Method Article

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

DOI:

10.3791/56293

⸱

October 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 2School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 3Department of Infectious Diseases, Monash University, 4University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול למדוד גלגול מאת ומונוציטים מעבר monolayers אנדותל אנושית ועם בגרות עוקבות שלהם לתאי קצף. זה מספק שיטה תכליתי כדי להעריך את מאפייני atherogenic ומונוציטים מבודד מאנשים עם מחלות שונות תנאים וכדי להעריך גורמים בדם אשר עשוי לשפר את הנטייה הזאת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לב כלילית (CAD) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. טרשת עורקים, מוביל לגרום של CAD, הוא שיזם גלגול של מולדת ומונוציטים המערכת החיסונית לאתרים דלקתיות של הפקיד השומנים הנקרא פסי שומן, אשר נמצאים בתוך דפנות העורקים של מדיום כדי עורקים גדולים. תכונת פתוגניים המפתח של נגעים בשלב כזה מוקדם של טרשת עורקים היא ההבשלה של monocytes אשר נודדים אל העורקים כדי ליצור תאי קצף או עמוסי השומנים מקרופאגים. ראיות רבות תומך את ההשערה כי הסיכון של טרשת עורקים מוגברת על ידי התנאים דלקתית כרונית המלווה מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית, HIV, כמו גם הזדקנות כללית, וכי הסיכון הזה הוא ניבא על ידי מונוציט הפעלה. בעוד העכבר מודלים מספקים פלטפורמה טובה לחקור את התפקיד של monocytes atherogenesis ויוו, הן דורשות שינוי גנטי של כולסטרול טבעי מטבוליזם ושינוי דרסטי של העכבר הרגיל דיאטות, מוגבלת התאמה חקר השפעות atherogenic של מחלות comorbid אנושי. זה הניע אותנו לפתח מודל אנושי במבחנה כדי למדוד את הפוטנציאל atherogenic של monocytes מבודד מאנשים עם מצבי מחלה מוגדרת. כיום, אנושיים במבחנה מודלים המגבילים בכך שהם מוערכים מונוציט גלגול קצף תא היווצרות בבידוד. כאן נתאר פרוטוקול שבו ומונוציטים מבודד דם החולה transmigrate על פני תאי אנדותל אדם לתוך מטריצה קולגן מסוג 1, ואת הנטייה שלהם להבשיל לתאי קצף ב נוכחות או היעדרות של השומנים אקסוגני נמדד. הפרוטוקול אומתה על השימוש האנושי ומונוציטים מטוהרים אנשים עם הידבקות ב- HIV ויחידים HIV uninfected קשישים. מודל זה הוא תכליתי ומאפשר מונוציט גלגול קצף תא היווצרות להעריך באמצעות מיקרוסקופ או או cytometry זרימה, כמו גם מאפשר את ההערכה של גורמים atherogenic, המצויים בסרום או פלסמה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מונוציט גלגול היא צעד מכריע בהתפתחות טרשת עורקים פלאק שעלולות להוביל פקקת, שבץ מוחי, אוטם שריר הלב. שלטי טרשת עורקים להתפתח פסי שומן, בדרך כלל נוכח באתרים של זרימת הדם מתנדנדות נמוך בינוני עורקים גדולים, שבו הופקדו השומנים תורמת הפעלה אנדותל, מקומי דלקת1. ומונוציטים מגויסים כדי תאי אנדותל פסי שומן באמצעות מונוציט chemotactic חלבונים (כגון CCL2), transmigrate לתוך אינטימה2. בעקבות גלגול, ומונוציטים עלולה להיווצר מקרופאגים atherogenic, עמוסי השומנים הנקרא תאי קצף בשל ספיגת השומנים, בסינתזה השומנים, למטה-ויסות כולסטרול בזרימת או שילוב של הגורמים לעיל. ומונוציטים עשויים לצבור שומנים במחזור ויש גם הפנוטיפ 'רכה', יכול להיות נטייה תאי קצף תא היווצרות3,4. תאי קצף התכונות המגדירות של פסי שומן ושלטים טרשת עורקים בשלב מוקדם, שלהם גיבוש מושפעת השומנים וגם מתווכים דלקתיים5. לחלופין, ומונוציטים יש את היכולת להפוך transmigrate של העורק לתוך מחזור הדם6, ובכך להסיר את השומנים מן אינטימה להתנהג כדי לשמור על הבריאות של העורק.

