מאמר שיטה

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56398

⸱

2 במרץ 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

במאמר זה

סיכום

אנחנו ניצור קשר עם סיכת ראש קטנה RNA (shRNA) ופרוטוקול הבא הדור המבוססת על רצף לזיהוי הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש בקו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז ומאוחדים. גנים עמידות hygromycin עם איזה CpG מחייב חלבון 2 ( MeCP2) גנים על כרומוזום ה-X לא פעיל.

תקציר

קדימה מסכי גנטי באמצעות גנים כתב מוכנס לתוך הטרוכרומטין שימשו בהרחבה לחקור מנגנוני השליטה epigenetic דגם אורגניזמים. טכנולוגיות כולל סיכת ראש קצר RNAs (shRNAs) ו באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) אפשרו כגון מסכי בתאים בתרבית של דיפלואידי. כאן נתאר על הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש (XCI), מסך shRNA בקנה מידה גדול באמצעות קו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז והפיל גנים עמידות hygromycin ב- C-הסופית של איזה CpG מחייב חלבון ג'ין (MeCP2) 2 על שמושרש לא פעיל (Xi). שהפעלה של הבונה בקו תא כתב הענקת יתרון הישרדות תחת בחירת hygromycin B, ומאפשרת לנו מסך ספרייה גדולה shRNA ולזהות סיכות זה מחדש הכתב על ידי מדידת שלהם באמצעות פוסט-בחירה העשרה הדור הבא רצפי. סיכות מועשר היו תוקף אז בנפרד על-ידי בדיקת היכולת להפעיל את הכתב לוציפראז ב- Xi.

מבוא

אחת הצורות הנפוצות ביותר של לקות נפשית תורשתי אצל נקבות, תסמונת רט, נגרמת על ידי משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מוטציות ב- MeCP2, ג'ין שמושרש מקודד חלבון חיוני עבור תפקוד נורמלי1. גישה אפשרית לטיפול בהפרעה זו יהיה שהפעלה של אלל MeCP2 פראי-סוג ב ה-Xi, כמו שיקום של הביטוי MeCP2 הוצגה להיפוך גרעונות עצביים במודל של עכברים של מחלה זו1, 2 , 4. עם זאת, epigenetic להחרשת לאחד שני כרומוזומי בתאים הנשי X נשמר הדוק לאורך כל מחזור של3,אורגניזם4ותדרוש חזקים שהפעלה של ג'ין קי סביר רב סרן הפרעה במשעולים רגולטוריות epigenetic מרובים.

כדי לזהות גורמים הדרושים לתחזוקה של שתיקת MeCP2 , אנחנו קודם פיתח מודל העכבר הטרנסגניים נושא שילוב גנים עמידות hygromycin (MeCP2-לוק-HR) MeCP2- לוציפראז - לאחד שני כרומוזומי X (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. למרות MeCP2 הביע של הבונה פיוז'ן הוכיחה להיות לא יציב ולא הביא לאובדן של פונקציה, phenotypically היה שווה מחיקה MeCP2 אצל זכרים hemizygous (X /YMeCP2-לוק-HR), הביטוי של הגנים כתב היה בקלות לזיהוי בתבנית עקבית עם הביטוי של MeCP2 אנדוגני5. אנחנו מכן שנוצר פיברובלסט מונצחים שיבוטים עם הבונה על שמושרש פעילה או לא פעילה, ואישר שלשעבר את ביטוי wild type MeCP2, לא כתב הבונה; ההופכי היה נכון עבור האחרון. כאשר נחשף של הדנ א. demethylating סוכן ידוע מחסלים. ג'ין להחרשת, 5-azacytidine (5-עזה), תאים עם הכתב על Xi ("תאים כתב") צבר פעילות assay ביולומינסנציה, המציין כי לבנות שלנו יכול להפעיל מחדש ולכן משמש עבור בדיקה גנטית.

פיתחנו הבא תפוקה גבוהה גנטי על מסך הרגולטורים של שתיקת MeCP2 . הקו תא כתב קודם היה נגוע המכיל ספריית retroviral > מיקוד shRNAs שונים 60,000 > 25,000 הגנים לאורך כל העכבר הגנום5,6, ונחשפו ואז לבחירה hygromycin B. סיכת ראש תדירות נמשל ב מראש, דוגמאות פוסט-בחירה באמצעות רצף הדור הבא, כמו כתב הפעלה מחדש הענקת יתרון צמיחה תחת hygromycin B בחירת וכתוצאה העשרה של סיכות אחראי. באמצעות גישה זו, זיהתה 30 גנים מעורבים MeCP2 להשתיק, ואנו לאחר מכן אישר את הממצאים על-ידי transducing התאים כתב עם סיכות בודדות ומדידת פעילותם לוציפראז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השלבים המערבות בעלי חיים בוצעו באמצעות פרוטוקולי שאושרו על ידי פרד האצ'ינסון סרטן מחקר מרכז מוסדי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC). אין ריאגנטים המשמש כאן ידועים להוות סיכון בריאותי משמעותי האנושי מלבד 5-azacytidine (5-עזה).

