מאמר שיטה

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

DOI:

10.3791/56297

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman and Campbell Brain and Spine, Department of Anatomy and Cell Biology, Indiana University School of Medicine, 2Department of Spinal Cord Injury and Repair, Trauma and Orthopedics Institute of Chinese PLA, General Hospital of Jinan Military Region, 3Department of Orthopedics, Shandong Cancer Hospital, Shandong University, 4Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy Military Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת פעילות. עצבית מבעד לחלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות 2-פוטון (2p) מיקרוסקופיה ויוו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח בתרבית של תערוכות סימטריה מסומן על פני המישור sagittal. עם זאת, תיאור מפורט של דינמיקה עצבית באזורים במוח סימטרית אצל בעלי חיים יונקים בוגרים נשאר חמקמק. במחקר זה, אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת dynamics סידן דרך חלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות מיקרוסקופ (2p) 2-פוטון. שיטה זו מאפשרת הקלטות וכן quantifications של פעילות עצבית באזורים במוח העכבר הדו-צדדיים אחד בכל פעם אותו ניסוי עבור יישום ממושך תקופה ויוו. היבטים מרכזיים של שיטה זו, אשר יכולה להסתיים תוך שעה, כוללים ניתוחים בפולשנות ליצירת windows אופטי כפול, ושימוש של הדמיה 2, P. למרות שאנחנו רק להדגים את הטכניקה באזור S1, ניתן להחיל את שיטת לאזורים אחרים של המוח החי הקלת הבהרה של המורכבות מבני ופונקציונאלי של רשתות עצביות במוח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סידן ורגולציה שלה חיוניים תיווכה מספר תהליכים פיזיולוגיים. פיקוח על דינמיקה סידן הוא שימושי להבנת תפקוד המוח נורמלי, כמו גם מצבים פתולוגיים של המוח הפרעות 1,2,3,4,5,6 7, ,8. הדמיה זריחה GCaMP6s הוא כלי רב עוצמה עבור לכימות מספרי ספייק, תזמון, תדירות, כמו גם רמות של סינפטית קלט גם במבחנה וגם ויוו 9,10,11.

המוח בתרבית של תערוכות סימטריה מסומן על פני המישור sagittal. למרות מחקרים נוירולוגיים יש לשפוך אור על שיפוץ קורטיקלית פעילות. עצבית המופעלות על-ידי טראומטי במוח או בחוט השדרה פציעה 6,7, התפקידים תפולס שלם של באופן סימטרי אזורים המתאימים לשחק השחזור הם עדיין מעורפל.

במחקר זה, אנו מתארים ניסיוני ההליכים ליצירת דו צדדיים חלונות סימטריים אופטי לדימות ויוו . באמצעות windows אופטי אלה, אנו מתארים מדידת דינמיקה סידן מן הראשית המגע cortices (S1) ב- GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות מיקרוסקופ 2, P. במקטע ' תוצאות ', אנו גם מראים ויוו מורפולוגיה דנדריטים בנקודות זמן שונות באזור S1 העכברים הטרנסגניים EGFP באמצעות הדמיה 2, P. שיטת התבוננות לגבי הדינמיקה רשת באזורים S1 הדו-צדדיים אינה אלא דוגמא ראשונית של כפול כמה חלונות פתוחים הגולגולת יעזרו מדעני מוח כדי לחקור ומידע מקומי סימטרי, עיבוד במוח של יונקים בוגרים רגילה תנאים או מחלה שונים מודלים בתוך vivo.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים טיפול כירורגי ובעלי חיים בוצעו כפי שאושר לפי המדריך את הטיפול, השימוש של חיות מעבדה (מועצת המחקר הלאומית), הקווים המנחים של אינדיאנה אוניברסיטת בית הספר של רפואה מוסדיים חיה טיפול והשתמש הוועדה. האיור סכמטי של ההתקנה הדמיה 2-פוטון מוצג באיור1.