קביעת של הנטייה של monocytes כדי transmigrate על פני אנדותל העורקים ואת תאי קצף טופס של אינטימה, או להיפוך transmigrate ולסחוב השומנים מחוץ הפלקיו, היא דרישה מפתח להבנת התפקיד של הפעלת מונוציט בהגדלת הסיכון טרשת עורקים. דגמי העכבר CADs כגון טרשת עורקים חשובים שחקרתי בזמן אמת אין ויוו מידע על התפתחות רובד שומני פס/טרשת עורקים. עם זאת, מודלים אלה מחייבים שינוי גנטי של רמת הכולסטרול טבעית עיבוד היכולות של חיות אלו בדרך כלל בשילוב עם שינויים דרסטיים דיאטה (כגון דגם דיאטה ספקיות-/-מערבי-type)7,8, ובכך, גרימת הצטברות-פיזיולוגיים של מחזורי השומנים רמות שהתפתחות לוח הכונן. מודלים אלה תהיה מוגבלת רלוונטיות התנאים דלקתית כרונית אנושיים כגון הידבקות ב- HIV אשר אינם משויכים מוגבר במחזור כולסטרול או רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). יתר על כן, הבדלים בביולוגיה מונוציט בין בני אדם ועכברים לבצע בדיקה של אימונולוגי שאלות הנוגעות הרלוונטיות של subpopulations של ומונוציטים (כגון ומונוציטים ביניים (CD14++CD16+))9 קשה. זה חשוב כאשר לומדים את מנגנוני נהיגה למחלות לב וכלי דם כמו ספירת ביניים מונוציט באופן עצמאי לחזות אירועי לב וכלי דם10,11. בזמן מבחני קיימים למדוד באופן רציף או מונוציט גלגול או קצף כדוריות בבידוד, אין assay במבחנה אומתה לכימות תנועת שני היבטים של atherogenesis מוקדם באמצעות אותם התאים של גדודים קליניים. Transwell מודלים לנצל ששונה בוידן דו תאיים מערכת לפיה תאים מוטענים לתוך התא העליון, transmigrate דרך מחסום פלסטיק נקבובי או טפט תא לתא התחתון המכיל בדרך כלל מדיה עם chemoattractant12 , 13. תוך שימוש נרחב לניתוח ליקוציט גלגול, מודלים אלה בדרך כלל לא לשלב שכבה המייצג של אינטימה, וכתוצאה מכך שמדמו תאים נודדים לתוך פתרון, ולא מאפשרים לשקילת קצף תא היווצרות או גלגול לאחור של אותם התאים. לעומת זאת, מודלים של היווצרות תאי קצף לא בחשבון שינויים transmigratory-induced ומונוציטים או אפקטים של הפעלת אנדותל אשר ידוע לתרום קצף היווצרות התא14. יתר על כן, מערכות אלו זירוז קצף כדוריות של מקרופאגים דבקה צלחות התרבות התא על ידי הוספת קולח ריכוזי אקסוגני מחמצנים ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (oxLDL)15,16משרן מפתח להק תא קצף. LDL בשימוש במודלים אלה היא לעתים קרובות תחמוצת על-ידי תהליכים שאינם פיזיולוגית-רלוונטיות כגון טיפול4 CuSO17, לכן, לחקור את חשיבות פיזיולוגית של מחקרים באמצעות מודלים אלה.

