מאמר שיטה

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

DOI:

10.3791/56358

⸱

3 בדצמבר 2017

 , 
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GABAergic interneurons בקליפת המוח הם אוכלוסיה הטרוגנית של תאים לשחק תפקידים חיוניים המסדיר את הפלט של נוירונים כפירמידה סינאפסות, כמו גם סינכרון התוצרים של נוירון כפירמידה הרכבים. הגירעונות בתפקוד interneuron היו מעורבים במגוון מנוטלי הפרעות, כולל סכיזופרניה, אוטיזם, אפילפסיה. ההטיה של interneurons קורטיקלית מתאי גזע עובריים לא רק מאפשר לחקר ההתפתחות והתפקוד שלהם, אך מספק תובנה המנגנונים המולקולריים שבבסיס בפתוגנזה של הפרעות הקשורות interneuron קורטיקלית. Interneurons יש גם יכולת יוצאת דופן כדי לשרוד, להעביר, ולשלב מארח המעגלים קורטיקלית שלאחר ההשתלה, שהופך אותם מועמדים אידיאליים לשימוש בטיפולים מבוססי תאים. כאן, אנו מציגים מדרגיים, יעיל ביותר, ששונה embryoid גוף-כדי-טפט שיטה ההטיה של ביטוי Nkx2.1 אבות interneuron, הצאצאים שלהם מן בתאי גזע עובריים בעכבר (mESCs). באמצעות קו mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP כתב כפול, Nkx2.1 אבות או צאצאיהן שלאחר mitotic לבטא Lhx6 יכול להיות מבודדים באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ולא משתמשים לאחר מכן במספר יישומים במורד הזרם. כמו כן אנו מספקים שיטות כדי להעשיר parvalbumin (PV) או somatostatin (SST) interneuron קבוצות, אשר עשוי להיות שימושי חוקרת היבטים של נחישות הגורל או לשימוש ביישומים טיפולית ירוויחו interneuron מועשר קבוצת משנה השתלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הן בעכברים ובבני אדם, בערך מחצית כל קורטיקלית מעכבות interneurons (CIns) מקורם בתוך מבנה subcortical ארעית הידועה בשם קדושתו ganglionic המדיאלי (MGE), שבו המוצא לאגס neuroepithelial CIns אחרים עצביים ו גליה קבוצות מבטאים את הפקטור שעתוק Nkx2.11,2. CIn חבורות או תתי סוגים מוגדרים על-ידי מצטלבים מורפולוגי, עצבית, אלקטרופיזיולוגיות וקישוריות מאפיינים3,4. CIns MGE, נגזר ניתן לקבץ קבוצות בעיקר שאינם חופפים בהתבסס על הבעת רגשותיהם PV או SST, הביטוי של אשר בקורלציה עם מסוים אלקטרופיזיולוגיות וקישוריות נטיות5. תפקוד לקוי של interneurons, במיוחד אלה בקבוצת המשנה PV, היה מעורב במספר מנוטלי הפרעות ומחלות6,7. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר תאי גזע-derived אבות mitotic ו מבשרי נודדות מועשר לגורל PV או SST CIn ללמוד ביולוגיה interneuron קורטיקלית, לשימוש בטיפולים מבוססי תאים.

פיתחנו שיטה מדרגי, יעילה במיוחד עבור ההטיה של ביטוי Nkx2.1 אבות interneuron, הצאצאים שלהם מן mESCs. באמצעות Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP של הכתב כפול mESC קו8, Nkx2.1 אבות או צאצאיהן שלאחר mitotic לבטא Lhx6 יכול להיות מבודדים באמצעות FACS משתמשים לאחר מכן במספר יישומים במורד הזרם. על-ידי מניפולציה מספר איתות המסלולים, משך הזמן של תרבות, ומצב של נוירוג'נסיס, אפשר להשיג מיליוני interneuron fluorescently שכותרתו מבשרי מתאים שורה של יישומים במורד הזרם.

למרות מספר שיטות אחרות קיימות ליצירת MGE כמו אבות מ mESCs9,10,11,12,13,14, השיטה שלנו, אשר נשענת על חגיגת אנטגוניסט מבצע של-939, יעיל במיוחד-יצירת שיתוף לבטא אבות telencephalic Foxg1/Nkx2.1. בנוסף, היכולת לבחור interneuron אבות או פוסט mitotic לבטא Lhx6 הצאצאים שלהם באמצעות מערכת כפולה הכתב שלנו, משפר באופן משמעותי את היכולת ליצור אבות ברורים, הצאצאים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: קו mESC כתב כפול שמתואר פרוטוקול זה הינו זמין לפי בקשה (sande@mail.med.upenn.edu).

