ספציפי מאוד במגוון רחב של רקמות, שלבים התפתחותיים. הפניות ניתנים גם וריאציות נוספות המאפשרות זיהוי בו זמנית מספר תעתיקים, או תעתיקים, חלבונים, באותו זמן.

מבוא

שיטות זיהוי RNA של הגנום כולו חדשות כגון ה-RNA-seq הרחיבו מאוד את הידע שלנו של מתי ואיפה באים לידי ביטוי של גנים, ועל איזה רמות1. עם זאת, אלה מספקים טמפורלית הדלה יחסית ופתרון מרחבית. רנ א בהכלאה באתרו מאפשר את התפוצה המרחבית של תעתיקים חזותית שחלים ברקמות קבוע, ובכך לחשוף את הפרטים של לוקליזציה הסלולר, subcellular2. שימוש פלורסנט היברידיזציה (דגים) מאפשר רזולוציה מרחבית יותר שכן היא מאפשרת את השימוש בטכניקות מיקרוסקופ רב עוצמה, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי וגיליון אור3. סמני פלורסנט כגון דאפי יכול לשמש גם כדי ליצור קשרים subcellular4. דגים מקלה גם על התצפית של RNAs וחלבונים מרובים בו זמנית עם סימנים ברורים של חפיפה ברמת subcellular. ניתן למצוא ב-3,הפניות הבאות5ריאגנטים ייחודי השלבים הנדרשים עבור תיוג-כפול.

ההליכים המתוארים כאן לנצל microtiter 96-ובכן לוחות עבור כל השלבים, כולל ייצור תבנית cDNA (המושבה PCR), ייצור בדיקה RNA (באמצעות שעתוק תלויי-פולימראז הגשמים T7, T3 או SP6) באתרו בתוך הכלאה, ו פיתוח אות ניאון. מספר מספיק של העוברים או רקמות נוספות כל טוב של צלחת 96-ובכן כדי לאפשר הערכה של עקביות ולשינויים. כל אחד מקבל אז בדיקה שונים. לאחר פיתוח אות, העוברים או רקמות מכל קידוח נערכים בשקופיות בודדות מיקרוסקופ לבדיקה מיקרוסקופית.

השימוש tyramide אות הגברה (TSA) לצורך זיהוי המכשיר מייצר אותות חזקים עם רזולוציה יוצאת דופן subcellular 5,6,7,8. לוקליזציה subcellular של RNAs הוא מנגנון רגולטורי חשוב 9 שמופיע אצל כמעט כל RNAs 4,10,11. ניתוחים אלה הראו גם כי העותק רבים לא מזוהים על ידי RNA-seq מאותרים בקלות על ידי דגים 8. העיבוד של RNA בחיי עיר הכלאה ללוחות 96-ובכן מאפשר ניתוח של הגנים עד 96 של עניין בכל פעם (צלחות יותר אם נוספים משמשים), ביצוע ניתוח של אלגוריתמית אפשרי. על ידי חיתוך הלוחות למקטעים קטנים יותר, השיטה מותאם בקלות גם רק כמה דוגמאות. פרוטוקול סיפק מתאימה לניתוח של RNA התפלגויות של רוב סוגי רקמות. אמנם לא מוצג, זה וישימה הלא -דרוזופילה רקמות גם כן.

פרוטוקול

1-PCR הגברה של cDNA של פלסמידים תבניות

הערה: להשתמש פלסמיד באיכות גבוהה או DNA שנוצר על-ידי ה-PCR תבניות עבור ה-RNA בדיקה סינתזה. הספריות ג'ין אוסף (DGC) דרוזופילה שנוצר על ידי פרויקט הגנום ברקלי דרוזופילה מעניק כיסוי של רוב הגנים קידוד נמצאו הגנום דרוזופילה (ראה טבלה 1 א). אלה גם מאפשרים את השימוש תחל אוניברסלי עבור ההגברה של כל הוספה cDNA. Amplifications PCR אלה מבוצעות על פלסמיד DNAs נוכח lysates של פלסמיד המכיל חיידקי תרבויות. המוצרים DNA ואז משמשים כתבניות עבור שעתוק במבחנה כדי ליצור antisense RNA רגשים (ראה טבלה 1 ב).

  1. עיצוב תחל כדי להגביר את אזור ספציפי אקסון של גנים של עניין על-ידי ה-PCR (למשל. מ- DNA גנומי), רצוי עם האתר זיהוי פולימראז T7 בקצה antisense.
  2. לניסויים עם דוגמאות פחות מ 96, לחתוך חלקים שאינם נחוצים של 96-ובכן צלחות. לכסות את לוחות עם אטימה קלטת (ראה חומרים) עבור כל incubations ואחסון. אם צינורות microcentrifuge משמשים, התאמת אמצעי אחסון בהתאם.
    הערה: 96-ובכן צלחות לאפשר את השימוש פיפטות רב-ערוצי עבור תפוקה מוגברת, וכן אמצעי אחסון קטן יותר עבור החיסכון בעלויות.
טבלה 1 א

וקטור		 אנטיביוטי
עובד ריכוז 1:1000
תחל		RNA פולימראז
עבור
antisense		RNA פולימראז.
עבור
הגיוני
pFLC-אניכחpBst_SK (-) _F/RT3T7
pBSt(-)כחpBSt_SK(-)T7T3
pOT2ChlorpOT2_F/RSP6T7
pOTB7ChlorpOT2_F/RT7SP6
טבלה 1 ב
תחלרצף
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
_Forward pBst_SK (-) 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) תיחה פנימה 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

טבלה 1: A) כללי DGC שיבוט מידע עבור הגברה cDNA מוסיף פלסמידים. B) רצפים של צבעי יסוד אוניברסליים DGC פלסמידים.

  1. 250 לגדול µL של פלסמיד המכיל התרבות חיידקי ב 96-ובכן תרבות הצלחות על-ידי הוספת µL 240 LB המדיה לכל באר עם בחירה נכונה לאנטיביוטיקה (דילול 1:1000 מניה לאנטיביוטיקה 1000 X), 10 µL של המקור פלסמיד המכיל חיידקים (מתוך מלאי גליצרול). חותם עם דבק סלוטייפ לסתימה.
  2. Incubate ע י ניעור-215 סל ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (O/N).
    הערה: צור עותק חדש של גליצרול חיידקי cDNA פלסמיד שיבוט מניות כדי להחליף את המקור. לא להקפיא מחדש מלאי חיידקי המקורי, כמו זה יכול להרוג את החיידקים.
  3. לייצר התבניות PCR, לדלל 10 µL של התרבות חיידקי O/N 90 µL ddH בלוק 2 O בכל טוב של צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. Denature ה-DNA עבור 5 דקות ב 95 ° C ב- thermocycler. מיד במקום את הצלחת על קרח לפחות 5 דק
  4. תגובות PCR להכין באמצעות תחל אוניברסלי המתאים לפי טבלה 2-
< /tr >
ריאגנטיםהתגובה מדגם 50 μl96 לערבב היטב
(112 x התגובה)		הריכוז הסופי
X PCR 2 פולימראז מיקס25 μl2800 μl1 X
Primer_For (25 pmol/μl)0.5 μl5 6 μl0.25 pmol/μl
Primer_Rev (25 pmol/μl)56 μl0.5 μl0.25 pmol/μl
ddH2O22 μl2464 μl
48 μlהכולל5376 μl

בטבלה 2: מיקס מאסטר PCR.