כאן נתאר וזמינותו של זה מכמת מונוציט גלגול, היווצרות תאי קצף לאותם התאים אשר אינה דורשת התוספת של oxLDL אקסוגני, לכן כדאי דגמי את התפקיד של monocytes במבנה התא קצף. מודל זה פותחה במקור על ידי פרופסור ויליאם מולר (אוניברסיטת נורת'ווסטרן, שיקגו)18, יש נוספת מעודן במעבדה שלנו להעריך שמחוץ atherogenicity של monocytes מבודד תחת שאינו מפעיל מאנשים עם מצבים דלקתיים כבסיס המלווה מחלות כמו איידס זיהום19 , כמו גם הזדקנות20, כי התנאים קשורה לסיכון מוגבר של טרשת עורקים. מודל זה מספק גם פלטפורמה עבור מענה לשאלות ביולוגי בסיסי לגבי נטיה של קבוצות משנה מונוציט שונים לטופס קצף תאים20, ההשפעה של הפעלת אנדותל על ידי ציטוקינים כגון TNF-קצף כדוריות14 , ואת המאפיינים הנדידה של monocytes כגון עומק ומהירות מהאוכלוסיות ג'לים19. יתר על כן, גלגול מונוציט תא היווצרות קצף ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ רגיל, לחיות תא הדמיה, flow cytometry והדמיה cytometry זרימה, לכן, לספק שיטה רב תכליתי כדי להעריך את התפקיד של monocytes ב- atherogenesis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו באישור אתיקה אלפרד חולים אנושיים ועדת האתיקה, מלבורן. כל הניסויים בוצעו ב- Class II אבטחה ארונות, אלא אם כן צוין. " Prewarmed " מתייחס ריאגנטים התחמם עד 37 מעלות צלזיוס waterbath.

1. הכנה של סוג I סיבי קולגן ג'לים: יום 1

  1. הכנת polymerized קולגן ג'לים על-ידי הוספת ולערבב 35.7 מ"מ NaOH ברצף, 0.71 x M199, חומצה אצטית 4.58 מ מ ו- 1.71 מ"ג/מ"ל מקליד אני סיבי קולגן פוליסטירן מ ל צינור לפי טבלה 1-
    הערה: ודא כי הקולגן הוא מעורבב היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים על מנת לעצור את הייצור של קולגן ' כיסים ' בתערובת ג'ל. להכין 4-6 ג'לים לכל תנאי בדיקה מיקרוסקופית או ג'ל 15 לכל תנאי הבדיקה עבור cytometry זרימה.
  2. טוב פעם מעורבים, aliquot µL 50 של קולגן ג'ל תערובת לתוך כל טוב של צלחת סטרילי שהונעו 96-ובכן תרביות רקמה. אל תשתמש בשורות ובעמודות מבחוץ, אבל למלא אותם עם 200 µL 1 x Dubecco ' s פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) כדי להגן על ג'לים מהתייבשות. דגירה צלחות-37 °C/5% CO 2 על 2 h לאפשר הקולגן פולימריזציה.
    הערה: הנח את הצלחות ישירות על מדפי מתכת נקייה בחממה כדי להבטיח אפילו חום הפצה.
  3. בעקבות דגירה, כיסוי של ג'לים עם 150 µL 1 x שהושלם M199 (ראה טבלה של חומרים) דגירה במשך 5 ימים עד שימוש.

2. הרחבת מאוחסנות HUVEC: 1 יום

  1. תווית והמעיל 10 ס מ קוטר צלחת פטרי עם 1 מ"ל של 50 µg/mL fibronectin מדולל ב- 1 x PBS, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
    2. Aliquots
  2. הפשרה של cryopreserved חבל הטבור אנושי ראשוני הווריד תאי אנדותל (HUVEC, 1.0 x 10 6 תאים) 10 מ"ל M20.
    הערה: HUVEC צריך להיות מוכן כפי שתואר קודם לכן 21 ומשמש במספר נמוך המעבר (< מעבר 4). HUVEC עשוי להיות מוחלף עם תאי אנדותל עורקים האנושי כאן.
  3. Resuspend HUVEC ב- 10 מ"ל M20 ולהוסיף מאכל מצופה fibronectin, כ רפה בעברית fibronectin עודף לפני תוספת של תאים, תרבות של הנהרות (כ 5 ימים), החלפת בתקשורת על יום 3-