1. הכנת החיה הדמיה

  1. הצב גזה סטרילית, ספוגיות כותנה וכלים כירורגיים בלוק באזור הניתוח (טבלה 1). הפעל מעקר חרוז מיקרו עבור intersurgery של כלי ניתוח עיקור.
  2. עזים ומתנגד העכבר (זכר או נקבה, 1.5-2.5 חודשים, 20 – 25 גר') בזריקה בקרום הבטן (i.p.) של תערובת של קטאמין (17.2 mg/mL), חריגות השירותים הווטרינריים (0.475 mg/mL), איזופרומאזין (0.238 mg/mL) (משקל הגוף µL/g 6). המתן עד עומק ההרדמה המתאים הוא הגיע כאשר החיה מפסיקה להגיב לגירוי קמצוץ הבוהן ויש לו אין רפלקס המצמוץ. במהלך הניתוח, לתת מנה האצה של 1/3 המינון המקורי של ההרדמה קוקטייל ככל הדרוש לשמירה על מצב הרדמה המקורי.
  3. להזריק הבופרנורפין subcutaneously (ספורטינג; 0.05-0.10 mg/kg) כסוכן להרגעה לפני הניתוח. להחיל משחה מגן על העיניים של החיה כדי למנוע היווצרות קטרקט וייבוש הקרנית.
  4. במקום עכבר GCaMP6s על כרית החימום כדי למנוע היפותרמיה, לכסות את זה תלוי כירורגי סטרילי. ייצוב הראש של החיה עם מתאם מחזיק את הראש על עכברים.
  5. לגלח את הראש על רוב הקרקפת עם סכין גילוח כפול-קצה. לנקות את האזור הכירורגי עם כרית הכנה סטרילית אלכוהול ואחריו פתרון povidone יוד.

2. כרוני חלון הגולגולת הכנה

  1. לעשות חתך מלבני של הקרקפת (2 מ מ x 3 מ"מ) עם זוג מספריים על צד אחד (ימין) של הגולגולת. לדחוף את העור הצידה עם ספוגית כותנה כדי ליצור שטח החשיפה של > 3 מ מ קוטר (איור 3 א). להסיר את רקמת החיבור המחובר לגולגולת על ידי גירוד בעדינות את הגולגולת עם להב המיקרוכירורגית בוטה (אזמל להב #10; איור 3C).
  2. לסמן את האזור S1 על-ידי בעדינות ציור מעגל (3 מ מ קוטר, מרכז תיאום:-1.5 מ מ מ של bregma ו- 2.5 מ מ האמצע) על הגולגולת באמצעות שתלים לקדוח (איור 2B).
  3. בצע את ההליך אותו על הגולגולת השמאלי (איור 2B).
  4. למרוח שכבה דקה של דבק מגע סופר גלו עד העצם כדי לספק בסיס ליישום מלט שיניים.
  5. תחת מיקרוסקופ ויבתר, רזה למטה חריץ מעגלי בתוך הגולגולת באזור S1 באמצעות microdrill במהירות גבוהה (דמות תלת-ממד). המטרה היא ליצור קצה חלק עבור מיקום של חלון אופטי אליו.
  6. שוב ושוב להחיל נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד, בטמפרטורת החדר) על הגולגולת מעת לעת במהלך תהליך דליל כדי להקל על קידוח, מפזרים את החום. לבצע את קידוח לסירוגין כדי למנוע חיכוך-induced התחממות יתר. גרועים ההריסות עצם קו ואקום הבית או של משאבת ואקום.
  7. לאחר כ- 2/3 עומק של העצם הוא קדח, לאט ובזהירות דק העצם 1/3 הנותר עד חתיכה מעגלית של הגולגולת (מכסה העצם) היא חופשית לחלוטין של הגולגולת שמסביב.
  8. לאט ובזהירות להסיר את מכסה העצם מעגלית עם זוג מלקחיים # 5/45 ולחשוף את השכבה הקשה של המוח (איור 2C; איור 3E).
  9. לשמור את אזור המוח החשוף לחות עם כלנית חדד (איור 3E). למנוע נזק לכלי pial, מאז דימום לשנות את זרימת הדם במוח, להאיץ נפיחות במוח, ולבזות קשות איכות הדמיה.
  10. בצע את ההליך אותו בצד שמאל (contralateral) של הגולגולת.
  11. להרכבת החלון אופטי, השתמש דבק אופטי דבק ולריפוי בין שכבות coverglass אחד בכל פעם. במידת הצורך, לחמם את החלון אופטי (50 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות) בתוך אינקובטור כדי לשפר את מליטה דבק. החלון אופטי מכיל 2 חלקים: החלק העליון מכיל כוסית אחת מכסה עגול בקוטר של 5 מ מ, החלק התחתון מכיל 3-1 הכיסוי משקפיים עגולים בקוטר של 3 מ מ (איור דו-ממדי).
  12. לאחסן את החלון אופטי אתנול (70%, כרך/כרך), לשטוף אותו עם סליין סטרילי לפני השימוש. לפני התקנת חלון אופטי, לבדוק את החלון אופטי של פגמים, כולל כמות יישור דבק או לא מדויקים אופטי תחת סטריאוסקופ שגוי.
  13. התקנת חלון אופטי השתלטה על האזור גולגולת (איור דו-ממדי). בחלק העליון של החלון אופטי נשענת על הגולגולת, בחלק התחתון של החלון אופטי מתאים במסגרת פתיחת craniotomized, נשענת על השכבה הקשה של המוח בנוכחות נוזל מוחי-שדרתי (איור דו-ממדי, E).
  14. חותם בחלק העליון של חלון אופטי הקצה בגולגולת עם דבק סופר Cyanoacrylate (איור 2F; איור 3F).
  15. כאשר Cyanoacrylate סופר הדבק התייבש, להחיל מלט שחור שיניים (Dentsply) לכיסוי הקצוות זכוכית. להחיל מלט שיניים כל חשופות בגולגולת, פצע שוליים כדי לחסום את האור (איור 2G-H; איור 3B).
  16. בצע את ההליך אותו בצד שמאל.
  17. לאפשר את החיה לשחזר על כרית חימום ולחזור החיה בכלוב בבית עבור שחזור תחת פיקוח הולם. לספק מזון רטוב כדי להקל על לעיסה, לחות. כדי להפחית את הכאב, לנהל הבופרנורפין ספורטינג (0.05 – 2.0 מ ג/ק ג) כל postinjury 8 – 12 h 2 ימים. לאפשר את העכבר כדי להתאושש במשך 7-10 ימים נוספים לפני הדמיה.