  1. באמצעות פיפטה של, aliquot 48 µL של המיקס מאסטר PCR לתוך כל טוב של צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. להוסיף 2 µL של כל תבנית ה-DNA פלסמיד שפגע בסימני לכל טוב.
    הערה: שימוש בין picogram 1 (עמוד) כדי nanogram 1 (ng) של פלסמיד ה-DNA. תבנית ה-DNA מופרז מפחית את התשואה PCR וספציפיות.
  2. תוכנית המכונה PCR 96-ובכן לפי טבלה 3 ולבצע ההגברה.
    הערה: הזמן סיומת ב-72 מעלות נקבע באמצעות הגודל של המוצר PCR (45 s עבור ≤ 2.0 kb, 1.5 דקות עבור ≤ 3.0 kb, 3 דקות עבור ≤ 4.0 kb ו- 3.5 דקות עבור 4.0-5.0 kb). הטמפרטורה מחזק (Tm) נקבע לפי הרצף של צבעי יסוד. כאשר פריימר הוא שווה או יותר מ 20 nt, ה-Tm מחושבת:
    Tm (° C) = (4 X מספר CG) + (2 X מספר AT)-4.
< td בשורה span = "3" > מחזורים
שלבהטמפרטורהזמןCycle(s)
95 ° Cדנטורציה הראשונית3 דקות1 מחזור
הגברה
דנטורציה, חישול והסיומת		95 ° Cשניה 45
54-58 ° Cשניה 45
72 ° Cשניה 45-3.5 מין
72 ° Cסיומת הסופי7 דקות1 מחזור
אחסון4 ° Cלהחזיק

טבלה 3: תוכנית ה-PCR מומלץ.

    אצטט
  1. PCR משקעים מוצר עם אתנול (EtOH), נתרן (NaOAC) (ראה טבלה 4).
    הערה: אם אמצעי האחסון התגובה PCR µL פחות מ-50, למלא את µL 50 עם ddH 2 O.
    1. כדי לזרז את ה-DNA, לערבב הרכיבים מדגימות בטבלה 4 וחנות O/N ב-20 ° C, או למשך 30 דקות ב-80 °C.Centrifuge את הצלחת 96-ובכן למשך 45-60 דקות ב g x 2,250-סעפת-פיפטה 4 של ° ג שימוש ערוץ 8, ל- carefully להסיר את תגובת שיקוע. תשטוף פעם אחת עם 160 µL קר 70% EtOH (חינם RNase) במשך 30 דקות ב- 2,250 g x-4 מעלות צלזיוס
      הערה: ניתן לראות את ה-DNA precipitated בחלק התחתון של וולס. מוצרי ה-PCR קצר יותר דורשים יותר centrifugations.
    2. בעדינות היפוך על הלוחית 96-ובכן מגבת נייר כדי להסיר את הטיפות האחרונות של נוזל מכל קידוח (ככל האפשר). האוויר יבש DNA גלולה עבור h 1 בטמפרטורת החדר (RT). Resuspend ה-DNA precipitated מים חינם RNase µL 25-
      הערה: 1 h האוויר יבש יאפשר כל עקבות של EtOH מתמוססות. עם זאת, נפח קטן מאוד של נוזלים (בערך µL) צריכים להישאר כל היטב כדי למנוע ייבוש לחלוטין בגדר ה-DNA. השתמש 25 µL לתגובה PCR 50 µL. אין להשתמש מים DEPC מטופלים בשלב זה כדי למנוע הפרעה במבחנה שעתוק בשלבים הבאים-
רכיבאחסוןבחלק
ה-PCR50 μl
100% אתנול125 μlכרך X 2.5 של ה-PCR
NaOAc ז 3 (ה-pH = 5.2, RNase חינם)5 μl% 10 כרך של ה-PCR
סה כ180 μl

בטבלה 4: דוגמה לתגובה PCR 50 µL-

  1. לבדוק את הגודל ואת התשואה של מוצרי ה-PCR על-ידי הפעלת 5 µL של הפתרון דנ א resuspended-ג'ל agarose 1% 1 X טה מאגר.
    הערה: סך של 250-500 ננוגרם של תבנית ה-DNA נדרש עבור התגובה 15 µL במבחנה שעתוק. דגימות עם תשואות גבוהות יכול להיות מדולל יותר. התשואה RNA תלויה גם רצף ואורך תבנית ה-DNA. לפי המדריך הכללי של החפירה-RNA תיוג עם T7 RNA פולימראז, מופק µg כ 10 של התווית על-ידי החפירה RNA מתבנית ליניארית µg 1-

2. במבחנה שעתוק כדי להפיק הגששים antisense.

הערה: חשוב מאוד לעבוד בסביבה נטולת RNase. כל ריאגנטים המעבדה-ware חייבים להיות RNase (כמו מוסמך DNase/RNase חינם וואר פלסטיק)-

-- --- -
רכיבהמניות ריכוזאמצעי האחסון ריכוז סופי
ATP100 מ מ7 μl10 מ מ
CTP100 מ מ7 μl10 מ מ
GTP100 מ מ7 & # 956; l10 מ מ
שזור100 מ מ4.5 μlמ מ 6.5
החפירה-11-זוג שזור10 מ מ25 μl3.5 מ מ
מים חינם RNase< /td > 19.5 μl
סה כ70 μl

טבלה 5: הכנת תערובת החפירה-NTP.

< טבלה גבול = "1" fo:keep-together.within-דף = "1" fo:keep-עם-next.within-דף = "תמיד" > רכיב 15 μl תגובה 96 לערבב היטב
(112 x התגובה) סופי conc. מאגר שעתוק של 5 X 3.00 μl 3.00 μl 1 x החפירה-NTP לערבב (10 מ מ) 0.75 μl 0.75 μl 0.5 מ מ RNase מעכב 0.25 μl 0.25 μl 0.67 U / μl RNA פולימראז (T7 או T3 או SP6) 2.00 μl 2.00 μl 2.67 U / μl 1.50 μl RNase מים חינם 1.50 μl 7.50 μl הכולל 7.50 μl

שעתוק טבלה 6:2 X מיקס מאסטר.