3. Culturing HUVEC טפט על קולגן ג'לים: יום 5

  1. ביום 5, ניתוק HUVEC על ידי כ רפה בעברית תרבות supernatant מ הפטרי ועקצה סרום המכיל מדיה עם 10 מ"ל של ללא סרום M199.
  2. מוסיפים טריפסין 0.05% מ ל/0.53 EDTA M199 כדי HUVEC, תקופת דגירה של 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, מנענע בעדינות עד לנתק התאים.
  3. ברגע מנותק, לשטוף צלחת פטרי עם 5 מ"ל M20 ובמהירות העברת שהמדיה המכילה תאים לרכבת התחתית 10 מ ל-
  4. דגימות צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, תשאף תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 200 של M20 ו לספור תאים באמצעות hemocytometer.
  5. Resuspend לתאים 2.0 x 10 5 תאים/מ ל M20, וארוקן את M199 על ג'לים מהצלחת 96-ובכן (שלב 1.3), להוסיף 100 µL של resuspended HUVEC (2.0 x 10 4 תאים) כל ג'ל קולגן המוכן מעל (שלב 1.2). תרבות צלחות 3 ימים נוספים-37 °C/5% CO 2.
    הערה: על טפט HUVEC השלמות עשוי לאשר לאחר 3 ימים כסף חנקתי מכתים 22 או אימונוהיסטוכימיה עבור צומת חזק חלבונים 23 בשלב זה. ג'לים נוספים חייבים להיות מוכנים למטרה זו.

4. הפעלה של טפט HUVEC, בידוד/הפעלה של Monocytes עבור גלגול: ביום 8

  1. על יום 8, להפעיל כל טפט HUVEC לפני התוספת של monocytes על-ידי כ רפה בעברית M20 של מדיה בשכבת-על ג'לים והוספת µL 100 של 10 ng/mL TNFα האנושי ב- M20 לכל ג'ל. דגירה-37 °C/5% CO 2 עבור 4 h.
    הערה: תנאים שלא הופעל HUVEC עשויות להיכלל גם אם נדרש כפקדים.
  2. במהלך 4 h HUVEC ההפעלה צעד, ולבודד ומונוציטים מ- PBMCs באמצעות מגנטי חרוז טכניקות כדי לבחור באופן שלילי עבור תאים לפי היצרן ' s הוראות. מינימום של 6.5 x 10 6 PBMCs אמור לשמש בשלב זה כדי לשחזר בצורה אמינה 3.0 x 10 ומונוציטים 5 הדרושים עבור תנאי אחד, כפי ומונוציטים בחשבון בדרך כלל כ- 10-15% PBMCs.
    הערה: כדי להעריך את ההשפעה של הפעלת מונוציט לפני היווצרות גלגול מונוציט תא קצף, ומונוציטים יכול להיות מופעל בשלב זה. ומונוציטים יכול להיות מבודד PBMCs המופשרים במידת הצורך (כלומר, מאוחסנות הדגימות החולה). מונוציט קבוצות משנה בודד על-ידי מיון FACS ניתן להכין עבור תוספת ג'ל (איור 1).