3. שני הפוטונים הדמיה

  1. ביום של הניסוי, עזים ומתנגד החיה עם קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (מינונים ותחזוקה של הרדמה כמתואר לעיל). לנקות את החלון הגולגולת עם 75% (vol/כרך) אתנול.
  2. הנח את העכבר תחת הגדרת הדמיה של מיקרוסקופ 2, P, את הראש מחזיק מתאם, מונח על כרית החימום עם ראשו דרך האוזן ברים מחובר בעל ראש עכבר. מרותק למיטה.
  3. תמונה בצד אחד של חלון אופטי בכל פעם. כדי למזער שיבושים אופטי, ודא חלון אופטי ואת הגולגולת נכון הם בכיוון מאונך לציר האופטי של המיקרוסקופ.
  4. לקחת תמונה ראשונית של החלון הגולגולת עם תאורה שדה בהיר בהגדלה x 4 כמפה אסמכתא לרישום הגדלה גבוהה פי 2 angiographies (4A איור1).
  5. להגדיל תחום העניין באמצעות הגדלה x 10 (4A איור2).
  6. בחר אזור מעניין באזור S1 בשכבות קורטיקלית I או II (עד 150 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial). אם רצוי הגדלה גבוהה יותר, השתמש מטרה X 20.
  7. חפש מבט שדה עם נוירונים מרובים. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ P 2 (איור 4B). לקבוע את זמן החשיפה, עירור ברמת האור (≈910 ננומטר) בהסתמך על העומק ואת רמת הביטוי של GCaMP6s, עם אותות חלשים יותר הדורשים פעמים חשיפה ארוך יותר, אולי תבין פחות זמן רזולוציה. אנחנו בדרך כלל משתמשים ~ 4 µs לכל פיקסל פעמים חשיפה. לרכוש תמונות במחירים מסגרת של 3-5 הרץ ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים.
  8. להתחיל להקליט את הסדרה זמן. לאחסן נקודות הציון של כל איזור עניין (ROI) ביחס התבנית וסקולרית או לנקודות fiducial בתמונות הגדלה נמוכה. תמונת רועי אותו לאורך זמן. בצע את ההליך אותו להתבונן סידן הדינמיקה של האזור S1 באונה השמאלית. לחשב את השינויים בזריחה של כל רואי.
  9. לרכוש תמונות בנפרד או כסרט בצילום מואץ (4C איור1-C3, D, E).
  10. המחקר קורטיקלית דם זרימה dynamics ויוו על ידי הדמיה צבעי פלורסנט לתוספי מוזרק לתוך וריד הזנב מכרסמים עם מיקרוסקופ 2, P. להשתמש vasculatures כמו ציוני מזהה, תמונה רועי אותו ב הדמיה הפעלות לאורך תקופות ארוכות.

