במחקר זה, אנו מציגים הליך קל ויעיל להערכת שיבוש מחסום הדם - מוח ניווניות בתנאים. כדי להשיג את המטרה שלנו, אנחנו חדורים משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין לתוך וריד הצוואר העכבר הווריד וההערכה שלה דליפה לתוך parenchyma המוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של חדירות מחסום הדם - מוח על ידי עירוי תוך ורידי של התווית על-ידי FITC אלבומין במודל של עכברים של מחלות ניווניות
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
שיבוש שלמות מחסום הדם - מוח (BBB) היא תכונה נפוצה עבור נוירולוגיות ומחלות ניווניות שונות. למרות יחסי הגומלין בין הומאוסטזיס BBB מודאג בפתוגנזה של הפרעות מוח צריך חקירה נוספת, פיתוח, אימות של שגרה אמין במדויק לזהות שינויים BBB עשוי להיות מכריע ומייצגים כלי שימושי פוטנציאל לחיזוי מחלות התקדמות, פיתוח ממוקד אסטרטגיות טיפוליות.
כאן, אנו מציגים את הליך קל ויעיל להערכת BBB דליפה לידי מצב ניווניות כאלה המתרחשים במודל של עכברים פרה של מחלת הנטינגטון, שבה פגמים החדירות של BBB הם בבירור לזיהוי precociously ב המחלה. באופן ספציפי, משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין, אשר מסוגל לעבור BBB רק כאשר האחרון הוא לקוי, הוא בחריפות מוחדר לתוך וריד הצוואר העכבר והפצתם המחוזות לכלי הדם או parenchymal לאחר מכן נקבע על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
הצטברות של פלורסנט-אלבומין ירוק ב- parenchyma המוח מתפקד בתור אינדקס של חדירות BBB סוטה ו, כאשר quantitated באמצעות תוכנת עיבוד תמונה J, המדווח עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק.
מבוא
הומאוסטזיס בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא תנאי מוקדם תקשורת מתאימה והתפקוד של תאים עצביים. CNS parenchyma בחוזקה סגור מהפריפריה מאת אנדותל מחסום הדם - מוח (BBB), אשר מייצג את הממשק בין מחזור הדם ההיקפיים המוח ממלא תפקיד מרכזי ב- cross-השיחה בין ברבעים אלה שני1 ,2. BBB היא מורכבת, דינמי המבנה התלת-ממדי מורכב בעיקר כלי מיקרו אנדותל תאים מיוחדים (ECs) קשורות זו לזו דרך מכלולי המערכת מהחיבור - צמתי צר (TJs) - והיא מוקפת pericytes, תא עצב סופים, אסטרוציט רגל תהליכים1,2.
בתנאים פיזיולוגיים, החדירות נמוך ביותר של BBB שלם מבטי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי IRCCS Neuromed חיה אכפת לי ועדת הבדיקה, על-ידי " Istituto סופריורה די Sanità " (היתר מספר: 1163/2015-PR) היו בהתאם לקווים המנחים של האיחוד האירופי דירקטיבה 2010 / 63/האיחוד האירופי לניסויים בבעלי חיים-
1-הכנת FITC-אלבומין פתרון כדי להיות מוזרק לתוך עורק הצוואר
הערה: כל הניסויים היו הבקרה מבוצעת במקום מניפסט עכברים HD R6/2 (11 - בן שבועיים), בעידן ותואמים מין פראי-סוג (WT) הארנבונים מאותה.
- התמוססות FITC-אלבומין לפדר (ראה טבלה של חומרים) בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) ב 10 mg/ml-
הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, זה צריך להיות מוכן טרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
העירוי הנכון של FITC-אלבומין לתוך בתוצאות ולפגוע extravasation של רכיב המעקב פלורסצנטיות ירוק מזרם הדם לתוך parenchymawhen מוח ש-BBB היא נפגעת6. בתנאים פיזיולוגיים, הפצה של אלבומין פלורסנט חדורים הוא מוגבל הפנימי של כלי הדם במוח והוא אין קליטה שמסביב perivascular באזור ו/או המוח parenchyma לזיהוי (איור 1A, micrographs- למעלה). לעומת זאת, כאשר BBB זה נפגע בנסיבות נוירו-פתולוגיים, FITC-אלבומין מציג תבנית פלורסצנטיות מפוזר לאורך perivascu.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נתאר כאן את הטכניקה שימושית בעיקר לגילוי BBB זליגת בתנאים מחלת מוח. תפקוד לקוי של BBB הוא צובר תשומת לב כמו תכונה נפוצה של הפרעות רגשיות ונוירולוגיות שונות4. בעבר השתמשנו בגישה זו כדי לתאר את בלבול מוקדם של BBB שלמות במודל של עכברים של מחלה נדירה ניווניות כמו HD6.
בשיטה זו לוקח היתרון היחסי הפשטות והיעילות של ההליך, אשר מספק תוצאות מדויקות ואמינות. זה מייצג כלי מחקר פרה רגישה מאוד, שימושי עבור המהירות ואת המיידיות שהוא מציע בהערכת איכותית BBB הפר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף
תודות
העבודה הזאת הייתה הנתמך על-ידי "דל'אנג'לו Neuromed", במימון משרד הבריאות "החיפוש אחר Corrente" כדי V.M. איטלקית
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אלבומין-פלואורסצין איזותיוציאנט conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb אנטי למינין | נובוס ביולוגי | NB300-144 | |
| CY3 אנטי ארנב תוצרת עז | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| כיסוי תלושי 24 X 50 מ"מ | תרמו סיינטיפיק (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD מדיית הרכבה | VECTOR | H-1500 | מדיית הרכבה עם DAPI |
| iNSu/אור אינסולין מזרק חד פעמי | RAYS בריאות & בטיחות | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2 אינץ' | BD Microlance | 304000 | מחט למזרק חד פעמי |
| ידית אזמל | FST91003-12 | ||
| #22 אזמל חד פעמי | FST | 10022-00 | |
| מספריים איריס עדין 10.5 ס"מ | FST | 14094-11 | |
| מלקחיים דומונט #5745 45° 0.10 x 0.06 מ"מ | FST | 11251-35 | |
| מלקחיים 10 ס"מ | F.S.T. | 11051-10 | |
| מלקחיים דומונט #5 0.1 X 0.06 מ"מ | FST | 11251-20 | |
| תיקון רפואי | Medicalis | 34788 | |
| וילון מגבת חד פעמי סטרילי | Dispotech | TVO50VE | |
| מיקרוסקופ סטריאוסקופי | NIKON | SMZ 745 T | |
| תאורה אופטית אור LED (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | תאורה אופטית למיקרוסקופ סטריאוסקופי |
| ליקוי Ni-U מיקרוסקופ | ניקון | 932162 | מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי |
| מיקרוסקופ מצלמה דיגיטלית | ניקון | DS-Ri2 | מיקרוסקופ |
| מצלמה Intenslight | ניקון | C-HGFI | מיקרוסקופ מנורת |
| NIS-Elements 64 סיביות | ניקון | AR 4.40.00 | תוכנת ניתוח |
| סכין גילוח חשמלי | Gemei | GM-3007 |
מקורות
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
