הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

17.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56313

⸱

13 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

במאמר זה

סיכום

וזמינותו של כרומטין נגיש Transposase בשילוב עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה הגנום כולו לחשוף כרומטין נגיש. זהו פרוטוקול האטא ק-seq צעד אחר צעד, ממולקולרית לניתוח הסופי חישובית, אופטימיזציה עבור האדם לימפוציטים (Th1/Th2). פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם בשיטות הדור הבא רצפי.

תקציר

וזמינותו של כרומטין Transposase נגיש עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה לצורך זיהוי פתוח מחוזות כרומטין (נגיש). אזורים אלה מייצגים רגולטוריות DNA אלמנטים (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, לוקוס שליטה אזורים, insulators) שעתוק אילו גורמים איגוד. מיפוי הנוף כרומטין נגיש היא גישה רב-עוצמה לרכיבים שיגורי רגולציה פעילה ברחבי הגנום. מידע זה משמש גישה לא משוחדת על גילוי הרשת של גורמי שעתוק הרלוונטיים ומנגנונים של הכרומטין המפקחים על תוכניות ביטוי גנים. האטא ק-seq היא חלופה חזקה ורגיש DNase אני ניתוח רגישות יתר בשילוב עם הדור הבא רצפי (DNase-seq) ובידוד פורמלדהיד בסיוע של אלמנטים רגולטוריות (שלהם-seq) לניתוח ברמת הגנום של כרומטין נגישות וכדי הרצף של נוקלאז רגיש micrococcal אתרים (MNase-seq) כדי לקבוע את מיקום נוקלאוזום. אנו מציגים פרוטוקול האטא ק-seq מפורט ממוטב עבור החיסון האנושית ראשי תאי CD4 + כלומר לימפוציטים (T helper 1 (Th1) ותאים Th2). פרוטוקול מקיף זה מתחיל עם תא הקציר, מתאר את ההליך מולקולרית של כרומטין tagmentation, הכנת הדוגמא עבור הדור הבא רצפי, ואז כולל גם שיקולים הבדיקות חישובית נהגה ושיטות לפרש את התוצאות. יתר על כן, כדי לחסוך זמן וכסף, הצגנו את אמצעי בקרה כדי להעריך את ספריית האטא ק-seq לפני רצף. חשוב, העקרונות שהוצגו פרוטוקול זה מאפשר שלה ההסתגלות אחרים תאים ראשי אנושיים של המערכת החיסונית, הלא-החיסון, שורות תאים. קווים מנחים אלה גם יהיה שימושי עבור מעבדות אשר אינם בקיאים בשיטות הדור הבא רצפי.

מבוא

האטא ק-seq1,2 היא שיטה חזקה המאפשרת זיהוי של אזורים פתוחים כרומטין רגולטוריות3 והמיקום נוקלאוזום. מידע זה מוחל על אומדן משוער, זהות, והמיקום פעילותם של גורמי שעתוק. רגישות השיטה למדידת כמותיים בווריאציות הכרומטין מאפשר חקר הפעילות של כרומטין גורמים, כולל כרומטין remodelers מגבילים, כמו גם את הפעילות תעתיק של RNA פולימראז II1. ובכך האטא ק-seq מספק גישה רציונלית ובלתי עוצמה בפענוח מנגנוני המפקחים על תעתיק רגולציה בכל סוג התא של ריבית. אנו מתארים את העיבוד של האטא ק-seq תאי Th1 ו Th2 אדם ראשי.

ב האטא ק-seq, transposase Tn5 היפראקטיבי עמוסה מתאמים עבור הדור הבא רצפי (הגדרות) זוגות DNA פיצול עם תיוג של ה-DNA עם מתאמים (כלומר, תהליך "tagmentation")1. בעקבות ה-PCR-הגברה, ספריות DNA שנוצר מוכנים עבור הדור הבא רצפי (איור 1). Tagmentation מועדף של כרומטין נגיש הוא זוהה על ידי הניתוח של העשרה המקומיים הקריאות רצף האטא ק-seq.

ניתוח ניסיוני קצר ואת הדרישה פחות חומר המוצא, ביחס שיטות אחרות למדידת כרומטין נגישות ומיקום nucleosomal כגון DNase-seq4, שלהם-seq5MNase-seq6, יש קידם את השימוש האטא ק-seq במערכות ביולוגיות מרובות, כולל תאים אנושיים ראשי1,7 דוגמאות קליניות8, וכן אורגניזמים חד־תאיות9, צמחים10, זבובי פירות11 , יונקים שונים12.