4. עיבוד נתונים

  1. השתמש ImageJ ולמקור לניתוח תמונה. ייבוא רצפי תמונות עם ImageJ (איור 5A-B). עבור תמונות בודדות (או t-סדרת סרטים), בחר רועי בתוך של נוירון הדמיה ו- 2 נפרדים בקרבת אזורים עבור רקע מדידות (איור 5C). לרכוש עוצמה הכולל עם מנהל רועי (איור 5C).
    הערה: איור 6 מציג תמונות נציג סידן. סידן ארעי (ירוק), כלי דם (אדום) מראים בנקודות זמן שונות תוך שניות (איור 6A-D) עכבר-7 d לאחר ההתקנה החלון הראשוני. Z-הקרנת פרק 3 דקות הקלטה עבור הערוצים אדום וירוק (איור 6E) או הערוץ הירוק (איור 6F) מוצג גם. Z-תחזית מציג תמונה דחוסה של כל התמונות בסרט שממנו גבול מחוספס ועיגול (המקיף נוירון אובייקט של עניין כל המסגרות) נבחרה באופן ידני כמו גם הבחירה של עצמאי בסביבה הרקע אזורים ( 2 איור 6G).
  2. מתוך כל רועי, לחשב ברקע פלורסצנטיות הממוצע פנסיון מלא, FB = (FB1 + FB2) / 2 ועם השינויים זריחה סומא (נ) המבוטא ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / פנסיון מלא.
  3. לבצע את הניתוח שיא שלב אחר שלב באמצעות הפונקציות של ImageJ כולל תיקון בסיסי, שיא ממצא/נחישות, שיא אינטגרציה, שיא הולם, ו/או Time-Saving שיא ניתוח תכונות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בחלון אופטי דו צדדיים, השגנו תוצאות מ- 2 ניסויים נפרדים. הניסוי הראשון מועסקים עכברים לבטא EGFP התמונה varicosities דנדריטים. איור 4C 1-3 מציג דוגמאות של תמונות שנלכדו בנקודות זמן שונות לאחר ההשתלה חלון אופטי. שימו לב כי מספר ומיקום של ענפים דנדריטים, קוצים יציב בין התצוגות 2 (איור 4D, E, z-הקרנה).

הניסוי השני מועסקים Thy1 -GCaMP6s העכברים הטרנסגניים כדי למדוד את הסידן תאיים ארעי, ובכך הממחישות כיצד ניתן למדוד פיזיולוגיה של סידן בתוך יישום נוירון בודד ויוו (איור 6). טכניקה זו יכול לשמש כדי להקליט ולכמת פעילות ספונטנית באוכלוסיות של שכבה V כפירמידה נוירונים הממוקמת עמוק כמו > 500 מיקרומטר מתחת פיה. ניתן לחשב ממוצע תגובות ספונטנית לאורך זמן (מחושבת התגובות הממוצע בכל נקודה בזמן) על פני ניסויים רבים. הטכניקה P 2 יש את היתרון של זיהוי פעילות בו זמנית באוכלוסיות עצביים גדולים או מפוזרת על פני תקופה ארוכה עם הפרעה מכני קטן במוח לעומת הקלטות multielectrode.