5. גלגול של ראשי ומונוציטים אנושי: ביום 8

  1. כדי למדוד מונוציט גלגול, להסיר המכילות TNFα מדיה ותרחץ ג'לים פעמיים עם 100 µL M199 על-ידי הוספה והסרה של מדיה. אחרי הכביסה, להוסיף 2.0 x 10 5 טרי מבודד או הקרת, שטף cryopreserved PBMCs או 5.0 x 10 ומונוציטים 4 טריים מבודד או מטוהרים מונוציט קבוצות משנה כדי HUVEC monolayers ב 100 µL M20. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי לאפשר גלגול קדימה של monocytes לתוך הג'ל. מומלץ לאפשר בארות 6 עבור כל תנאי הניסוי בדק.
    הערה: כדי להעריך את השפעת סרום עצמיים על היווצרות התא גלגול וקצף, דגירה תאים עם M20 המכיל את הריכוז הרצויה של התורם לא פעיל חום סרום ולהשוות תנאים עם פקד במאגר בנסיוב אדם. לויקוציטים חוץ ומונוציטים ניתן להוסיף בשלב זה. אם חוקר את השפעת מינים ספציפיים ליפידים/שומנים בדם (למשל, HDL, oxHDL), בצע את השלבים הבאים כל עם מדיה ללא סרום המכיל שומנים µg/mL 20-50-
  2. לאחר 1 h של גלגול לפנים, לאסוף את התאים הלא-שמדמו ע י שטיפת ג'לים פעמיים עם µL 100 מ מ 1 prewarmed EGTA ב- 1 x PBS, ופעם אחת עם 100 µL M199 (אותו דבר צנטריפוגה תנאים), צירוף של supernatants מכל קידוח של אותו ניסיוני תנאי (בדרך כלל 6 בארות) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL על קרח. Centrifuge התאים הלא-שמדמו-4 ° C, g x 300 עבור 5 דקות ו- resuspend ב- 30 PBS 1 x µL.
  3. לספור את התאים שליקט את תגובת שיקוע כדי לקבוע את מספר התאים הקדמיים שמדמו.
  4. אחוז תאים שמדמו קדמי נקבע כדלקמן:
    figure-protocol-1 figure-protocol-2 figure-protocol-3
  5. לכסות נסחפה ג'ל המכיל תאים שמדמו עם 100 µL M20 דגירה עבור ה 48 נוספים
  6. לאחר 48 שעות, לאסוף את תגובת שיקוע של תאים שאינם שמדמו לשטוף פעמיים עם 100 µL prewarmed 1 מ"מ EGTA/PBS, איסוף וריכוז את תגובת שיקוע של כל תנאי כמו שלב 5.2.
    הערה: פנוטיפ של תאים שמדמו הפוכה עשוי להיבדק על f תאים אלהcytometry זרימה רגילה מכתים פרוטוקולים.
  7. צנטריפוגה תאים ב 4 ° C, g x 300 עבור 5 דקות, resuspend תאים ב- PBS 1 x µL 30. לספור תאים ולקבוע את הכדאיות באמצעות צביעת trypan blue.
  8. לקבוע את אחוזי תאים שמדמו הפוכה באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-4
    הערה: הנהלת חשבונות עבור המספר הכולל של תאים שמדמו קדימה נותן אינדיקציה מדויקת יותר של גלגול לאחור כפי שהוא גלגול קדימה לא סביר יהיה 100%-
  9. עבור ניתוח על ידי מיקרוסקופ, לתקן את ג'ל על-ידי הוספת µL 100 2% פורמלדהיד (ריכוז סופי) כל טוב, לכסות את הצלחות אלומיניום לסכל ולאחסן ב 4 ° C עד הניתוח. עבור cytometry זרימה, אל תתקן את התאים בשלב זה. לראות את הפרוטוקולים מתחת מיקרוסקופ (סעיף 6) או ניתוח תזרים cytometry (סעיף 7).
    התראה: פורמלדהיד הוא רעיל, מאכל; השתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי). כדאי לשים לב בעת הוספת פורמלדהיד, עם זאת, שלב זה אינו צריך להתבצע בשכונה fume בשל הריכוז נמוך בשימוש.

6. כימות של קצף תאים מקרופאגים על ידי מיקרוסקופ (שמן-אדום O כתם)