זהותו של שעתוק ניתן חשפו גורמים שמאוגדים לוקוסים נגיש על ידי ניתוח את העשרת של מוטיבים רצף שלהם מחייב או שילוב האטא ק-seq עם כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ואחריו (רצפי DNA תפוקה גבוהה ChIP-seq). גישה זו איפשרה זיהוי גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין חשוב hematopoiesis העכבר13. הטבע לא משוחד ואשר הכללית של האטא ק-seq מאפשר ללמוד הכונה אורגניזמים אשר ריאגנטים כגון נוגדנים לניתוח שבב אינם זמינים. לדוגמה, אבולוציונית וריאציות ב- cis-אזורים רגולטוריות זוהו על ידי לימוד הרכס העצבי הגולגולת תאים מן השימפנזים ובני14, וריאציות התפתחותית ברכיבי תקינה במהלך העכבר בתחילת מופרה15, שינויים בנוף תקינה במהלך מחזור החיים של חד־תאיות owzarzaki ג9, והתפתחות של היזמים, משפרי מעבר יונקים 20 מינים12.

האטא ק-seq היה גם אינסטרומנטלי למדידת כרומטין נגישות בתאים בודדים, ובכך לחשוף השתנות בתוך אוכלוסיות תאים, אשר בדרך כלל מתחמק מחקרים ברמת הגנום7,16. בנוסף, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים המתרחשים באזורים רגולטוריות DNA בתנאים מחלה, שבה מדגמים נדירים. לדוגמה, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים בנוף תקינה במהלך תחילת לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)17 או ראס-מונע oncogenesis11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על-ידי הועד המוסדי של אוניברסיטת בר אילן, הפרוטוקול מנחים שסופקו על-ידי הוועדה לאישור הניסויים.

1. טיהור של תמים CD4 + תאים אנושיים, קיטוב T Helper 1 (Th1) ותאים Th2

הערה: כאן אנו מתארים את ההליך מתחיל מתאי תאי דם היקפיים האנושי קפוא (PBMCs). הצעד הראשון מורכב בידוד תאי CD4 + באמצעות גרגרי, עמודות שבדרך כלל לתת לנו יותר מ 95% תאי CD4 +. עם זאת, שלב זה עשוי להשתנות לפי הפרוטוקול המועדף במעבדה כל. הפרוטוקול עבור הפעלת תא T, קיטוב שונה מן ג'נר. et al. (2009) 18. תאי בידוד של CD4 + מ- 10 מיליון PBMCs נותן לעלות 4-6 מיליון תאי CD4 +. הם לפצל שתי מבחנות, גדל תחת Th1 ו Th2 מקטב תנאים מניב תאי Th1 ו Th2 3-5 מיליון בתוך שבוע.

הערה: להתקרר לצנטריפוגה עד 4 ° C לפני שמתחילים.

  1. להפשיר 1 מ ל PBMCs האנושית (10 7 תאים) צינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו- 10% לא פעיל חום העובר שור סרום. צנטריפוגה ב 500 g x עבור 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend התאים עם פיפטה סטרילי 25 מ ב-15 מיליליטר שהושלם RPMI בינונית. להעביר את התאים (עם פיפטה סטרילי 25 מ ל) בקבוקון תרבות T75-
  2. להשאיר למשך הלילה בתאים חממה humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
  3. להעביר את התאים צפים עם פיפטה סטרילי 25 מ ל שפופרת 50 מ. לקבוע את המספר ואת הכדאיות מאת הדרה trypan blue.
  4. תאים לבודד CD4 + 10 מיליון חיים שאינם-מחסידי PBMCs לפי בחירה חיובי באמצעות CD4 + גרגרי ועמודות על פי היצרן ' s המלצות (ראה טבלה של חומרים/ציוד) עם הבאה שינויים: 10 7 PBMCs מסומנות עם 30 µL של גרגרי CD4 ב 120 µL של 0.5% BSA ב- PBS.
  5. להפעיל את התאים CD4 + T עבור 72 h על-ידי rhIL-2 (10 ng/mL), צלחת מכורך אנטי CD3 (5 µg/mL) ו- anti-CD28 מסיסים (2 µg/mL). קיטוב Th1, הוסיפו rhIL-12 (20 ng/mL), אנטי-IL-4 (10 µg/mL). קיטוב Th2, להוסיף rhIL-4 (40 ng/mL) ו- anti-IFN-γ (10 µg/mL).
  6. התרבות התאים נוספים 7 ימים בנוכחות rhIL-2 (10 ng/mL), ציטוקינים מהפכנית אותו (rhIL-12 ל- Th1 ו- rhIL-4 עבור Th2).