כדי להפיק מדידה ממוצע מקובל, 5 – 10 ניסויים מומלצים. מספר הנסיונות יהיה התלויים תגובות ספונטנית או השתנות הטבועה של התגובות גירוי מסוים. אם כל השלבים עוקבים בקפדנות, כמתואר לעיל, חוקר מיומן בטכניקה הן חלון הגולגולת מדולל-הגולגולת, ויוו P 2 סידן הדמיה אמור להיות מסוגל להשיג הקלטות של 100-200 נוירונים משני הצדדים של חיות 1-2 ליום.

לאחר הניתוח של שיא, ניתן להשיג אוסף של תוצאות כגון המיקום האמיתי של הפסגה, את משרעת אמיתי, האזור לכל רוחב חצי מקסימום (FWHM) עבור כל שיא.

figure-results-1
איור 1 : איור סכמטי של הרכיבים של הגולגולת חלון אופטי לדימות (2p) 2-פוטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2 : ציור סכמטי מציגה את השלבים החשובים עבור הכנת חלון הגולגולת. (א) תחת מיקרוסקופ ויבתר, מסירים את העור מעל האזור כירורגי בעזרת זוג מספריים כירורגיים. שימוש (B) microdrill במהירות גבוהה כדי לייצר חריץ מעגלי (3 מ מ קוטר) על הגולגולת מעל האזור S1 עד העצם דש בתוך החריץ הופך להיות מנותקת העצם מסביב. (ג) הסר את מכסה העצם כדי לחשוף את דורא המשמש כבסיס. (ד) להרכיב החלון אופטי עם coverglasses עם 2 קטרים שונים. Coverglass העליון קוטרו גדול יותר (5 מ מ) ויש coverglasses התחתון (בדרך כלל 1-3) קוטר קטן יותר (3 מ"מ). עובי coverglasses להיות מותקן יהיה תלוי בעובי של הגולגולת. (E) במקום coverglass על גבי הפתח מעגלית של הגולגולת כדי ליצור חלון אופטי. בחלק התחתון של coverglasses צריכה שיתאים פתיחת הגולגולת. בתחתית coverglasses בעדינות לפנות השכבה הקשה של המוח. (F) חותם החלון בקצוות בגולגולת עם דבק מגע, דבק. (G) כאשר cyanoacrylate מתייבש, חלות מלט שחור שיניים לרוחב הקיר דבק. (H) למלא את החלון הגולגולת ddH2O ולהשתמש טבילה במי מטרות עבור הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3 . הבריאה של windows הדו-צדדיים על הגולגולת. (א) A בצילום מראה 2 הגולגולת אופטי חלונות משני צידי הגולגולת המכסים את האזור S1. (B) בהגדלה של האזור מסגרת של תמונה (א) מציג דו צדדיים windows אופטי חושפת את כבסיס דורא וכלי הדם. סרגל קנה מידה = 680 מיקרומטר. (ג) הגולגולת חשוף. (ד) יצירת חריץ מעגלי שבו נתפסת דש העצם המרכזית. סרגל קנה מידה = 900 מיקרומטר. (E) לאחר הסרת מכסה העצם, פתיחת הגולגולת היה מלא נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד). סרגל קנה מידה = 720 מיקרומטר. (F) התקנה של החלון אופטי מעל הפתח הגולגולת, איטום סף החלון עם דבק סופר. דורא וכלי הדם גלויים דרך החלון אופטי. סרגל קנה מידה = 600 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4 : סידן והדמיה דנדריטים. (A1) לזהות אזורים של עניין באמצעות כלי הדם (BV) כמו ציוני דרך ב- Thy1-GCaMP6s עכברים. (A2) זהה לאותם התאים עם תוויות (חצים אדומים) לאורך זמן באמצעות ציוני דרך באותה רשומה. (B) נציג Z-הקרנה של סידן אותות בנוירונים (חצים אדומים) של קליפת המגע הראשי (S1). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C1-3) ויזואליזציה של דנדריטים (ירוק), כלי דם (אדום) ב- B6. Cg-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J בעומקים שונים בשכבה II של האזור S1 ב- 1 יום לאחר התקנת חלון אופטי. (ד) Z-הקרנת תמונות מרובות-באותו האזור ב- 1 יום. (E) Z-הקרנת תמונות מרובות-באותו האזור-7 ימים לאחר ההתקנה חלון אופטי. הערה את יציבות יוצאת דופן של המספר והמיקום של קוצים למבוגרים וסניפים דנדריטים בין 1 יום 7 ימים לאחר התקנת חלון אופטי. סרגל קנה מידה = C-E 5 מיקרומטר (ג-ה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.figure-results-5