  1. להכין החפירה-NTP לערבב לפי טבלה 5-
    הערה: כדי למנוע טעויות, תמיד ליישר את הצלחת כך A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה של הצלחת-
  2. הוסף רכיבים תיאר ב טבלה 6 מכל קידוח לתוך צלחת PCR 96-ובכן חדש (צלחת לווין). להוסיף אחד המתאים. ובכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצי של 7.5 µL של מוצר ה-PCR (תבנית ה-DNA). כיסוי לצלחת עם דבק סלוטייפ לסתימה.
    הערה: הכמות האופטימלית של מוצר ה-PCR הוסיף לכל שעתוק התגובה צריכה להיות בטווח של 0.5 עד 1 µg. אם להקות על הג'ל באופן משמעותי חלש או חזק יותר, ניתן לכוונן את עוצמת הקול של הדנ א להוסיף את התגובה בהתאם. הסכום המדויק אינה קריטית.
  3. דגירה לצלחת לווין ב 37 ° C עבור µL 3.5-4 ח' 15 שילוב של בדיקה מסונתז עם 35 µL של DEPC התייחסו ddH 2 O, 125 µL של 100% EtOH, ו µL 5 של 3 מ' NaOAC (ה-pH = 5.2, RNase חינם). לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות צנטריפוגה ולשטוף כפי שתואר בשלבים 1.10.2 ו 1.10.3.
  4. Resuspend המכשיר precipitated 25 µL של DEPC שטופלו ddH 2 O. לרוץ 5 µL על 1% agarose ג'ל (משך < 20 דקות) כדי לבדוק את תקינות ואת התשואה של המכשיר ( איור 2).
    הערה: הג'ל agarose חייב להיעשות עם DEPC התייחסו ddH 2 O ו טה מאגר. ג'ל אלקטרופורזה המנגנון להקצותם עבור ה-RNA עובדים בלבד. עוד ג'ל ריצה זמן במהירות נמוכה יכול להוביל השפלה RNA במהלך אלקטרופורזה.
  5. לערבב את µL 20 הנותרים של המכשיר מסונתז עם 100 µL הכלאה פתרון (טבלה 7) וחנות ב-80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    הערה: ריכוז בדיקה יכולה להיות מדולל יותר אם הם חזקים במיוחד (ראה איור 2 לקבלת דוגמאות). הכלאה פתרון יעיל מאוד למניעת זיהום RNase. מיד להוסיף פתרון הכלאה החללית resuspended כדי למנוע השפלה RNA. הכלאה הפתרון חייב להיות מסונן דרך מסנן 0.2 µm. עבור דגימות רקמה, להעלות את ריכוז דטרגנט בפתרון הכלאה על-ידי הוספת טריטון-X-100 ריכוז סופי של 0.3%-
רכיבאחסוןהריכוז הסופי
DEPC טיפול ddH2O11.85 ml23.7%
האס X 20מ"ל25% (5 X)
Formamideמ 25 ל50%
הפרין (50 מ"ג/מ"ל)0.1 מ"ל0. 2% (0.1 mg/ml)
זרע סלמון DNA נטושים בודדת0.5 ml1.0%
Tween-20מ"ל 0.05%0.1%
50.00 mlסה כ100%
< p class = "jove_content"fo:keep-together.within-דף ="1"> טבלה 7: פתרון הכלאה.

3. אוסף רקמת גידול של העובר, זחל, מבוגר דרוזופילה.

הערה: בקנה מידה קטן (בקבוקים) והן מסה (תיבות) לטוס לגידול, להשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים מעבדה לעוף על מזון קמח תירס מבוסס על 25 מעלות צלזיוס לשמור מתאים למבוגרים, זחל צפיפות, מספקים אבקת שמרים פעילים נוספים על מזון משטחים.