2. בידוד גרעינים

הערה: האטא ק-seq מבוצע עם גרעינים שלמים. פירוק מאגר המכילה 0.05% nonylphenyl פוליאתילן גליקול (ראה טבלה של חומרים/ציוד) היה מכויל לבידוד גרעינים של ראשי האנושי תאי Th1 ו- Th2. מומלץ לכייל את שלב זה עם ריאגנטים המעבדה, תאים. עודף של תאים שלמים דטרגנט לא מספיקות מקטין את יעילות התגובה טרנספוזיציה. יעילות פירוק התא נקבע לפי מספר גרעינים (תאים חיוביים trypan blue) ביחס למספר התאים.
הערה: הכנת המאגר פירוק (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl 2). להתקרר צנטריפוגה עם רוטור סווינג-דלי ל- 4 מעלות צלזיוס Pelleting התאים צנטריפוגה סווינג-דלי במקום צנטריפוגה זווית קבועה מפחית אובדן התא/גרעינים. כדי להימנע גרעינים או איבוד תאים, pipet בזהירות בעת השלכת את תגובת שיקוע.

  1. הוסף nonylphenyl טריים פוליאתילן גליקול (כדי ריכוז סופי של 0.05%) ו- 100 x מעכבי פרוטאז (כדי ריכוז סופי של 1 x) אל המאגר הקר פירוק מיד לפני השימוש. לשמור על המאגר על קרח
  2. תאי Count T כדי לקבוע את הסכום שלהם ואת הכדאיות בשיטת trypan blue. הכדאיות נמוכים יותר 90% תוצאות לעיכול שאינם ספציפיים גבוה יותר.
  3. העברת 0.5 x 10 6 T תאים (Th1 או Th2) 1.5 mL microtubes. ספין למטה ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  4. Resuspend בגדר תא ב- 1 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS). ספין למטה ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  5. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר פירוק קר (המכילה nonylphenyl פוליאתילן גליקול, מעכבי פרוטאז). שמור את הצינורית על קרח. פיפטה בעדינות כדי להימנע מהפרעה הגרעינים.
  6. לקחת את 10 µL ובמהירות לספור את התאים עם מונה הניתן תא אוטומטית אמנם microtube עם תאים lysed על הקרח. שלב זה לא יעלה על 5 דקות כדי למנוע נזק הגרעינים. לפחות 80% של התאים צריך להיות lysed.
  7. המשך מיד עם התגובה טרנספוזיציה. גרעינים מוכנים להמשיך קרח

3. טרנספוזיציה התגובה

הערה: בשלב זה, גרעינים בודדים מודגרת עם prokaryotic transposase Tn5 (TDE1) נטען עם מתאמי עבור רצף המיתרים. Tn5 אקטיבי בו זמנית קטעים דנ א, ligates מתאמי למחוזות נגיש של הגנום (תהליך tagmentation). היחס בין הגרעינים Tn5 transposase הוא קריטי עבור ביקוע חלבונים מועדף-כרומטין נגיש. פרוטוקול זה מכויל עבור גרעינים 100,000 באמצעי אחסון התגובה μL 100. עם זאת, ניתן לשנות את התגובה.

  1. להגדיר טמפרטורה ב שייקר תרמית כדי 37 מעלות צלזיוס.
  2. 100,000 העברת גרעין כדי microtube 1.5 מ ל.
  3. צנטריפוגה ב 500 x g למשך 10 דקות ב 4 ° C ובעדינות להסיר את תגובת שיקוע.
  4. להוסיף את רכיבי התגובה טרנספוזיציה הגרעינים כמו שצוין ב טבלה 1-
  5. Resuspend על ידי עדינה pipetting.
  6. דגירה התגובה טרנספוזיציה ב שייקר תרמי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם עדין רועדות (500 סל ד).
    הערה: ה-DNA ניקוי מתבצע על ידי מחרוזת הנייח הפיך מוצק-שלב 19 (ראה טבלה של חומרים/ציוד) או עמודות טיהור PCR. בסוף הניקוי, elute שברי DNA ב 20 µL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8. להימנע EDTA במאגר • תנאי.