  1. להסיר את הפורמלדהיד ולשטוף את ג'ל עם 100 µL של 50% (v/v) מתנול עבור 5 דקות, 100 ואז 78% (v/v) µL מתנול עבור 15 דקות
    הערה: השלבים מכתימים ניתן לבצע על הספסל מעבדה ולא ארון Class II הביולוגי.
  2. הכתם השומנים טיפות על-ידי הוספת 100 µL של טריות 0.2% (w/v) שמן-אדום O (לפרטים, ראה טבלה של חומרים) לשעה בטמפרטורת החדר.
  3. הסרת כתם עודף בשטיפה של ג'לים 4 פעמים עם 100 µL של 78% (v/v) מתנול, כ רפה בעברית ומחיקת את תגובת שיקוע לאחר כל לשטיפה
  4. Counterstain במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 100 µL של Giemsa, 1:10 מדולל במים מזוקקים.
  5. וארוקן את צביעת גימזה ולשטוף ג'לים פעם אחת עם מים-
  6. כדי לנתק את ג'לים מהצלחת, שפת הבארות באמצעות מחט 21 G, עם שפוע גוחנת, סביב הקצוות של הג'ל.
  7. כדי לטעון את ג'לים בשקופית מיקרוסקופ, אגרוף שני חורים (6.35 מ מ קוטר) רצועה 2.54 ס מ x 1.5 ס מ של סרט הדבקה דו-צדדי. לתקן את הקלטת לצד מיקרוסקופ רגיל ולהסיר ציפוי המגן מלמעלה.
    1. הוסף טיפה של מים החורים את הקלטת באמצעות פיפטה של העברה. באמצעות פינצטה, להעביר בעדינות ג'לים החורים הקלטת ואת כיסוי עם coverslip 1.5 זכוכית גודל. לחץ בעדינות על coverslip לדבוק זה הקלטת.
  8. לבחון עם התערבות דיפרנציאלית ניגודיות מיקרוסקופיית בהיר-שדה באמצעות המטרה X 40 על מיקרוסקופ הפוך.
    1. הביאו טפט HUVEC להתמקד בגיל 40 X ההגדלה ואת הגלילה ' לתוך ' הג'ל, ספירת תאים מקרופאגים/קצף ברחבי העומק כולו של הג'ל. חזור על שלושה ייחודי שדות מבט ממוקם במרחקים דומה מהקצה של הג'ל על מנת לצמצם תופעות אפשריות קצה. פעולה זו תבטיח את עומק ג'ל אינו עקבי בין ספירת אזורים.
      הערה: ציון תאים הג'ל כצבעי תאי קצף (כהגדרתו תאים המכילים > 1/3 ציטופלזמה שלהם כמו שמן-אדום O צבעונית השומנים טיפות) או מקרופאגים בתוך שעתיים של הרכבה בשקופיות ( איור 2). קצף כדוריות מבוטא כאחוז מתוך תאי קצף ביחס למספר תאים שהועברו ומבוטא לפי הסעיפים החציוני ב- 3 שדות ראייה בדק עבור ג'לים 6 לכל תנאי, ולכן החציוני של מדידות 18 לכל תנאי. דוגמה של ספירת raw של ניסוי טיפוסי מוצג בטבלה מס ' 2-
      הערה: סיווג תא כמו macrophage לעומת תאי קצף על ידי מיקרוסקופ הוא סובייקטיבי, וכתוצאה מכך יכול להיות תלויי-חוקר. במחקרים קליניים, שבו מתבצעים ניסויים על פני תקופה ארוכה של זמן, חשוב עבור כל ספירה להתבצע עד חוקר יחיד. דוגמאות של קצף תאים מקרופאגים, ג'לים מסופקים באיור 2.

7. ניתוח של תאים שמדמו מאת Flow Cytometry

  1. phenotypically לאפיין תאי קצף ו מקרופאגים בעקבות הגירה transendothelial, לעכל את ג'ל על-ידי הוספת µL 100 של 37 ° C prewarmed 1 מ"ג/מ"ל collagenase D מעורבבת עם M199 כדי כל טוב, תקופת דגירה של 20 דקות-37 °C/5% CO 2.
    הערה: הנח את הצלחות 96-ובכן ישירות על מדפי מתכת נקייה בחממה כדי להבטיח אפילו חום הפצה.
  2. בעקבות דגירה, macerate של ג'לים באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, דגירה כעשרים דקות נוספות-37 °C/5% CO 2.
  3. פעם מלא מתעכל, מסנן ובריכה ג'לים שכפל מתעכל דרך 35 מיקרומטר ניילון mesh רצ'ט צינורות FACS המוטלות על קרח, לשטוף פעם עם FACS לשטוף (ראה טבלה של חומרים) ב 4 ° C, x 300 ג' Resuspend תאי µL 100 של FACS ווש
  4. תקופת דגירה התאים שנוצר עם fluorophore מצומדת נוגדנים ספציפיים של CD45, סמן תא חי/מת וסמנים משטח/תאיים פנוטיפי או פונקציונליים עניין באמצעות פרוטוקולי cytometry זרימה רגילה.
    הערה: להכין שליטה צינורות לפיצוי באמצעות fluorophores המתאים Ig פיצוי חרוזים. תאים שחולצו עשוי גם להיות שנאספו על גבי זכוכית שקופיות מיקרוסקופ immunofluorescence על ידי cytospinning. לחלופין, בהצלחה שאספנו תאים באמצעות פרוטוקול זה להערכה באמצעות הדמיה cytometry זרימה.
  5. לרכוש תאים באמצעות cytometer של זרימה, ולבצע פיצויים כנדרש.
    הערה: כמו קצף תאים/macrophages עלול לא בצורת אוכלוסיות נפרדות באמצעות מאפייני פיזור אור, עשויים להיות שונים במידה ניכרת בגודלם, להגדיר פיזור הבא הליברלית (FSC) ושערים פיזור (האס) בצד כדי ללכוד את כל התאים שהועברו כפי שמוצג < מחלקה חזקה = "xfig" > 3A איור.
  6. בעקבות הרכישה, לבצע את ניתוח נתונים באמצעות תוכנה cytometry זרימה. כדי לזהות תאים שהועברו, בחר תחילה את התאים כמו שלילית דה מרקר חי/מת, כפי שמוצג באיור 3B. לאחר מכן, לבצע אפליה של תא בודד על-ידי יצירת שער חזק מסביב לתאים שמוצג על מגרש לעומת גובה האס האס-אזור.
  7. בחר CD45 + תאים, שער האוכלוסייה הגדולים של תאים שהועברו נוכח מגרש FSC/האס כמו אלה הם תאים מקרופאגים/קצף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכימות מונוציט גלגול