  1. לאסוף העוברים בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. הצעדים העיקריים של העובר אוסף מומחשים איור 3-
    הערה: לאחר שטיפה devitillinized עוברי, מתנול, העוברים קבוע ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שנה אחת. העובר permeabilization, קיבוע שאחרי המבוצעות היום 1 של פרוטוקול דגים.
  2. הכן טרי 40% PFA מניות פתרון.
    1. הכן טרי פתרון מניות של 40% paraformaldehyde (PFA) על ידי ערבוב 10 מ"ל של DEPC התייחסו ddH 2 O ל- 3.68 g של כדורגלן, µL 70 של 2N KOH בבקבוקון זכוכית 20 מ"ל נצנוץ המכיל אנחנו חיים מערבבים קטן
      התראה: PFA רעיל מאוד עם פוטנציאל השפעות בריאותיות כרוניות וחמורות. לקרוא MSDS (חומר בטיחות גליונות נתונים) ולהשתמש עם הגנה ראויה על העיניים, העור, מערכת הנשימה-
    2. בשכונה fume, מחממים ומערבבים את המבחנה למשך 3-5 דקות על צלחת חימום ב 200 ° C עד התפרקה לחלוטין מחברים. להסיר הפתרון מניות PFA מהאש ברגע מחברים מפורקת (לא לחמם יותר מדי).
    3. מגניב את הפתרון מניות של כדורגלן 40% מומס על קרח למשך 5 דקות, ולסנן עם מזרק מסנן ו 10 מ ל 0.2 µm.
  3. Instar השלישי הזחלים (L3) או קיבוע הרקמה למבוגרים, מרווה, permeabilization
    הערה: פרוטוקול זה אמור להסתיים ביום אחד. הוא כולל רקמות לנתיחה, קיבוע, להרוות HRP אנדוגני, permeabilization, קיבוע שאחרי. פתרונות תיקון
    1. הכן (תיקון-I ו- II-תיקון) לפי טבלה 8.
      הערה: חומצה Picric משמש לשבועיים נוספים כאשר רקמות יש מבנה עדין שחייבים להשמר. זה לא מקבע טוב כאשר רקמת ultrastructure חייב להישמר עבור מיקרוסקופ אלקטרונים (EM).
      אזהרה: חומצה Picric לא יציב ויש לו את היכולת להגיב עם חומרים אחרים וליצור תרכובות חומר נפץ. השתמש ואחסן לפי הנחיות בטיחות.
    2. המקום הזחלים או הזבוב הבוגר של צינור פלסטיק 50 מל המכילה 10 מ"ל של קר 1 X PBS ו 100 µL של תיקון-אני הפתרון. הרגעה על קרח למשך 2 דקות להפחית את תנועתיות לטוס זחל או למבוגרים-
    3. לחתוך את הקצה של טיפ 1 מ"ל פלסטיק כדי ליצור פתח 2-3 מ מ. להעביר 10-30 הזחלים או מבוגר טס עם קצה 1 מ"ל לתוך צלחת פטרי (קוטר 9 ס מ) עם שכבה שטחית של 1 X PBS מהצינור 50 מ ל (שלב 3.3.2). הוספת קצת PBTT יכול להפחית מתח. בזהירות לנתח זחל (פתח קדמי וסוחטים רקמות מן האחוריים כדי קדמית) או רקמות בוגרות עניין עם זוג מלקחיים חדה תחת טווח ויבתר.
      הערה: בערך 200-300 הזחלים או האשכים למבוגרים יכולים להיות גזור ותוקנו ביום אחד על ידי אנשים מנוסים.
    4. העברת גזור רקמות עם פיפטה 200 µL (עם קצה מנותקים כדי ליצור בקוטר 2 מ מ פתיחה) לתוך צינור 1.5 mL החנות על קרח. להשלים את כל הסיבוב של ביתור בתוך 10-15 דקות לפני מתקדם לשלב הבא.
      הערה: המשך עם סיבובים נוספים (בתוך חלון הזמן 2 h) כפי הנדרש להפקת חומר מספיק.
    5. תיקון רקמות עם 800 µL של תיקון-אני פתרון במשך 30 דקות על הספסל מערבל העליון. רקמות שטיפה פעם עם 800 µL 1 X PBTT ולשמור צינורות בקרח לתקופה מקסימלית של 2.5 ח' עקב 30 דקות להגביל, צריך להתבצע batch-wise עד רקמה מספקת נאסף.
    6. מאגר לכל רקמות ביתור וקבוע לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל יחיד המכיל רשת במכסה (ראה איור 4 לעיצוב tube). האחות עודף נוזל מבעד לרשת במכסה שפופרת. רחץ 3 X 5 דקות כל אחד עם 10 מ"ל של 1 X PBTT. לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS 1 X כדי להסיר דטרגנט. הדבר מונע בועות העודפים בשלב הבא.
      הערה: אם רקמות ביתור לשקוע לתחתית הצינור, השלבים ניתן לבצע גם צלחות microtiter רגיל או 0.5-1.5 mL microcentrifuge צינורות (300-800 µL נפח למחזור).
    7. להרוות אנדוגני HRP פעילות עם 5 מ של 0.3% H 2 O 2 ב- PBS למשך 15 דקות ב- RT. אני חוזר עוד פעם. להשאיר את המכסה פתוח במהלך שלב זה ללא ערבוב. יש לשטוף פעמיים באמצעות 10 מ"ל של 1 X PBTT. תשטוף פעמיים במשך חמש דקות עם 10 מ של 1 X PBTT.
    8. Permeabilize רקמות עם 10 מ"ל של 80% אצטון (-20 ° C, טרום מקורר) ב-20 ° C עבור 10 דק ' היפוך ' הצינור פעמיים במהלך תקופת הדגירה. תשטוף פעמיים במשך 10 דקות עם 10 מ"ל של PBTT X 1 כדי להחזיר נוזלים ברקמות.
      9. פתרון
    9. שטיפה עם 10 מ"ל תערובת של הכלאה PBTT פלוס 5 מ ל מ ל (1:1). למחוק את תמהיל ולהחליף עם פתרון הכלאה 10 מ"ל. דוגמאות ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שהוא נדרש. לקבלת תוצאות מיטביות, אל תאחסן דגימות יותר משבוע.
רכיבלתקן לי (10 מ"ל)לתקן את השני (10 מ"ל)
מניות PFA 40%1 מ"ל1 מ"ל
PBTTמ"ל 8.999 מ ל
חומצה Picric פתרון10 μl–
< p class ="jove_conte nt"fo:keep-together.within-דף ="1"> טבלה 8: פתרונות לתיקון רקמות.

4. הכלאה בחיי עיר

הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש מינימום של 2 ימים, עם הכנת הדוגמא, הכלאה קדם הכלאה לוקח מקום על זיהוי 1, בדיקה היום על יום 2. אם מספר דוגמאות הוא גבוה יחסית, אם לא מוכר עם הפרוטוקול, או יום שלם אינה אפשרית, הפרוטוקול צריכה להתבצע תוך שלושה ימים עם השלבים של בדיקה וזיהוי אותות הגברה מחולק ל 2 ימים. מספרים גדולים של העוברים או דגימות רקמה ביתור עשויים גם לדרוש ימים נוספים כדי לעבד. עבור דגימות רקמה גזור, להחליף 1 X PBT 1 X PBTT של כל השלבים, אלא אם צוין אחרת. ? הנוזל נוסף נדרש עבור חדירה של רקמות זחל ומבוגרים רבים, כגון המוח ואת testis. אף 1 לא נבדק, ניתן להשתמש X PBTT גם עבור עוברי. השתמש 100 µL לכל טוב צלחות 96-ובכן, µL 800 עבור צינורות 1.5 mL-