4. PCR העשרה של ספריות האטא ק-seq

הערה: שלב זה נועד להגביר את האטא ק-seq ספריית קרי, דנ א שברי עם מתאמי שנוספו. כדי לאפשר ערבוב של מספר ספריות האטא ק-seq באותו הדור הבא רצפי הנתיב (" ריבוב ") שימוש מדד פריימר 1 (Ad1_noMx) 1 עבור כל הדגימות, ובעלות שונה אינדקס (לבר-קוד) 2 פריימר (Ad 2.1-2.24) 1 עבור כל דגימה. רצפי פריימר ניתנים שהושלם טבלה של חומרים/ציוד.

  1. הגברה PCR הראשונית
    הערה: הריכוז בעבודה של פריימר 1 (Ad1_noMx) ו- 2 פריימר הוא 25 מיקרומטר. כל תחל מדולל מן המניות המקוריים של מיקרומטר 100 מיקרומטר 25. בכל התגובות PCR, השתמש פריימר 1 (Ad1_noMx), רק אחד של 2 פריימר באינדקס.
    1. להוסיף את רכיבי התגובה PCR כמפורט בטבלה 2 צינור PCR סטרילי.
    2. המקום PCR צינור לתוך הצנטרפוגה תרמי ולבצע PCR הגברה באמצעות התנאים אופניים מפורט בטבלה 3.
  2. הערכה של מספר מחזורי הגברה נוספת
    הערה: מספר מחזורי PCR נוספים אמור להניב כמות מספקת של ספריית מקטעי f. או מוצלח הדור הבא רצפי לרוץ, כל עוד ממוזער כדי להימנע GC, גודל הסטייה 20... קביעת המספר של ה-PCR מחזורים (N) הדרושים עבור ספריית אופטימלית פרגמנט הגברה נעשית על ידי ה-PCR כמותי (qPCR).
    1. לדלל צבעי יסוד 1 (Ad1_noMx) ו-2 (משמש עבור ספריית הראשונית הגברה) מ מיקרומטר 25 מיקרומטר 6.25.
    2. להוסיף את רכיבי המבחנות אופטי או צלחת כאמור בטבלה 4.
    3. המקום כלי qPCR, מחזור כמו כמפורט בטבלה 5.
    4. כדי להעריך את המספר הנדרש של מחזורים נוספים הגברה (N), מגרש מחזור מספר על ציר ה-x ואת יחסי קרינה פלואורסצנטית (RFU) בציר ה-y.
    5. המספר של הגברה נוספת מחזורים (N) הוא 1/3 של מספר מחזורים שבהם התגובה qPCR להגיע אל הרמה. איור 2 מספק דוגמאות עבור שלוש ספריות האטא ק-seq שהגיעו plateau ב ~ 2,350 פלורסצנטיות היחסי של יחידות, RFU (בעובי הקו הירוק). מספר מחזורים PCR שבו מוגבר שליש מהסכום המקסימלי (783 RFU, המסומן על ציר ה-y) מקביל 8 מחזורים של הספריות (אדום וכחול הגברה עקומות) שני ומחזורי PCR 9 עבור הספריה השלישי (ורוד)-
  3. הגברה PCR הסופי
    1. להגביר את µL 45 הנותרים של תגובת ה-PCR. הצב צינור PCR המכיל הגברה תגובה של צעד 4.1.2 הצנטרפוגה תרמי. הפעל את התוכנית PCR שמתואר טבלה 6. השתמש במספר שנקבע בעבר (שלב 4.2.5) מחזורים הגברה (N).

5. גודל הבחירה של ספריות האטא ק-Seq

הערה: מניסיוננו, בחירת גודל של ספריות האטא ק-seq מוגבר משפר תוצאות הדור הבא רצפי מכיוון שהוא מבטל את שברי ספריית משקל מולקולרי גבוה ספריית האטא ק-seq הסופי.
הערה: לאפשר את החרוזים מגנטי לחמם לטמפרטורת החדר 30 דקות לפני השימוש.
להכין טרי אתנול 70% במים נטולי נוקלאז.