1. הכנה מדיה

הערה: חמים כל המדיה עד 37 ° C לפני השימוש בתרבית תאים.

  1. העכבר מתחלקים פיברובלסט (MEF) מדיה (עבור הכנת 500 מ)
    1. להוסיף 50 מ ל סרום שור עוברית (FBS) 449 מיליליטר של Dulbecco בינוני (DMEM ששינה רשנה), ואת מסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) לאחר סינון. לאחסן התקשורת ב 4 ° C עד חודש או aliquot, בחנות ≤-20 ° C.
  2. N2 מדיה (עבור הכנת 500 מ)
    1. הוסף 5 מ ל L-אלנין-L-גלוטמין (100 x) ו- 500 µL מרקפטואתנול (55 מ מ) מ 489.5 ל DMEM: תערובת מזין F-12 (DMEM/F-12), מסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) ו- 5 מ"ל N2 תוספת-B לאחר סינון. חנות התקשורת ב 4 ° C בחושך עד כחודש.
  3. מדיום הגידול ללא סרום (אופנוע) (עבור הכנת 500 מ)
    1. להוסיף 75 מ ל תוספת ללא סרום בינוניים, 5 מ לגלוטמין (100 x), 5 מ ל מם חומצות אמינו שאינן הכרחיות (MEM-NEAA) (100 x), 500 µL מרקפטואתנול (55 מ מ) ל- 413.5 mL הלא-גלוטמין המכילה DMEM, לסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) לאחר סינון. חנות התקשורת ב 4 ° C עד כחודש.
  4. מדיה בתאי גזע עובריים בעכבר (עבור הכנת 500 מ)
    1. להוסיף 75 מ ל תא גזע כיתה FBS, 5 מ ל MEM-NEAA (100 x), 5 מ לגלוטמין (100 x), 500 µL מרקפטואתנול (55 מ מ) ל- 413.5 mL הלא-גלוטמין המכילה DMEM, לסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) לאחר סינון. לאחסן התקשורת ב 4 ° C בחושך עד חודש או aliquot, בחנות ≤-20 ° C.

2. culturing mESCs

  1. צלחת mitotically MEF מזין תאים פעילים בתקשורת MEF על גבי לוחות תרביות רקמה שטופלו ב- 3-4 x4 10 תאים/ס מ2. אפשר לפחות 12 שעות להם להתיישב בה חממה תרבות של התא ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו-5% CO2 לפני ציפוי של mESCs. אם לא משתמשים מיד, להחליף את המדיה MEF כל 3 ימים. להיפטר MEFs אם לא נעשה שימוש תוך 7 ימים של ציפוי.
  2. להוסיף mESCs (צפיפות נע בין 1-4 x4 10 תאים/cm2) MEF צלחות בתקשורת mESC המכיל העכבר לוקמיה מעכבות פקטור (mLIF) (1,000 U/mL). דגירה התאים ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו-5% CO2.
  3. המעבר mESCs באמצעות טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) (1:5-1:10) לאחר המנה הופך ~ 70-80% confluent או אם המושבות מתחילים לגעת. זו בדרך כלל מתרחשת כל יומיים, אך עשויה להימשך עד 4 או 5 ימים בהתאם צפיפות ציפוי הראשונית.
  4. לשמור את mESCs בשכבה מזין MEF במדיום mESC כדי לשמור pluripotency.
  5. לפני שמתחילים בידול, המעבר את התאים לפחות פעם אחת על גבי ג'לטין מצופה לוחות ללא MEFs כדי לדלל החוצה MEFs.
    1. להכין ג'לטין מצופה לוחות על-ידי הוספת 0.1% הג'לטין בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם Ca2 +/Mg2 + לצלחת תרבות רקמות טיפול, עוזב ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 ח' צלחת 1.5-2 x 106 תאים/10 ס מ צלחת (2.7-3.6 x 104 תאים/cm2) ולאפשר את התאים להרחיב 2 ימים לפני תחילת בידול.