  1. הכלאה קדם, הכלאה
    הערה: השלבים 4.1.1-4.1.6.2 הן עבור העובר בחיי עיר הכלאה. עבור רקמות זחל או למבוגרים בחיי עיר hybridizations, דלג על שלבים אלה.
    1. להסיר 2 מ"ל של העוברים קבוע (המאוחסן מתנול ב-20 ° C) אל צינור 15 מ"ל. רחץ עוברי פעמיים במשך 7 דקות עם 10 מ"ל של מתנול לשטוף כל. ווהsh העוברים על 7 דקות עם 10 מ"ל תערובת של מתנול X 1 PBTT (1:1). לשטוף את עוברי פעמיים במשך 7 דקות עם 10 מ"ל של PBTT X 1 כדי להחזיר נוזלים.
    2. עבור העובר permeabilization, להכין פתרון ביניים proteinase K (40 µL/mL) על ידי דילול שבערך מהפתרון מניות (20 מ"ג/מ"ל). חנות ב-20 ° C. הופכים את הפתרון proteinase K עובד על ידי דילול הפתרון ביניים proteinase K-1/15 ב PBTT X 1 עבור ריכוז העבודה הסופית של ug 2.667/mL.
    3. Permeabilize עוברי עם 10 מ"ל של עובד פתרון proteinase K (שימוש פחות עבור מספר קטן יחסית של העוברים). דגירה הצינור ב RT עבור 13 מינימלית בעדינות היפוך הצינור 4 פעמים במהלך הדגירה. דגירה הדגימות בפתרון proteinase K על קרח לשעה ללא ערבוב.
      הערה: זו דגירה ארוך יחסית עם שתדללו proteinase K מבטיחה permeabilization reproducibly אחיד ולא מכתים עוקבות.
    4. בעוד עוברי permeabilize, להפוך 2 מ"ג/מ"ל גליצין פתרון מ X 10 מניות (20 מ"ג/מ"ל) ב 1 PBTT X עבור הנפח הכולל של 30 מ ל-
      5. פתרון
    5. הסר proteinase K, לשטוף עם 10 מ"ל של גליצין פתרון (2 מ"ג/מ"ל) ולשטוף פעמיים למשך 2 דקות כל אחד. לשטוף שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBTT 1 X כדי להסיר את גליצין.
    6. קיבוע שאחרי של העוברים.
      1. להכין 10 מ"ל של 4% מחברים (1 מ"ל של 40% מחברים ב 9 מ של PBTT, מסונן דרך מסנן מיקרומטר 0.45).
      2. דגירה בדגימות ב 4% מחברים עבור מינימלית 20 X 3 שטיפת למשך 2 דקות עם PBTT.
      3. להכין פתרון שפגע בסימני הכלאה, מרתיחים את הפתרון הכלאה במשך 5 דקות. לשימוש צלחת מלאה 96-ובכן, שלושה צינורות של 12 מ. מגניב על הקרח מיד עבור 5 דק
      4. שטיפה עוברי פעם אחת עם 10 מ"ל של 1 X PBTT: הכלאה פתרון (1:1). לשטוף פעמיים עם 5 מ של הכלאה פתרון. Aliquot µL ~ 20 לכל טוב של התיישבו עוברי (30-40 עוברי) או קבוע רקמות לתוך צלחת PCR 96-ובכן על קרח. הסרת פתרון הכלאה רקמות או עוברי באמצעות פיפטה סעפת של ערוץ 8 ( איור 1 / וידאו).
        הערה: יש פיפטה סעפת ‘ להפסיק ’ שמונע את הטיפים מ שוקעים הבארות והסרה של הדגימה. לניסויים באמצעות רקמות שצפים, להסיר את נוזלי בזהירות עם פיפטה 100 µL מלמעלה.
    7. µL להוסיף 100 של הכלאה שפגע בסימני לפתרון כל טוב. מראש hybridize עוברי למשך תקופה מינימלית של 2.5-3 h ב 56 ° C באמצעות יחידת חימום לאמבטיה יבשה המכיל חרוזי מתכת (ראה חומרים, איור 1).
      8. . בדיקת
    8. denature 100 µL של התוכנית בצלחת PCR 96-ובכן באמצעות thermocycler עבור 5 דקות-80 ° C. מיד מגניב על קרח למשך 5 דקות הסרת פתרון הכלאה קדם עוברי או רקמות. להוסיף שפגע בסימני הגששים גנים ספציפיים לכל אחד לטעום, לכסות עם דבק סלוטייפ לסתימה, hybridize ב 56 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h O/N, תחת חרוזי מתכת באמבט יבש חימום ההוראה

5. בדיקה לזיהוי

  1. לחמם את הפתרונות טבלה 9 ביחידת חימום 56 ° C. להסיר את הגששים מהצלחת.
    הערה: רגשים יכול לעשות שימוש חוזר בין 2 - 3 פעמים אם מאוחסנים ב- 80 ° C (לא החנות RNA כל דגימות ב-20 ° C). לאחר הכלאה, הרנ א נטושים זוגי יציב יותר סטרנד יחיד RNA, ויש פחות רגישים השפלה הנגרמת על ידי זיהום RNase.
    אם משתמש מערכת סינון ואקום צלחת רב טוב בשביל לרקמות, יש לכלול צלחת אוסף כתשר מסנן כדי לאסוף את הגששים (ראה וידאו עבור מכלול הפרטים). רקמות hybridized יהיה צורך ניתן להעביר את הצלחת microtiter 96-ובכן קבוע המשמש הכלאה אחת עם 1.2 מיקרומטר נקבובית גודל PVDF ממברנות על החלק התחתון של כל טוב.
< t r >
שלבטרום חימם פתרון (56 ° C)זמן נפח לכל טוב
הכלאה פתרון: PBTT (3:1)115 דקות100 μl
2הכלאה פתרון: PBTT (3:1)15 דקות100 μl
הכלאה פתרון: PBTT (1:1)315 דקות100 μl
4הכלאה פתרון: PBTT (1:3)15 דקות100 μl
5שוטף PBTT 35 דקות100 μl

טבלה 9: שטיפת הגששים לאחר הכלאה.

  1. , אם באמצעות לוחות נורמלי, שטיפת דוגמאות לפי טבלה 9 ביחידת חימום-56 ° C. אם באמצעות מערכת סעפת ואקום, להשתמש בפתרונות מחוממת עם מערכת ואקום על הספסל ולהסיר את הפתרונות מיד מהנשיאות מתחת על-ידי vaccuum. לאחר לשטוף את השלישי עם 1 X PBTT, ניתן להסיר את הצלחת נורמלי מן החימום ההוראה
  2. הכנת נוגדנים.
    1. 11 להכין מ"ל של נוגדן ראשוני פתרון (2.5 µg/mL) במלאי (1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול נוגדן אנטי החפירה monoclonal העכבר מצומדת ביוטין (ראה רשימת חומרים) ב- PBTTB (1:400). אם עיבוד הדגימות פחות, התאמת אמצעי אחסון בהתאם.
    2. 11 להכין מ"ל של streptavidin-HRP פתרון (1 µg/mL) במלאי (1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול 1:1000 streptavidin-HRP נזווג (ראה רשימת חומרים) ב- PBTTB. אם באמצעות דגימות פחות, התאמת אמצעי אחסון בהתאם.
  3. לחסום עוברי או רקמות עם PBTTB (חלב רזה 1% 1 X PBTT) במשך 20 דקות על הספסל העליון מיקסר-RT.
    הערה: מסנן PBTTB באמצעות נייר סינון (כיתה 3, 6 מיקרומטר) לפני השימוש בו על צלחות 96-ובכן מסנן כדי למנוע סתימת מסנני ' '. במקום PBTB, PBTTB (PBTB עם נוספים 0.3% טריטון-X-100) משמש לרקמות כל במהלך הפרוטוקול.
  4. Incubate עוברי או רקמות בפתרון נוגדנים (100 µL טוב) כבר שעתיים על הספסל-העליון מדגם מיקסר. לשטוף פעמיים עם 1 x PBTTB. לשטוף 3 X עבור 5 דקות ו- 5 X 10 דקות עם PBTTB. דגירה עוברי או רקמות עם streptavidin-HRP פתרון (100 µL טוב) h 1.5 באמצעות מערבל מדגם ספסל-העליון. לשטוף 2 X עבור 5 דקות עם PBTTB. לשמור דגימות בחושך מנקודה זו על.
    הערה: במהלך כל נוגדן שוטף, אם הרקמה הוא אובדן עקב אטימות המיוצר על ידי החלב, נסה כביסה בלי החלב (PBTT במקום PBTTB).
  5. להכין פתרון דאפי-100 המדללת X DAPI ב PBTTB (1: 100).
  6. Incubate עוברי או רקמות עם פתרון דאפי (100 µL טוב) למשך 15 דקות על מערבל מדגם ספסל-העליון. לשטוף 4 X 10 דקות עם PBTT. לאחסן את הצלחת 96-ובכן עם דגימות O/N ב 4 ° C או להמשיך לשלב הבא.
    הערה: ההליך אפשר לעצור כאן.