ומונוציטים נוספים למודל כמתואר באיור1, ג'לים שישה מוכנים עבור כל תנאי. ומונוציטים עבור ג'לים 6 לכל תורם (קרי, 5.0 x 10 ומונוציטים4 לכל ג'ל ג'ל 6 = 3.0 x 10 ומונוציטים5 לכל התורם) הם resuspended לאמצעי הסופי של 600 µL של המדיה M199 המכילה את השומנים בסרום/מבודדים נדרש. תאים (כלומר, µL 100 לכל ג'ל = 5.0 x 104 ומונ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מציע שיטה רב-תכליתי פיזיולוגית רלוונטי להערכת את atherogenicity של ומונוציטים מן האנושי גדודים קליניים, על ידי שילוב של גלגול מונוציט והן קצף כדוריות. מודל זה מציע יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות להק תא קצף הוא לוקח בחשבון את השפעת מונוציט גלגול על היווצרות תאי קצף ומאפשר את המדידה של גלגול לאחור6 בנוסף הגלום הנטייה של monocytes להבשיל לתאי קצף ב נוכחות או היעדרות של גורמים אקסוגניים. יתר על כן, תפקידה של הפעלת אנדותל גם בחשבון כפי שהראתי את חמצון upregulates ההפעלה אנדותל של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים בתודה להכיר את עבודתו של פרופסור ויליאם מולר, ד ר קלייר Westhorpe שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. המחברים גם רוצה להודות AMREP Flow Cytometry הליבה עבור המיון של מונוציט קבוצות משנה ויחידת אלפרד חולים זיהומיות מחלות קליני מחקר אחיות לגיוס של HIV + בודדים על מחקרים. המחברים בתודה בתרומתן לעבודה זו של ויקטוריה תפעוליים תשתיות תמיכה התוכנית התקבל על ידי המכון ברנט. TAA נתמכת RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. עבודה זו נתמכה על ידי גרנט פרוייקט NHMRC 1108792 על פועלם לקידום AJ AH. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # UL1TR000124.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<ריאגנטים >לתכשיר ג'ל חזק
NaOHSigma-Aldrich221465-500G0.1 M NaOH מדולל ב-H20
10x M199Sigma-AldrichM0650
AcCOOHSigma-Aldrich695092-100ML20 מ"מ חומצה אצטית מדוללת ב-H20
קולגן בקר Cultrex אנימו"פ די סיסטמס3442-050-01קולגן סיבי סוג I
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>תרבית תאים
M199Life Technologies11150-059מצע M199 המכיל מלחי ארל, L-גלוטמין ו-2.2 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט.
מדיה בתוספת 100 ומיקרו; גרם/מ"ל L-גלוטמין  ו-100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין 
M20בתוספת M199 המכיל 20% סרום מאגר או תורם מומת בחום.
ניתן להוסיף ל-M199 מיני שומנים בודדים כגון LDL.
HUVECניתן לבודד תאי אנדותל ראשוניים של חבל הטבור האנושי (HUVEC) מחבל הטבור שנתרם בהסכמה מדעת ובאישור אתיקה. ניתן לרכוש HUVEC מבודד גם באופן מסחרי.
תאי אנדותל של העורקים הכלילייםניתן לבודד תאי אנדותל ראשוניים של העורקים הכליליים האנושיים מעורקים שנתרמו בהסכמה מדעת ובאישור אתיקה. ניתן לרכוש תאים מבודדים גם באופן מסחרי.
EDTABDH Merck10093.5Vחומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) - 0.5 מ', pH 8.0
EGTAסיגמא-אולדריץ'E3889-500Gאתילן גליקול-ביס(&בטא;-אתר אמינואתיל)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA) - 1 מ"מ, pH 8.0
0.05% טריפסין EDTAGibco25300-0540.05% טריפסין/0.53 EDTA (1X)
L-גלוטמיןגיבקו25030-081L-גלוטמין (200 מ"מ)
פניצילין/סטרפטומיצין ג'יבקו15140-122פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-10,000 ומיקרו; g/mL Streptomycin)
סרום עגל שנולדGibco16010-142סרום עגל שזה עתה נולד: ממקור ניו זילנדי
פיברונקטיןסיגמא-אולדריץ'F1056-1MGפיברונקטין - 50 ומיקרו; גרם/מ"ל מכסים מוכנים ומאוחסנים
PBS (1x)Gibco14200-075Dulbecco's Phosphate Buffered Salt (10x): מדללים ל-1x עם H20 סטרילי
0.1% TNFGibcoPHC3015TNF אנושי רקומביננטי - משוחזר ב-H20 ומאוחסן ב-10 ומיקרו; גרם/מ"ל aliquots