איור 5 : סידן אות המעקב. (A, B) דוגמאות של סרטים מסדרת t מיובאים עם ImageJ עבור ניתוח נתונים של נוירונים 2 (נוירון 1 ונוירון 2, בהתאמה). (ג) א גיליון אלקטרוני מציג את הנתונים על עוצמת תאורה מאזור עניין (רועי; בתוך הנוירון ו- 2 נפרדים בקרבת אזורים כמו רקע אמצעי). (ד) חישוב השיא: ΔF/F = (F-FB) / פנסיון מלא, FB = (FB1 + FB2) / 2 (על רקע זריחה הממוצע [FB], ואת השינויים זריחה של סומא [F] המבוטא ΔF/F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6
איור 6 . סידן נציג תמונות. (א-ד) סידן ארעי (ירוק) וכלי הדם (אדום) בנקודות זמן שונות בתוך שניות בעכבר 7 ימים לאחר ההתקנה חלון אופטי. חץ צהוב: נוירון יחסית פחות פעילים. חץ לבן: spiking נוירון. (E, F) Z-ההקרנה של תקופת ההקלטה 3 דקות עבור אדום (כלי הדם), ירוק (סידן) ערוצים (E) ו הערוץ הירוק בלבד (F). (G) נבחר נוירונים ואזורים סמוכים הרקע שלהם מסומנים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני הפוטונים הדמיה מאפשר המדד בו זמנית של הפעילות של תאים רבים ברזולוציה סביר-עד כ 800 מיקרומטר מתחת לפני השטח המוח. אנו משולב 2P וטכניקה חלון אופטי כפול עם GCaMP6s גנטית מקודד להתבונן סידן הדינמיקה של אוכלוסיות של שכבה V somata עצביים ממוקם > 500 מיקרומטר מתחת פיה. עם חלון פתוח אופטי בכל צד של הגולגולת, השיטה מאפשרת הקלטות של פעילות עצבית על פני אזורים במוח יונקים סימטרי עבור סידן ממושך ויציב הדמיה vivo בתוך. היבטים מרכזיים של שיטה זו כוללים את הביצועים של כירורגיה זעיר פולשנית כדי ליצור חלונות אופטי כפול הגולגולת פתוחה P 2 הדמיה של פעילות. עצבית באזורים S1 סימטרית.

בחינת הפעילות ברשת באזורים S1 הדו-צדדיים הוא שדוגמה של windows הגולגולת כפול איך יכול לשמש כדי לחקור ומידע מקומי סימטרי, עיבוד המוח למבוגרים vivo בתוך. שיטה זו גם יכול לשמש כדי לחקור את פעילות. עצבית (למשל שימוש בעכברים GCaMP6s Thy1 -) ואת הפלסטיות קורטיקלית B6. Cg-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J מרקמות שלם של האזורים סימטרי המתאימים בהתאוששות לאחר deafferentation עקב פציעה CNS חד צדדית. השיטה יכולה לשמש גם כדי לבחון פעילות קורטיקלית בתגובה לגירוי היקפיים אסטרטגיות כגון optogenetic, stimulations כימי או חשמלי. למרות שאנחנו רק להדגים את הטכניקה באזור S1, גישה זו יכולה להיות מועסק לחקור פעילויות בתחומים אחרים סימטרי במוח החי כגון הנוירונים שכבה V של קליפת מנוע ראשי (M1). תצפיות על ארגון מחדש של אזורים במוח עשויים לספק מצע עצבית להתנהגות המוטורית אדפטיבית, אשר ממלא תפקיד קריטי בשיקום postinjury של פונקציה. היא גם מאפשרת מדידה כרונית של פעילות סימטרית של תאים גנטית מזוהה במהלך התנהגות בעכברים הראש-קבוע.