6. זיהוי נוגדנים באמצעות tyramide (ראה איור 5)

הערה: כאן תוצרת בית cyanine מצומדת 3 tyramide שימש, אשר הוכן לפי הפרוטוקול המתואר 12 . אם ביצוע ניסויים רבים או בדיקות דגימות רבות, פעולה זו שומרת את כמות משמעותית של כסף יעיל לעומת ריאגנטים מסחרי (מניסיון). עבור פחות ניסויים ודוגמאות, ניתן להשתמש cyanine זמינים מסחרית 3-tyramide (ראה חומרים).

  1. לדוגמה שטיפת צלחות 3 X עבור 5 דקות עם 1 X PBTT.
  2. הכנת tyramide הפעלת מאגר (הפעלת מאגר) המכיל 0.006% 2 O H 2 ב- PBTT (שתדללו 30% (w/w) H 2 O 2 מניות 1:5000).
    3. < lאני > לשטוף הצלחות עם מאגר הפעלה.
  3. הכנת cyanine 3-tyramide פתרון על ידי דילול זה הפעלת מאגר בשפופרת 15 מ"ל.
    1. לשימוש העוברים, דילול 1:80 (137 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). בשביל לרקמות זחל, להשתמש 1:150 דילול (73 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). לשימוש למבוגרים האשכים, דילול 1:200 (55 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). לשימוש למבוגרים שחלות, 1:300 דילול (36 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר).
  4. דגירה דגימות עם cyanine 3-tyramide פתרון 2 h על הספסל-העליון מדגם מיקסר. לשטוף ארבע פעמים עם PBTT. לשטוף 6 X 10 דקות עם PBTT. לשטוף X 3 עבור 5 דקות עם PBS להסיר את הנוזל.
  5. µL להוסיף 150/טוב של אנטי-עמעום הרכבה מדיה. לשמור דגימות O/N ב 4 ° C כדי לאפשר לרקמות או עוברי לשקוע לתחתית הצינור. הר דוגמאות על שקופיות מיקרוסקופ (תחת לנתח טווח לרקמות) ולכסות עם coverslip. לאטום את הקצוות של coverslip עם לק שקוף.
  6. התמונה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
    הערה: לנתח שליטה שלילי קודם כדי לקבל מושג על ‘ שאינם ספציפיים ’ רקע.

תוצאות

איור 6 מציג דוגמאות של התוצאות המתקבלות באמצעות הליך זה. הלוחות 3 העליון להראות דוגמאות של עוברי דרוזופילה מוקדם (איור 6, לוחות A-C), 3 הבא מראות דוגמאות של המנוח עוברי דרוזופילה עם אותות ברקמות שונות (amnioserosa, השרירים, מערכת העצבים המרכזית, בהתאמה (איור 6, לוחות D-F). הבא דוגמאות מ-3 לחלל זחל רקמות (איור 6, לוחות G-J). K ו- L מראות להחליפן בתמונות של בלוטות המין למבוגרים (השחלה ואת testis, בהתאמה). יש מאות תמונות שהועלו, מבואר ב שלנו ניתן לחיפוש 'פלורסנט בחיי עיר זבוב הפירות מסד' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