  1. Resuspend את החרוזים מגנטי על ידי ערבוב.
  2. להוסיף מים נטולי נוקלאז לספריות האטא ק-seq (מתקבל בשלב 4.3.1.) ולהביא עד 100 µL.
  3. µL להוסיף 50 (0.5 x) של resuspended DNA-איגוד beads מגנטי כדי 100 µL של ספריות מוגבר. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. דגירה בדגימות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. במידת הצורך, במהירות ספין למטה microtubes.
  4. במקום הצינור על דוכן העדים מגנטי המתאים למשך 2 דקות להפריד את החרוזים מגנטי תגובת שיקוע. לאחר 2 דקות, להעביר את תגובת שיקוע microtube חדש-
  5. למדוד הנפח של תגובת שיקוע על ידי pipetting ולהוסיף 0.7 x של beads מגנטי. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.
  6. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. המקום על דוכן מגנטי עבור 2 דק
  7. לאחר 2 דקות דגירה, למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 200 אתנול 70% µL טריות לשטוף את החרוזים אמנם הצינורות על הדוכן מגנטי.
  8. לשמור microtube על המגנט ב-30 s וביטול ואז האתנול. חזור על שלב 5.7.for מנקי אתנול הסופי שני.
  9. להסיר לחלוטין את הנותרים אתנול ולתת שהחרוזים מילה נהדרת עבור 5 דקות ברכבת התחתית נמצאת על המגנט. במידת הצורך, בקצרה לסובב את microtube. להסיר את עקבות אתנול עם טיפ פיפטה p10.
  10. להסיר את microtube של המגנט ולהוסיף µL 22 10 מ מ טריס-HCl, pH 8. לא elute את ספריות האטא ק-seq במאגר המכילה EDTA.
  11. דגירה הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מקם לדוכן מגנטי.
  12. כאשר הפתרון ברור, להעביר 20 µL של ספריות eluted microtube עקר חדש.
  13. חנות בגודל שנבחר האטא ק-seq ספריות ב-20 מעלות צלזיוס