ליפופרוטאין בצפיפות נמוכהMerck MilliporeLP2-2MGליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL)
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>מיקרוסקופיה
1 או 2% פורמלדהידPolysciences4018פורמלדהיד 1 או 2% מדולל בסטרילי H20
50% ו-78% מתנולAjax Finechem318-2.5L GL50% או 78% v/v מתנול, מדולל ב-H20
שמן אדום O כתםסיגמא-אולדריץ'O0625-25Gמדולל ל-2 מ"ג/מ"ל ב-22% 1M NaOH ו-78% (v/v) מתנול
מיקרוסקופ שקופיות מיקרו-זכוכיתS41104AMKשקופיות מיקרוסקופ קצה קרקע חלביות כפולות 45 מעלות (25 X 76 מ"מ)
החלקות כיסויMenzel-Glä סרMENCS224015GP22 x 40 מ"מ #1.5 גודל כיסוי זכוכית מחליק
סרט דו צדדי3M סקוטש4011סרט הרכבה חיצוני חזק במיוחד (25.4 מ"מ x 1.51 מ')
כתם GiemsaMerck Millipore1.09204.0500תמיסת Azur eosin methylene blue של Giemsa (מלאי מדולל 1:10 ב-H20)
ניקובכף יד ניקוב חור יחיד (ניקוב 6.35 מ"מ)
nameCompanyCatalog NumberComment
Flow cytometry
Collagenase DRoche Diagnostics11088858001Collagenase D מדולל במדיה M199 ל-1 מ"ג/מ"ל 
35 ומיקרו; m רשת ניילון פוליסטירן מכוסה צינורות FACS BDBiosciences35223535 ומיקרו; m רשת ניילון פוליסטירן מכוסה צינורות FACS
חי/מת ניתן לתיקון צהוב כתםתא מת טכנולוגיותחיים L34959חי/מת ניתן לתיקון כתם תא מת צהוב
שטיפתהכן על ידי ערבוב 1 X PBS-, 2 מ"מ EDTA ו-1% סרום עגל
חדש < חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי <חזק>הערות
<חזק>כלי פלסטיק
96 צלחתNunclon167008דלתא משטח תחתית שטוחה 96 צלחת
באר 10 ס"מ צלחת פטריTPP93100סטרילית 10 ס"מ צלחת פטרי
1.5 מ"ל צינורות אפנדורףEppendorf0030 125.150צינורות אפנדורף
העברת פיפטהSamco Scientific222-20Sפיפטת העברה סטרילית (1 מ"ל, נורה גדולה)
האנושיים חור FACS באר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
  3. Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
  4. Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038(2016).
  5. Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
  6. Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
  7. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  8. Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
  9. Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
  10. Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
  11. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  12. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  13. Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  14. Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
  15. Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
  16. Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
  17. Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
  18. Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
  19. Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
  20. Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
  21. Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
  22. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
  23. Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
  24. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
  25. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  26. Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
  27. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte TransmigrationFoam Cell FormationHuman Endothelial CellsCollagen MatrixFlow CytometryMicroscopy AnalysisOxidized LDLPatient Blood SamplesAtherogenic PotentialCollagen Gel Preparation

Related Articles