figure-results-1
איור 1. קווי המתאר של פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) פרוטוקול ומפתח מכשור. (א) PCR הגברה של cDNA. (B) במבחנה שעתוק כדי ליצור גנים ספציפיים antisense החפירה - תוויות RNA הגששים בצלחת 96-ובכן (צילום של צלחת שמוצג b). (ג) ו- (D): מבוגרים (נקבה: יחס זכר 2:1. 300-400 זבובים/בקבוק) זבובים מותר להזדווג במשך 3-4 ימים. העוברים של אוסף לילה על תקן קמח תירס מזון 25 ° c מועברים קופסת פלסטיק מאוורר היטב (1 ליטר של קמח תירס מזון במיכל בגודל: 8 "X 8" 3" LWH) או בקבוקים חדשים, שמירה על צפיפות זחל נאותה. אוסף רקמה, אבקת שמרים פעילים צריך להיות התיז על האוכל-24, 48 שעות לאחר הנחת (AEL) ביצה. (E עד H): פלורסנט בחיי עיר הכלאה ניסויים שבוצעו על פני 3 ימים רצופים. עבור עוברי או רקמות שצפים לא, השתמש צלחת PCR 96-ובכן כפי שמוצג ב' תצלום עם העצמות ערוץ 8 (תצלום c). בשביל לרקמות שצפים, כמו רוב רקמות זחל, להשתמש צלחת עם תחתית מסנן (צילום ברה) והסר נוזל מלמטה עם העצמות סעפת באמצעות לחץ נמוך (צילום ב- e). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
באיור 2. קביעת התשואה בדיקה RNA. לאחרונה מסונתז הגששים antisense RNA מובחנים ג'ל agarose 1% (5 µL lane). התשואה יכולים להיות מסווגים (מבוסס על האינטנסיביות של הלהקה) 'תשואה נמוכה' הנמצאים בסמטאות 3 ו-10, 'תשואה טיפוסי' הנמצאים בסמטאות 1, 4, 5, 6 ו 8 או 'תשואה גבוהה' הנמצאים בסמטאות 2, 7, 9, 11 ו- 12. לשימוש דגימות עם 'טיפוסי תשואות', 10-15 µL של בדיקה מעורבבת עם µL 100 של הכלאה פתרון עבור ניסוי ב באתרו . לדלל דגימות עם 'תפוקה גבוהה' של המכשיר עם פתרון הכלאה נוספים עם הלהקה כמות יחסית עוצמת 'אופייני בדיקה'. שואפים יש ריכוזים שווים בדיקה סופית מכל קידוח. החץ מצביע על אחד "הגששים RNA,' הלהקה גבוה יותר על כל ליין היא תבנית ה-DNA המקורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3. רס ן צעדים אוסף העובר בקנה מידה גדול, קיבעון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
באיור 4. צינור תוצרת בית הסרת נוזל לרקמות זחל או צף. ממחטה זחל ומבוגרים מרחף בתמיסה במהלך קיבעון. כלי פשוט זה מורכב רשת ניילון מוחזק על ידי µL 200 לחתוך עצה, ואחריו טיפ 1 מ"ל בתור מתאם להתחבר העצמות. נוזל ניתן להסיר בבטחה מבלי לאבד את כל רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5
איור 5. הגברה של האות Tyramide. (1) לחפור התווית על-ידי בדיקה antisense RNA hybridizes בחוש אנדוגני RNA. (2) כריכת חיסונית-זיקה בין נוגדן ראשוני מצומדת ביוטין החפירה-UTP. (3) HRP מצומדת ביוטין איגודים streptavidin. (4) HRP מזרז את cyanine 3-tyramide, מימן על-חמצני התגובה כדי ליצור רדיקלים 3-tyramide cyanine קצרת ימים. (5) cyanine 3-tyramide רדיקלים לאגד טירוזין שאריות על חלבונים הסמוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6
איור 6. נציג בחיי עיר הכלאה תמונות. כל לוח מראה דוגמה של RNA שונים (מוצג בציאן) ואת הגרעינים צבעונית עם דאפי (מוצג בצבע אדום). (א-ג) דוגמאות עוברי דרוזופילה מוקדם. (D, F) דוגמאות מאוחר עוברי דרוזופילה . (G-J) דוגמאות של 3 instar רקמות זחל דרוזופילה (malphigian בקוריאנית, פיתול, בלוטות ושרירים בהתאמה). (K) השחלה למבוגרים. (יב) למבוגרים testis. כל לוח מציג את השם של הגן זה המכשיר הוא hybridizing ל. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

פרוטוקול המתואר מספק שיטה לשחזור מאוד, רגישה, וחסכוני עבור הגילוי של RNAs רוב קבוע עוברי דרוזופילה או רקמות. למרות מעט יותר מסובך ממה יותר השתמשו באופן מסורתי phosphatase אלקליין בשיטה של בדיקה לזיהוי, הרזולוציה מתקבל על ידי דג גדול בהרבה, והוא הרגישות דומות או משופרת 7,8. באמצעות לוחות שלמים או חלקיים microtiter, הפרוטוקולים יכול לשמש עבור ניתוחים בקנה מידה גדול או מוגבלת של הגנים של עניין. יצוין כי הגששים שנוצר עשוי לזהות את כל או אחוי התעתיק מספר טפסים אלא אם הגששים נועדו יותר במיוחד (קרי, exons יחיד). למרות בדקנו הגששים קטן כמו נוקלאוטידים 200 עם הצלחה סבירים, הגששים קטנים נוטים להיות פחות יעיל, וייתכן שהוא פחות ספציפי. . בבירור, פרוטוקול זה אינו מתאים עבור זיהוי אינטרונים קטן, exons, או מעובד מיקרו Rna.

למרות גישה זו משתמשת צעד אנזימטי כדי להגביר את עוצמת האותות, עוצמת אות מופיעה כדי להיות פרופורציונלי היעד גנים במגוון יחסית לינארית ורחב של רמות הביטוי. בהגדלה גבוהה יותר, האות נתפסת puncta או ספאקלס בתוך תאים ורקמות. עבור תעתיקים נדירים יחסית נראים רק כמה puncta זעירים. התעתיק שפע גודלת, אלה גדלים מספר וגודל. כמו עם מולקולה בודדת דגים (smFISH), puncta קטן יחיד יתאימו גם ל- RNAs יחיד, צריך גם להיות ברצון לכמת באמצעות תוכנת הדמיה ואינפורמטיקה. השוואות של תמונות שפורסמו שהושג באמצעות smFISH עם תמונות כי לנו יש מספר פעמים עבור המטרות אותן מציע כי בסך הכל, רגישות ורזולוציה של שתי השיטות דומים יחסית, למרות זה צריך להיבדק על ידי השוואות קפדנית יותר. בהתחשב את חשבון גבוה יותר של smFISH, פעולת השירות שסופק כאן צריך לתת תוצאות דומות בכל חלק של העלות. עם זאת, אם המטרה היא לזהות תעתיקים קטן, או חלקים ברורים של הפרוטוקולים, מומלץ smFISH.

בשל גודל קטן יותר של הגששים דגים מסוימים, שיטה זו עשויה גם להיות יותר החודר לרקמות גדולים, או מכשולים משמעותיים. עם זאת, השימוש רמות גבוהות דטרגנט וצובטת רקמות קיבוע ו permeabilization מופיעים פתר בעיה זו. בסופו של דבר, למרות שפותח דרוזופילה לרקמות, המאגרים דטרגנט גבוהה המתוארים כאן בשביל לרקמות ביתור צריך גם לעבוד עבור עוברי דרוזופילה וכן רוב אחרים אורגניזמים ורקמות.