1. יצירת קו תא כתב עם MeCP2transgene - לוק-HR ב- Xi

  1. הכנת העכבר גיד fibroblasts מ נקבה XMeCP2-לוק-HR /XMeCP2 העכבר
    1. המתת חסד יום 10-12-מהמושב XMeCP2-לוק-HR/X העכברMeCP2 .
    2. באמצעות חיתוך ישר מספריים, עושים חתך במבניו דרך העור של החלק הזנב הפרוקסימלית.
    3. מחזיק את הגווייה ליד בסיס הזנב, משוך את העור מן העכבר כדי לחשוף את החלק fibrocartilaginous של הזנב. הסר וחותכים הטרמינל 10 מ מ של הרקמה חשופה לתוך 1 מ"מ קטעים ארוכים באמצעות אזמל כירורגי.
    4. העברת רקמות מפוצלים חרוט 15 מ"ל צינור המכיל 5 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 1 ו- collagenase 1.5 mg/mL, לסנן מראש דרך 0.45 מיקרומטר ומסננים רשת ואז 0.2 µm. תקופת דגירה של 3-4 h ב 37 ° C עם סיבוב רציף.
    5. צנטריפוגה המדגם בטמפרטורת החדר ב 500 x g עבור 10 דקות Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של DMEM בתוספת סרום שור עוברית 10%, פניצילין 1 U/mL, ו 1 סטרפטומיצין µg/mL (DMEM-10), צלחת על צלחת תרביות רקמה 6-. טוב. המעבר את התאים פעם ולהרחיב את צלחת 10 ס מ לפני שתמשיך לשלב הבא.
    6. להנציח את התאים על ידי ביצוע של התמרה חושית עם וקטור ביטוי נושאת oncogenes נגיפי HPV-16 (E6/E7), כפי שתואר לעיל7.
  2. בחירת שיבוטים תא בודד ואפיון MeCP2 כתב ביטוי
    1. קציר תאים מן צלחת 10 ס מ. ראשית, וארוקן את המדיה, להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA, תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 9 מ של DMEM-10 ולאסוף את התאים resuspended צינור חרוטי 15 מ"ל.
    2. לדלל את התאים עם DMEM-10 כדי ריכוז סופי של התא 1/100 µL. להעביר ללוחות 96-ובכן מאת pipetting 100 µL של ההשעיה כל טוב.
    3. דגירה ב 37 ° C עד הבארות confluent, אשר יכול לקחת עד 2-3 שבועות. החלף את המדיה DMEM טריים-10 כל 3-5 ימים. כאשר confluent, לגייס את התאים עם 20 µL של 0.05% טריפסין-EDTA לכל טוב, לפצל אותם שני סטים כפולים של 96-ובכן צלחות.
    4. להשתמש assay לפעילות לוציפראז ערכה אחת של צלחות. להשתמש ערכת הומוגנית גחלילית לוציפראז assay אשר אינן דורשות הסרה מדיה. לפי התקנון המצורף לערכה.
    5. להשתמש בתוצאות משלב 1.2.4 לבחור שיבוטים עם שום פעילות לוציפראז לזיהוי הקבוצה הנותרת של צלחות. להרחיב לוחות 24-. טוב, אז טוב 6 שיבוטים אלה.
    6. לבצע את אותו הדבר עבור שיבוט עם הפעילות לוציפראז הגבוהה ביותר; זה ישמש כפקד חיובי למטרות אימות.
    7. הקציר של aliquot של כל טוב בצלחת. ובכן 6 עבור אבן חשופה המערבי. לגייס את התאים עם 200 µL של 0.05% טריפסין-EDTA. תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 2 מ של DMEM-10, להעביר מחצית התאים 1.5ml צנטריפוגה שפופרת. רחץ את התאים פעם אחת עם PBS לפני lysing עבור תספיג חלבון. לחלופין, העברת מחצית התאים עוד צלחת 6-. טוב. כאשר התאים לצרף לתחתית הצלחת, לשטוף עם PBS ואת lyse עבור תספיג חלבון.
    8. לבצע מערבון כתם עם נוגדן anti-MeCP2 כדי לאשר כי תאים לוציפראז שלילי אקספרס, בעוד תאי לוציפראז-חיוביים שאינם מבטאים MeCP2 פראי-סוג של כרומוזום ה-X פעיל; בצע את פרוטוקול שתואר לעיל8. להשתמש רקמת המוח lysate מן העכבר פראי סוג כל פקד חיובי.
    9. לוחית רישוי מספר שיבוטים שלילי-עונה 2 פרק 105 תאים/טוב בצלחת 6-. טוב. להתייחס פעם אחת עם 5 מיקרומטר 10-עזה, תקופת דגירה של 72 h מבלי לשנות את התקשורת ואת assay לפעילות לוציפראז כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
    10. לבחור אחד שלילי שיבוט (Xi שיבוט) צבר לוציפראז פעילות עם 5-עזה, להתחיל להרחיב אותו ללוחות מרובים של 10 ס מ. להקפיא שיבוטים שלילי הנותרים של חנקן נוזלי כגיבוי. שיבוט חיובי (Xa שיבוט) ניתן בהשתתפות התרבות רקמות או קפוא עד שימוש נוסף.