3. הבחנה mESCs כלפי אבות Telencephalic כמו MGE

  1. בידול יום (DD) 0 = "לצוף תאים"
    1. לאחר mESCs גדלו ג'לטין מצופה לוחות עבור 2 ימים, תשאף התקשורת ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. הוסף מספיק טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) כדי לכסות את המשטח של הצלחת (בדרך כלל 4 מ"ל טריפסין-EDTA בשביל מנה אחת של תרביות רקמה 10 ס מ), ומניחים את התאים בחזרה לתוך החממה ב 37 ° C עם ≥95% לחות יחסית ו-5% CO2 במשך 4 דקות.
    2. לאחר 4 דקות, להרוות את טריפסין-EDTA שימוש באמצעי האחסון פי 2 עם mESC מדיה. להעביר את התאים שפופרת צנטריפוגה בגודל מתאים, centrifuge את התאים ב 200 x g למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את הצינור, תשאף התקשורת מבלי להפריע בגדר. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל KSR:N2 מדיה (1:1) המכיל את המדכא BMP-כעבור שנה--193189 (250 ננומטר) והמעכב ונ ט 939-מבצע של (10 מיקרומטר).
    3. למדוד ריכוז התא באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטית. התחל גדל התאים embryoid גופות (EBs) על-ידי הוספת תאים למ"ל 75,000 KSR:N2 המדיה (1:1) המכילה-כעבור שנה--193189 (250 ננומטר) ו מבצע של-939 (10 מיקרומטר) במנות תרביות רקמה שאינם מחסידי. דגירה התאים ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו-5% CO2.
  2. על DD1, להכין עבור תא "נוחתים" על ידי ציפוי כלים תרביות רקמה מטופלים עם פולי-L-ליזין (10 µg/mL ב- PBS עם Ca2 +/Mg2 +) בן לילה (O/N) ב 37 ° C עם לחות יחסית של 95% ≥ או לפחות שעה.
  3. על DD2, וארוקן את פולי-L-ליזין, מעיל הצלחות עם laminin (10 µg/mL ב- PBS עם Ca2 +/Mg2 +) O/N ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית.
    הערה: בזמן O/N הוא אופטימלי, קטנה כמו 2 h עשוי להספיק. אם לא נעשה שימוש צלחות יום למחרת, תשאף laminin להחליף עם PBS מבלי Ca2 +/Mg2 +, לאחסן ב 4 ° C עד 2 שבועות.
  4. DD3 ("אדמה תאים")
    1. לפני תחילת EB דיסוציאציה, וארוקן את laminin ולאפשר את הצלחות יבש לחלוטין בשכונה תרביות רקמה. אל תשתמש צלחות המופיעות מבריק או רטוב בעליל. להעביר את EBs עם מדיה לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה למשך 3-4 דקות בגיל 15 x g או עד EBs יש מגורען.
  5. האחות התקשורת ולהוסיף 3 מ"ל של פתרון ניתוק התא המכיל DNase (2 U/mL) דגירה ב 37 ° C עם לחות יחסית של 95% ≥ ו 5% CO2 ב 15 דקות קפיצי בעדינות את הצינור כל 3 דקות כדי לסייע EB דיסוציאציה.
  6. ברגע EBs כבר אינם גלויים או 15 דקות שחלפו, להוסיף KSR:N2 6 מ ל (1:1) המכיל DNase (1 U/mL), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g.
  7. צלחת תאי KSR:N2 (1:1) המכיל-כעבור שנה--193189 (250 ננומטר), מבצע של-939 (10 מיקרומטר), ואת החומר המדכא רוק Y-27632 (10 מיקרומטר) ב- 4.5-5 x4 10 תאים/ס מ2.