גילויים

לעורכים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על ידי מענק כדי HMK על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק 133473 סמרטוט).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילןFrogga BioTB15-500ללא DNase ו-RNase
2x PCR Master Mix עם צבע (אמביוגן)Biomart (קנדה)141106-1Kללא DNase ו-RNase
ללא 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילןFrogga BioTB50-500צלחת סינון 96 בארות ללא DNase ו-RNase (
1.2 אום, PVDF הידרופילי ממברנהEMD MILLIPOREMSBVS1210משמש להסרת liguid מתחתית הצלחת עם רקמות ציפה
צלחת PCR 96 בארות (200 μ l)מסנן מזרק DenvilleC18096-10
Acrodisc (0.2 u)PALLPN4612
מסנן מזרק Acrodisc (0.45 u)PALLPN4614
AgaroseBioshopAGA002.500
AXYGEN 96-well בדיקות צלחות אחסוןUltiDent Scientific24-P96-450V-Cלאחסון מלאי גליצרול חיידקי
AXYGEN אלומיניום אטמי צלחותUltiDent Scientific24-PCR-AS-200לאיטום צלחות
AXYGEN קצות רחבים (200 ul)UltiDent Scientific24-T205-WB-Cלהעברת דגימות
ביוטין-SP (מרווח ארוך) IgG Fraction עכבר חד שבטי אנטי-דיגוקסיןJackson ImmunoResearch Lab200062156נוגדן ראשוני ל באתרו (מלאי conc. 1 מ"ג/מ"ל, עובד conc. 2.5 μ גרם/מ"ל או דילול של 1/400.
סעפת 8 ערוצים של מותג (ניתנת לחיטוי)BrandTech Scientific Inc.704526להסרת נוזלים מהחלק העליון של לוחות PCR של 96 בארות
כלורמפניקולסיגמא-אולדריץ'C1919ריכוז מלאי 34 מ"ג/מ"ל מומס ו-0.2μ m מסונן ב-100% EtOH (השתמש כ-1/1000)
ציאנין 3 טירמיד (Cy3-TSA)תוצרתניתן להזמין מ-Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Diazabicyclo [2.2.2] אוקטן)Sigma-aldrichD2522מגיב אנטי-דהייה באמצעי הרכבה
Digoxigenin-11-uridine-5'-triphosphateRoche11-209-256-910
כלוב איסוף עובריםבית מיוצרN / Aגודל: 75 ס"מ X 75 ס"מ X 75 ס"מ עשוי עם פולימתיל מתקרילט
צנטריפוגה אפנדורף 5804אפנדורףדגם 5804צנטריפוגה לצלחות 96 בארות על רוטור A-Z-DWP
פורממידביושופFOR001.500
גליצרולביושופGLY002.4
גליציןביושופGLN001.500
הפריןSigma-AldrichH4784-250MGמלאי: 50 מ"ג/מ"ל. ריכוז עבודה 1 מ"ג/מ"ל בתמיסת הכלאה
חרוזי שריון מעבדהDiaMedLAA42370-001מילוי יחידת חימום
Labnet Gyro M מיני מיקסר אגוזיםפישר סיינטיפיק50-998-347ערבוב דגימה
- 100 miconsFlyStuff57-103לאיסוף עוברים
רשת - 800 מיקרוןSEFAR - Nytex06-780/53לתפיסת רקמות רופפות / עשוי לשמש לצינור מיוחד באיור 4.
משקפי מיקרו כיסויVWR48366-067גודל: 22 X 22 מ"מ
מיקרו שקופיות, frstdVWR48312-003גודל: 25 X 75 מ"מ
סעפת ואקום רב-בארותצלחת Pall CorporationP/N 5017הסר נוזל מתחתית צלחת סינון 96 בארות
Paraformaldehyd (PFA)BioshopPAR070.500קיבוע
Bio-Radדגם: מנוע DNA PTC-200צלחת 96 בארות PCR ובדיקה דנטורציה
תמיסת חומצה פיקריתסיגמא-אולדריץ'80456לקיבוע רקמות I תמיסת
אשלגן כלורי (KCL)מכסה ביושופPOC308
PP לצלחות 96 בארות, מכסה 100/מארזUltiDent Scientific24-P-LID-PPלאחסון צלחות
מאגרי ריאגנטים חד פעמיים של פרוג'ן (50 מ"ל, סטרילי)UltiDent Scientific825-1-50-5Sטיפול בנוזלים
פרוגן רדיד אלומיניום ניתן לפירסינגUltiDent Scientific87-CFILM-ALאטם צלחת 96 בארות, ללא DNase ו-RNase
Proteinase KSigma-aldrichP2308- 5MGחדירות עובר
מעכב ריבולוק ריבונוקלאז ריבונוקלאזתרמו סיינטיפיקEO0381סט 40 יחידה/ul
ריבונוקלאוזיד טריפוספט (NTP)סיתזת בדיקת RNA11277057001 רוש
ללא RNase GIBCO10977015-500 מ"לסיתזת בדיקת RNA
RNaseZapAmbionAM9780הסר זיהום RNase
DNA חד גדילי מאשכי סלמוןSigma-aldrichD9156לתמיסת הכלאה
חלב רזה (כוח ללא שומן)BioshopSKI400.500ריכוז העבודה הוא 1% ב-1 X PBT או PBTT כמגיב חוסם
נתרן אצטט (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (ללא RNase)BioshopSAA333ריכוז העבודה הוא 10% (v/v) עבור משקעי DNA או RNA
SP6 RNA PolymeraseThermo ScientificEP013120 יחידה/ul
זריקת נירוסטה לאמבט חולVWR13259-274.למילוי יחידת החימום
סטריאומיקרוסקופ ומקור אור צוואר אווזLeicaדגם: MZ6דיסקציה של רקמות והרכבה
סטרפטווידין, חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומדבדיקות מולקולריותS911מלאי נוגדנים משני: 1 מ"ג/מ"ל, השתמש בדילול 1/1000 (1 μ g/ml) עבור באתר.
T3 RNA פולימראזThermo ScientificEP010120 יחידות/ul
T7 RNA פולימראזThermo ScientificEP011120 יחידות/תחנת
קצה ul (10 ul)AxygenT-300-STK-Sמוסמך DNase ותחנת קצה ללא RNase
(200 ul)Sorbio27770Tמוסמך DNase ו-RNase
ללא טיפים (1 מ"ל)Sorbio10200מוסמך ללא DNase ו-RNase TRITON
X-100BioshopTRX506ריכוז העבודה הוא 0.3% ב-1 X PBT לרקמה באתרה
Tween 20BioshopTWN510ריכוז העבודה הוא 0.1% ב-1 X PBT לעובר באתרו
נייר סינון איכותי Whatman, דרגה 3Sigma-aldrichWHA1003917
NameCompany Catalog NumberComments
SolutionsPreparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane), גליצרול, חומרDABCO (1.25 גרם), גליצרול (35 מ"ל או v/v, 70%) ו-1 X PBS (15 מ"ל, או v/v, 30%). שמור על חושך ורוק בחדר קר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
1 X PBT (1L)1 X PBS עם 1 מ"ל Tween 20 (0.1%)
1 X PBTT (1L)1 X PBS עם 1 מ"ל Tween 20 (0.1%) ו-3 מ"ל Triton-X-100 (0.3%)
1 X PBTB (1L)1% חלב דל שומן ב-1 X PBT
1 X PBTTB (1L)1% חלב רזה ב-1 X PBTT
בית רשת מכונת PCR מים הרכבה נגד דהייה,

מקורות

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
  4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  5. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
  6. Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
  7. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
  8. Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
  9. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  10. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
  11. Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
  12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA96Anti DIGStreptavidin HRP
ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.