6. ניתוח איכותי של ספריות האטא ק-Seq

  1. אימות של איכות האטא ק-seq ספריות באמצעות PCR בזמן אמת
    הערה: חשוב להעריך את האות לרעש יחס של ספריות האטא ק-seq לפני הדור הבא . רצף. פעולה זו מתבצעת על-ידי קביעת הכמות היחסית של שברי DNA לוקוסים נגיש בלתי נגיש באמצעות PCR כמותי (qPCR). רוח המקום לא נגיש (שליטה שלילי, chr1:48, 137, 860-48,137,934 ו- chr1:193, 093, 748-193,093,827) הם מוגבר על ידי זוגות פריימר 1 ו- 2. רוח המקום נגיש (שליטה חיובית, chr19:30, 336, 166-30,336,253 ו- chr19:11546154-11546237) הם מוגבר על ידי זוגות פריימר 3 ו- 4. לוקוסים חיוביים ושליליים הוגדרו מפרופילים נגישות (DHS-seq) כרומטין CD4 + תאים אנושיים (קידוד accessions ENCSR000EQE ו- ENCSR000EQG). פריימר שלילי 1 ממוקם אזור intergenic heterochromatic גדולים (kb 230 מ TRADB2, 88 kb של FOXD2). אזור בקרה שלילית 2 נמצא בתוך אינטרון הראשון של ג'ין CDC73. חיובי פריימר זוג 3 נמצא אזור פתוח כרומטין במורד הזרם של הגן Cyclin E (CCNE1) תוך פריימר חיובי זוג 4 ממורכזת בתוך האמרגן של חלבון קינאז C המצע 80K-H (PRKCSH). חשוב, לוקוסים שליטה אלה מראים דפוס דומה של נגישות בסוגי תאים אנושיים פרוייקט ' קידוד ' 3, רומז כי ניתן להחילם לפקח האטא ק-seq ספריות של קשת רחבה של סוגי תאים אנושיים. פריימר יעילות וספציפיות של כל זוגות פריימר אומתה על ידי qPCR לדילול טורי של דנ א גנומי (מתוך תאי Th אדם) וניתוח עקומת ההיתוך של מוצרים מוגבר שהושג.
    1. לבודד דנ א גנומי באמצעות זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים/ציוד).
    2. לדלל את האטא ק-seq מוגבר הספרייה 1:10 (ספריית µL 1 + 9 µL של מים נטולי נוקלאז) ו- DNA גנומי ל ~ 5 ng/µL.
    3. להכין תערובת התגובה (טבלה מס ' 7) עבור כל זוג פריימר בקרה חיובית ושלילית, לקחת בחשבון התגובות מבוצעות שהפקידים.
    4. Incubate ב qPCR הצנטרפוגה תרמי לפי הפרוטוקול המומלץ על ידי הספק מיקס מאסטר qPCR.
    5. לנתח את התוצאות ב- qPCR כלי ' s תוכנה (ראה טבלה של חומרים/ציוד). בחרו ' DNA גנומי דגימת הבקרה. הערכים שהושג מייצגים של העשרה של אזורים נגיש (מוגבר על ידי בקרה חיובית תחל). לדוגמה מוצג בטבלה 8.
      הערה: הערכה של גודל הספרייה הממוצע, ריכוז: התפלגות גודל שברי DNA האטא ק-seq מספריות של נקבעת על-ידי מערכות אלקטרופורזה אוטומטיות רגישות גבוהה על פי היצרן ' s הוראות. מומלץ למדוד את הדגימה התרכזות fluorometer באמצעות ערכת רגישות גבוהה dsDNA ו- µL לפחות 2 של כל דגימה של הדנ א.
      הערה: הדור הבא רצפי - לפני ריבוב של הספריות, לחשב את molarity של כל ספריה האטא ק-seq באמצעות הנוסחה: (ng/µL x 10 6) / (660 x ממוצע ספריית קטע אורך). . כווני > 30 מיליון קריאות של כל ספריה האטא ק-seq להעריך כרומטין פתוח אזורים של דגימות אנושי. אם ברצונך לקבוע אם הספרייה הוא מספיק טוב בשביל המיתרים רצף, בתחילה המטרה עבור קריאות ~ 10 מיליון (5% הסמטה רצפי DNA רצף כלי במצב ריצה מהירה). זכור כי להסיק נוקלאוזום מיצוב, לזווג-קצה הרצף הוא נדרש 1-

7. ניתוח של התוצאות שהושגו רצף הדור הבא

  1. יסיק האיכות של פעולות רצף הקריאה על-ידי בדיקה הקבצים FastQC, בנפרד עבור כל ספריית.
  2. יישר את הקריאות על הגנום האנושי הפניה (hg19 הרכבה) באמצעות עניבת הפרפר 21 תוכנה בסביבת Unix/Linux. הפקודה היא ' עניבת הפרפר -m 1 - q -S הגנום מדריך reads.fastq output_aligned.sam '. מדריך הגנום מייצג את התיקיה שבה מאוחסנות האינדקסים הגנום של עניבת הפרפר. פרמטר -m 1 היא עבור אינו מאפשר יישור הקריאות אל אחד או יותר לוקוס הגנום - q עבור קובץ הקלט צריך להיות בתבנית fastq, -S הוא לפלט בתבנית סאם.
  3. להסיר כפילויות קריאות באמצעות SAMtools 22 rmdup אפשרות בסביבת Unix/Linux. הפקודות הן ' samtools להציג output_aligned.sam -S -b | samtools למיין -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
    samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. הפקודה הראשונה, תצוגה, שינוי התבנית סאם בפורמט באם אשר לאחר מכן ממוינים. האפשרות של rmdup ואז חלה על הקובץ באם הממוין. באופן אופציונלי אחד ניתן להתאים את הקריאות עבור האתר הכניסה transposon, כפי שמתואר את הנייר המקורי האטא ק-seq 1. פעולה זו מתבצעת באמצעות BEDtools מצווה 23 בסביבת Unix/Linux. הפקודות הן ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i הגנום 4 - מ-5 - g -p _rmdup.bed output_aligned > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. הפקודה הראשונה, bamTobed, שינוי התבנית באם בפורמט מיטה אשר יכול לשמש עבור הפקודה shiftBed. הקובץ הגנום הוא קובץ מופרד כרטיסיה המכילה את האורך של כל כרומוזום הגנום. בדרך כלל להוסיף את הקובץ בספריה BEDtools.
    4. שיא
  4. לבצע חיוג באמצעות ניתוח המבוסס על מודל של שבב-seq (MACS2) 24 תוכנה בסביבת Unix/Linux על הקובץ מיטה שהוסטו עם הפרמטרים הבאים: - nomodel - extsize 75--משמרת-30. פרמטרים אלה משמשים כדי להתאים את הקריאות כך האתר ההכנסה transposon הוא באמצע כל קריאה רצף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאה הסופית של פרוטוקול זה הוא ספריה האטא ק-seq של בדרך כלל 3-20 ng/µL. מתי לרוץ על מערכת עבור ניתוח שלמות הדנ א (ראה טבלה של חומרים/ציוד), הם מציגים מראה כמו סולם2 (איור 3 א). הגודל הממוצע של קטעי DNA היא בדרך כלל bp ~ 450-530.