4. SST מעשירה בפרוטוקול: "DD12 GFP גבוהה סוניק הקיפוד (ששש)" (המשך מ שלב 3.7)

  1. על DD5, לשנות את המדיה עם KSR:N2 (1:1) המכילה FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ו- SSH (50 ng/mL).
  2. להתכונן תרביות רקמה לוחות ציפוי מחדש ביום 8 (שלב 4.4) באמצעות ההוראות המפורטות בשלבים 3.2-3.3.
  3. DD7, לשנות המדיה עם KSR:N2 (1:1) המכילה FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), וששש (50 ng/mL).
  4. על DD8, לוחית רישוי מחדש את התאים.
    הערה: במהלך השלב זה לא הכרחי, ציפוי מחדש את התאים יכול להפחית את סוגי תאים מוקדמת הבדיל, לא רצויות. ציפוי מחדש גם שובר את הביצים של תאים להקשות ניתוחים immunohistochemical במורד הזרם, מגדיל את היעילות של FACS בנקודות זמן מאוחר יותר.
    1. צלחת מחדש תאים, לנתק את התאים מהצלחת עם טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) עבור 5 דקות ב 37 ° C עם ≥95% לחות יחסית ו-5% CO2. להרוות את טריפסין-EDTA שימוש באמצעי האחסון פי 2 עם KSR:N2, צנטריפוגה ב g 200 x עבור 5 דק. לסנן את התאים דרך צינור מסנן 40 µm להסיר גושים כלשהם. צלחת מחדש את התאים-תאים/ס מ 250,0002 ב N2/אופנוע (1:1) המכילים FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ו- Y-27632 (10 מיקרומטר) עם שטויות (50 ng/mL).
      הערה: אם במקום זאת, ההחלטה שלא מחדש צלחת התאים על DD8, לשנות את המדיה עם KSR:N2 המכיל ששש (50 ng/mL) כל הימים 2 DD7 ועד DD12 והמשך להוסיף IGF-1 (20 ng/mL) ו- FGF-2 (10 ng/mL) עד DD9.
  5. על DD10, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכיל ששש (50 ng/mL).
  6. ב- DD12, כדי להשיג התאים מועשרים עבור סוגי SST, להשתמש FACS לבודד Lhx6::GFP-רק מבטאת תאים.
    1. כדי לנתק את התאים, השתמש הלא-טריפסין המכילה תאים-דיסוציאציה ריאגנט במקום טריפסין-EDTA. רחץ תאים פעם אחת עם PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. להוסיף מראש ומחוממת הלא-טריפסין המכילה תאים-דיסוציאציה ריאגנט המכיל DNase (2 U/mL) לתאים. למקם אותם בחממה ב 37 ° C עם ≥95% לחות יחסית ו-5% CO2 למשך 10-30 דקות, או עד התאים יש מנותק. טפח בעדינות את הצלחות כל 5 דקות כדי לסייע של הדיסוציאציה.
      הערה: על DD11-12 תרבויות, רק 10-15 דקות ייתכן שיהיה צורך. על תרבויות DD15-16, 30 דקות או יותר ייתכן שתידרש דיסוציאציה מלאה.
    2. לאחר התאים לקחתם לגמרי רלוונטי, להמשיך FACS בידוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים או להשתמש בתאים אחרים ניתוחים במורד הזרם.

5. PV מעשירה בפרוטוקול: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (המשך מ שלב 3.7)

  1. על DD5, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL).
  2. להתכונן תרביות רקמה לוחות ציפוי מחדש על DD8 (שלב 4.4) באמצעות ההוראות המפורטות צעדים 3.2-3.3.
  3. על DD7, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL).
  4. על DD8, מחדש צלחת התאים כפי שמתואר בשלב 4.4 למעט החריגים הבאים: כאשר ציפוי מחדש את התאים, להחליף ששש אגוניסט smoothened (סאג; 30 ננומטר) ולהוסיף מעכב PKC טיפוסיות (aPKCi; 2 מיקרומטר). יחדיו, התקשורת מחדש משוריין הוא עכשיו N2/אופנוע (1:1) המכילה FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 מיקרומטר), מפנקים (30 ננומטר), ו- aPKCi (2 מיקרומטר).
  5. על DD10, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר).
  6. DD11
    הערה: בשלב זה, Nkx2.1::mCherry+ התאים מועשרים להפוך PV CIns.
    1. ניתוק התאים מהצלחת עבור FACS באמצעות פרוטוקול זהה המתוארים שלב 4.6. אם ההחלטה כדי לאסוף תאים Nkx2.1::mCherry+-יום לאחר מכן בידול, להתעלם שלב זה.
  7. על DD12, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר). על DD14, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר). על DD16, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר). על DD17, לאסוף את התאים Nkx2.1::mCherry+ באמצעות פרוטוקול זהה המתוארים שלב 4.6.

6. PV מעשירה בפרוטוקול: "DD17 mCherry נמוך ששש" (המשך מ שלב 3.7)

  1. על DD5, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL). על DD7, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL).
  2. על DD9, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1). מנקודה זו ואילך, ללא גורמי צמיחה נוספים נחוצים.
    1. להמשיך לשנות את המדיה כל יומיים עד קציר התאים על DD17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

את הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא גרסה מותאמת של16,15,שלנו פרוטוקולים שפורסמה17 ואת הותאם לשימוש עם קו כפול-כתב mESC שלנו Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. על ידי הוספת החומר המדכא ונ ט 939-מבצע של DD0-5, בשילוב עם ציפוי מחדש ב- DD8, אנו להשיג חזקים אינדוקציה Nkx2.1, שבו למעלה מ- 50% של כל הגרעינים דאפי + בתרבות הם Nkx2.1 מביעה גם (איור 1 א', ב'). אימונוהיסט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמנם שיטה זו יעילה מאוד על תכנים mESCs נגזר J1 (SCRC-1010), שאנו חווים הצלחה משתנה עם קווים mESC אחרים מבודד המשובטים. למשל, Foxg1::venus mESCs (EB3 נגזר; . דאנג'ו et al. תגובה 13) גרוע זה פרוטוקול, אינדוקציה Foxg1 על ידי DD12 הוא בדרך כלל גודל 1-2%. מסיבות שאנחנו לא מבינים לחלוטין, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP עוד כתב כפול שיבוט (הנקרא JQ59) שהיה מבודד בו זמנית כמו הקו המתואר פרוטוקול זה (הנקרא JQ27), מייצרת פחות מ 1% לבטא Nkx2.1 תאים כאשר גדל בתנאים זהים. קו האב (J1; ATCC SCRC-1010), עם זא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו מודים שו צ'ינג לפתח את Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP כתב כפול mESC קו, כמו גם ג'ניפר טייסון, אסיף Maroof ו טים פטרוס עבודתם מוקדם על עוזרת לפתח פרוטוקול זה. אנו מודים גם את ליבת cytometry זרימה CHOP לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי, MH066912 R01 NIH (SA) ו F30 MH105045-02 (DT).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת מסנן ואקום על הבקבוקCLS430769קורנינג
עם מסננת תאים מכסה הצמדThermoFisherCorning 352235
פיברובלסטים עובריים של עכבר (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101Gבקבוקון אחד של 7M MEFs מספיק לארבע לוחות TC בגודל 10 ס"מ. הפניות: 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2ידוע גם כחומר אנטי-מיקרוביאלי. אין לסנן עם מדיית בסיס - הוסף לאחר הסינון. הפניות: 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156אין לסנן עם מדיית בסיס -- הוסף לאחר סינון
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061הידוע גם בשם L-אלנין-L-גלוטמין. הפניות: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028ידוע גם בשם תוסף בינוני ללא סרום. הפניות: 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018ידוע גם בשם DMEM שאינו מכיל גלוטמין. הפניות: 9,11
HycloneFBS VWR82013-578ידוע גם בשם FBS בדרגת תאי גזע. הפניות: 9,11
צלחת מטופלת בתרבית רקמות (10 ס"מ)BD Falcon353003
צלחת פטרי סטרילית שאינה נדבקת (10 ס"מ)VWR25384-342
גורם מעכב לוקמיה (mLIF)ChemiconESG1107אין להקפיא, יש לאחסן בטמפרטורה של 4'C. הפניות: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% תמיסת ג'לטיןATCCATCC PCS-999-027
למיניןסיגמאL2020
פולי-L-ליזיןסיגמאP6282
טריפסין-EDTA (0.05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501ידוע גם כמגיב דיסוציאציה של תאים שאינו מכיל טריפסין. הפניות: 9,11
RQ1 RNase PromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074השעיה ב-80'C במכסות לשימוש חד פעמי
XAV939Stemgent04-0046השעיה ב-DMSO ואחסון ב-80'C במכסות לשימוש חד פעמי
rhFGF-2מו"פ D Systems233-FBהשעיה מחדש ב-PBS עם 0.1% BSA ואחסון ב-80'C במכסות חד פעמיות
rhIGF-2R& D Systems291-G1השעיה ב-PBS עם 0.1% BSA ואחסון ב-80'C במעכב ROCK לשימוש חד פעמי
(Y-27632)Tocris1254השעיה ב-DMSO ואחסון ב-80'C בשימוש חד
פעמי אגוניסט מוחלק (SAG)Millipore566660-1MGהשעיה ב-H20 ואחסון ב-80'C בשימוש חד פעמי rm
Sonic Hedgehog/SHHR& D Systems464-SH-025השעיה ב-PBS עם 0.1% BSA ואחסון ב-80'C במכסות חד פעמיות
PKCζ מעכב פסאודו-סובסטרט, MyristoylatedEMD Millipore539624Resuspend ב-H20 ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במכסות לשימוש חד פעמי
מבחנה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841(2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956(2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622(2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron DifferentiationNkx2 1 ProgenitorsFluorescence Activated Cell SortingEmbryoid Body Monolayer MethodParvalbumin Interneuron EnrichmentSomatostatin Interneuron SubgroupsDual Reporter mESC LineCell Transplantation ProtocolNeural Fate Determination

מאמרים קשורים