טכנית, חוקרים כדאי לשים לב זהירה איכות ועקביות של windows הגולגולת כפול. חלון הגולגולת מדולל-הגולגולת טכניקה 12 מומלץ מאוד למתחילים להתאמן. קוצים הם תאים סידן בגלל מנגנוני זרימה, שחול המקומי ומורפולוגיה שלהם. במחקר זה, השתמשנו B6. Cg-Tg (Thy1- YFP) עכברים HJrs/J כדוגמה להפגין דנדריטים בעמוד השדרה dynamics ויוו (איור 4). התקנת חלון זכוכית פתוח-הגולגולת עלולה לגרום תחלופה גבוהה עמוד השדרה ותגובות גליה תגובתי אחרי ניתוח 12. לעומת זאת, עם טכניקה מדולל-הגולגולת חלון, קוצים, דנדריטים יכולים טוב להישמר.

הבחירות של מידות עוביים של windows אופטי יהיו תלויים בתחום התצוגה הרצוי, את העקמומיות הגולגולת, עובי הגולגולת, הסוג של הדמיה 13. לחץ לא מספיק coverglasses אופטי על השכבה הקשה של המוח עלול לגרום עיבוי של דורה, לצמיחה מחודשת של הגולגולת, והגדילה את המוח תנועה. לעומת זאת, לחץ מופרז של coverglasses אופטי עשוי לעכב זרימת דם בקליפת המוח.

להרכבה חלון אופטי, דבק ולרפא שכבות נוספות של coverglasses אחד בכל פעם עם דבק אופטי, אור UV ארוך באורך הגל. עזרה לחיזוק לקשר דבק, לחמם את החלון המפוברקת (50 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות) בתוך אינקובטור. לאחסן את coverglass חלון אופטי ב- 70% (vol/כרך) אתנול, לפני הניתוח, לשטוף אותו עם סליין סטרילי. החלון אופטי צריך להיבדק על פגמים (כגון סכום שגוי של יישור דבק או לא מדויקים אופטי) תחת סטריאוסקופ לפני השימוש כדי למנוע כשל. אם הדבק אופטי דק מדי, מקומות האוויר עשוי להיות מקומט, אשר יכול לגרום שיבושים אופטי או כיסוי זכוכית בחבורה השרשה. לעומת זאת, דבק אופטי מדי יכול לגרום גלישה מעבר לקצוות של החלון הגולגולת.