בקרת איכות נאותה של ספריות האטא ק-seq לפני שתבצע הדור הבא רצפי חשוב לחסוך זמן וכסף. אנו רואים את הספריות מתאים הדור הבא רצפי (הגדר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול האטא ק-seq המתוארים כאן כבר בהצלחה מועסקים לניתוח של כרומטין נגיש בתאים הראשי (Th1 אנושי, Th2 תאים, ותאי B) כמו גם שורות תאים בתרבית (תאי סרטן השד אנושי MCF10A ו- U261 גליובלסטומה תאים). החלת האטא ק-seq סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש קצת אופטימיזציה פרוטוקול, במיוחד בשלב פירוק. אם הריכוז של דטרגנט ללא יונית גבוהה מדי, אולי יש אחוז גבוה יותר של זיהום דנ א מיטוכונדריאלי. זה יכול להיות מופחת על ידי הפחתת ריכוז דטרגנט במאגר של פירוק מבלי להפחית את התשואה גרעינים. מניסיוננו, פירוק מאגר עם 0.05% של דטרגנט נתן תוצאות משב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (גרנט 748/14), מארי קירי אינטגרציה הענק (סיגריה) - האיחוד FP7-אנשים-20013-סיגריה-618763 ואני-ליבת התוכנית של תכנון, תקצוב הוועדה ושל קרן המדע ישראל להעניק מס 41/11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים


רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות 50 מ"לLumitronLUM-CFT011500-Pיכול להיות מספקים אחרים.
MicrotubesAxygen IncMCT-175-Cיכול להיות מספקים אחרים.
25 מ"ל פיפטות סרולוגיותקורנינג קוסטאר4489יכול להיות מספקים אחרים.
בקבוק תרבית רקמותLumitronLUM-TCF-012-250-Pיכול להיות מספקים אחרים.
Countes Automated Cell CounterInvitrogenC10227
NucleoSpin TissueMACHEREY-NAGEL740952.5
תאים חד-גרעיניים בדם היקפי ( PBMC)ATCC  PCS&s; 800 וביישן; 011יכול להיות מספקים אחרים.
RPMI 1640תעשיות ביולוגיות בינוניות01-103-1Aיכול להיות מספקים אחרים.
תמיסת L-גלוטמין (200 מ"מ)תעשיות ביולוגיות03-020-1Bיכול להיות מספקים אחרים.
פניצילין-סטרפטומיציןתעשיות ביולוגיות03-031-1Bיכול להיות מספקים אחרים.
סרום בקר עוברי (FBS),  מושבת בחום,תעשיות ביולוגיות04-127-1יכול להיות מספקים אחרים.
מיקרו-חרוזי MACS CD4, אנושיMiltenyi Biotec130-045-101
עמודות MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201
אנטי אנושי CD4 FITCBiogems06121-50
עכבר IgG1 בקרת איזוטיפ FITCBiogems44212-50
אנטי אנושי CD3 (OKT3)Tonbo biosciences40-0037
CD28 אנטי אנושי SAFIREPurified Biogems10311-25
רקומביננטי אנושי IL2Peprotech200-02
רקומביננטי אנושי IL4Peprotech200-04
רקומביננטי אנושי IL12 p70Peprotech200-12
In Vivo מוכן אנטי אנושי IL-4 (MP4-25D2)Tonbo40-7048
LEAF  IFN-וגמא מטוהרים אנטי-אנושיים;BioLegend506513
NaCl, קרלו ארבה בדרגה אנליטית479687יכול להיות מספקים אחרים.
מגנזיום כלוריד, הקסהידרט, ביולוגיה מולקולרית כיתהCalbiochem442611יכול להיות מספקים אחרים.
EDTAMP Biomedicals800682יכול להיות מספקים אחרים.
Tris, טהור במיוחד, 99.9%MP Biomedicals819620יכול להיות מספקים אחרים.
חלופה NP-40 (נונילפניל פוליאתילן גליקול)Calbiochem492016יכול להיות מספקים אחרים.
מעכבי פרוטאזSigmaP2714קוקטייל מעכב פרוטאז זה הוא אבקה. להכנת תמיסה של 100 x יש לדלל ב -1 מ"ל מים בדרגת ביולוגיה מולקולרית.
חרוזי אימוביליזציה הפוכה של פאזה מוצקה מגנטית: חרוזי AMPure XPשל בקמן63881
HyLabsEX-GP200יכול להיות מספקים אחרים.
ערכת הכנת ספריית ה-DNA של Nextera (טרנספוזאז TDE1 ומאגר TD)IlluminaFC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mixניו אינגלנד BioLabsM0541
NEBNext Q5 התחלה חמה HiFi PCR Master Mixניו אינגלנד BioLabsM0543
SYBR ירוק I InvitrogenS7585
  CFX Connect PCR בזמן אמת  זיהוי  מערכתBio-rad185-5200יכול להיות מספקים אחרים.
CFX Manager SoftwareBio-rad1845000
מאסטר מיקס עבור qPCR: iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad172-5124יכול להיות מספקים אחרים.
פלואורומטר קיוביט 2.0InvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS ערכת בדיקהInvitrogenQ32854
מגנט לצינורות אפנדורףInvitrogen12321Dיכול להיות מספקים אחרים.
צנטריפוגת קירור דלי נדנדה עם הדליים לצינורות בז של 15 מ"ל וצינורות אפנדורףThermo Scientific75004527יכול להיות מספקים אחרים. חשוב שיהיו לו דליים לצינורות אפנדורף.
תרמו-שייקרMRCיכול להיות מספקים אחרים.
רגישות גבוהה D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
רגישות גבוהה D1000 ריאגנטיםAgilent Technologies5067-5585
4200 מערכת TapeStationAgilent TechnologiesG2991AAפלטפורמה מבוססת קלטת עבור   אלקטרופורזה
ערכת DNA ברגישות גבוההAgilent Technologies5067-4626מגיב עבור ניתוח TapeStation ברגישות גבוהה
שם ורצף פריימרAd1_noMX חברה
: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 רצף-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.1_TAAGGCGA

TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.1_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.2_CGTACTAG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.2_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.3_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.4_TCCTGAGC
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.4_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.5_GGACTCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.5_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.6_TAGGCATG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.6_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.7_CTCTCTAC
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.7_expected רצף אינדקס נקרא: 5'-P7 רצף-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.8_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.9_GCTACGCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.9_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.10_CGAGGCTG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG
GCTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.10_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.11_AAGAGGCA
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.11_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.12_GTAGAGGA
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.12_expected רצף אינדקס נקרא: 5'-P7 רצף-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.13_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.14_ACCACTGT
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.14_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.15_TGGATCTG
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.15_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.16_CCGTTTGT
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.16_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'
  Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.17_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'
  Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		רצף אינדקס Ad2.18_expected קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.19_AGGTTGGG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		רצף אינדקס Ad2.19_expected נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'
  Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.20_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'
  Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.21_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.22_TGGTCACA
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.22_expected רצף אינדקס נקרא: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.23_TTGACCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.23_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'Ad2.24_CCACTCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.24_expected רצף אינדקס קריאה: רצף 5'-P7-[רצף אינדקס]-רצף טרנספוזאז-3'F1
: 5'-CCTTTTTTTTTTTGCCCATACACTC-3'IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT
בדרגה אירופאית טהור ערכת טיהור PCR : 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC

מקורות

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
  3. Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  4. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
  5. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  6. Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
  7. Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
  8. Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030(2016).
  9. Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
  10. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).
  11. Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
  12. Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
  13. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  14. Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  15. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
  16. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  17. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  18. Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
  19. DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18(2011).
  21. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  22. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  23. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  25. Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  26. He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
  27. Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
  28. Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
  29. Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284(2015).
  30. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TPeak CallingDNA
מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.