לסיכום, כאן אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת dynamics סידן או הדנדריטים מורפולוגיה מבעד לחלונות הגולגולת 2 סימטרי העיקרי המגע קורטיקלית אזורים ב- Thy1-GCaMP6s ו- Thy1- YFP העכברים הטרנסגניים, בהתאמה, באמצעות מיקרוסקופ 2, P. טכניקה זו עשויה להקל מאוד לנתח את היחסים המורכבים מבניים ופונקציונליים של רשתות עצביות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לעורכים יש דבר לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מאוד גן Wenbiao (המכון ע ש סקירבל, במחלקה לפיזיולוגיה, מדעי המוח, ניו יורק אוניברסיטת בית הספר לרפואה, ארצות הברית) עבור הדרכה טכנית מצוינת, פאטי Raley, עורך רפואי (המחלקה לכירורגיה נוירולוגיות, אינדיאנה אוניברסיטת בית הספר לרפואה), לצורך עריכת כתב היד. אנו מודים ד ר צ'ן Jinhui (מכון מחקר מדעי המח סטארק, לרפואה אוניברסיטת אינדיאנה, ארה ב) למתן B6. עכברים HJrs/J cg-Tg (Thy1- YFP). עבודה זו נתמך בחלקה על ידי היסוד של מנהל בית החולים הכללי של ג'ינאן צבאי באזור של Chines PLA 2016ZD03 (XJL), ו- NIH NS059622, NS073636, משרד ההגנה CDMRP W81XWH-12-1-0562, BX002356 I01 של פרס סקירה ההצטיינות מן המחלקה המנוסות של ארה ב . ענייני, קרייג H Neilsen קרן 296749, חוט השדרה אינדיאנה, קרן מחקר של פגיעה במוח, מרי Hulman ג'ורג הקרן כספים (XMX)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/JJackson24275יכול להיות כל זנים שנוצרו על ידי האינדיקטור והאפקטור העצבי המקודד גנטית המבטא את מחוון הסידן הפלואורסצנטי הירוק, GCaMP, בתת-קבוצות של נוירונים מעוררים בקליפת המוח.
ב6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.ג'קסון7919יכול להיות כל זנים המבטאים EGFP בתת-קבוצות של נוירונים בתוך אוכלוסיות ספציפיות בקליפת המוח; מספק כתם בהיר וחיוני דמוי גולגי.
מלקחיים של Dumont מס' 5, סטנדרטיים, DumoxelFine Science Tools11251-30יכול להיות כל מותג לבחירה.
דומונט מס' 5SF מלקחייםFine Science Tools11252-00יכול להיות כל מותג לבחירה.
מעקר מיקרו חרוזיםSouthern LabwareB1201יכול להיות כל מותג לבחירה.
Harishige' s SG-4N מתאם אחזקת ראש TritechResearchSG-4Nיכול להיות כל מותג לבחירה.
ערכת מיקרו-מקדחה אידיאליתמכשיר הרווארד72-6065יכול להיות כל מותג לבחירה.
קוצים לכלימדע עדינים19007-05יכול להיות כל מותג לבחירה.
זכוכית כיסוי עגולה, 3 מ"מHarvard BiosciencesW4 64-0720יכול להיות כל מותג לבחירה.
זכוכית כיסוי עגולה, 5 מ"מHarvard BiosciencesW4 64-0700יכול להיות כל מותג לבחירה.
דבק אופטי של נורלנדמוצרי נורלנד7106יכול להיות כל מותג לבחירה.
דבק סופר נוזלי LoctiteWB MasonLOC1647358יכול להיות כל מותג לבחירה.
ערכת מלט אחיזה, אבקה וממסDentsply675570יכול להיות כל מותג לבחירה. מערבבים 5 חלקים של אבקת צמנט דנטלי לבנה (Grip Cement) עם חלק אחד של צבע אבקת טמפרה שחור (כדי להגן מפני אור; חלק מהמשתמשים מעדיפים יחס של 10:1).
קצף ג'לMoore Medical2928יכול להיות כל מותג לבחירה.
מספריים לניתוח מיקרוRobozRS-5841יכול להיות כל מותג לבחירה.
נוזל מוחי מלאכותי (ASF)-ה-ACSF מכיל 125 מ"מ NaCl, 4.5 מ"מ KCl, 26 מ"מ NaHCO<תת>3, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 ו-20 מ"מ גלוקוז. מבעבעים את ה-ACSF בחמצן (95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני) ומכוונים את ה-pH ל-7.4. הכן תמיסת ACSF טרייה לפני כל ניסוי.
של Micro Drill

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
  2. Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. Functional specialization of mouse higher visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).
  3. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).
  4. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  5. Katona, G., et al. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
  6. Zhang, K., et al. Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice. PLoS One. 10 (7), e0132077(2015).
  7. Keck, T., et al. Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo. Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).
  8. Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
  9. Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
  10. Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism. Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
  11. Wachowiak, M., et al. Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb. J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).
  12. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  13. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Thy1 GCaMP6s MiceTwo Photon MicroscopyBilateral Cranial WindowsCalcium ImagingPrimary Somatosensory CortexNeural Activity RecordingOptical Window ImplantationIn Vivo ImagingDendritic Spine AnalysisFluorescence Quantification

מאמרים קשורים