2. הקרנת הספרייה עבור הפעלה מחדש שהקטע hygromycin B

  1. מדביק השיבוט מבחן, החלת הבחירה, ולוקחים DNA עבור רצף
    1. להשיג תרכיזים ויראלי של retroviral בונה לבטא סיכות מספריה shRNA, או לייצר תגובת שיקוע ויראלי מרוכזת באמצעות פרוטוקול הכלולים הספרייה הרצויה.
    2. לפני שתמשיך עם המסך, titrate הספרייה (באמצעות סמן GFP, אם היא זמינה). המטרה עבור ריבוי של זיהום בין 0.3 ל- 0.5.
      הערה: לבצע לפחות ארבעה מסכי עצמאית כדי למזער את המחירים חיובי כוזב. השתמש צלחות 20 לכל מסך להשגת כיסוי 100-fold של הספרייה כדי לשמור על ייצוג הולם של סיכות ולמנוע נשירה אקראי9. עם זאת, בהינתן מסך בחירת חיובי וגודל ספרייה גדולה, סביר כי כיסוי נמוך תספיק.
    3. בבוקר, צלחת עונה 1 פרק 106 תאים האחד עשר על גבי לוחות תרביות רקמה 10 ס מ.
    4. אחר הצהריים, להדביק את הצלחות על-ידי החלפת המדיה טרי DMEM-10 המכילה תגובת שיקוע ויראלי, 5-10 µg/mL של polybrene. השתמש את כמות תגובת שיקוע ויראלי שנקבע בשלב 2.1.2.
    5. לאחר 18-24 h, תשאף התקשורת ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM טריים-10 כל צלחת. תרבות עבור עוד 48 שעות.
    6. בבוקר, לגייס את התאים באמצעות 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לכל צלחת, להרוות 9 מ של DMEM-10 לכל צלחת. הפעל את המתלים דרך מסנן רשת 100 מיקרומטר. מאגר של המתלים מסוננים יחד, זרע שני סטים של צלחות 10 ס מ- עונה 1 פרק 106 תאים/צלחת....
    7. אחר הצהריים, החלף את המדיה סט צלחות אחד המכיל 15 µg/mL של hygromycin B (יום 0) DMEM-10. בערכת אחרים, להחליף את המדיה טרי DMEM-10 בלבד.
    8. לאחר 48 שעות, לגייס את התאים של לא מטופל סט צלחות באמצעות 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA. תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 9 מ של DMEM-10. העבר את התאים צינורות חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחוק לגמרי את supernatants ולהמשיך מיד עם חילוץ DNA כדורי. לחלופין, בריכת התאים לתוך צינורות גדולים יותר לפני השלב צנטריפוגה.
    9. לחלץ את הדנ א באמצעות תערובת של פנול chroroform, לזרז DNA עם סודיום אצטט וקור אתנול כמו שתואר לעיל10. מאגר דגימות ה-DNA מיון מוקדם בודדים ולאחסן ב-20 ° C עד שימוש נוסף.
    10. המשך culturing hygromycin B בחירה להגדיר עוד 4 ימים. לחדש התקשורת בחירה עם DMEM-10 טריים המכילים hygromycin B לאחר יומיים.
    11. ביום 7, החלף התקשורת מבחר טרי DMEM-10 בלבד. לאפשר 2-4 ימים להתאוששות ולאחר מכן לקצור את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.8 תגובה על. להמשיך עם ה-DNA החילוץ כפי שמתואר בשלב 2.1.9.
  2. זיהוי סיכות מועשר הדגימות פוסט-בחירה
    1. שימוש 5' הקשר (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') ו 3' תחל לולאה הפוכה (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') כדי להגביר את חצי-סיכות מדגימות הדנ א קדם ומבחר שלאחר. שימוש כל חילצה DNA בתגובות PCR נפרד עם 100-200 ng של דנ א לכל תגובה.
      הערה: אלה בהקשר פריימר 5' ו 3' לולאה הפוכה תחל תואמות את ההקשר מיר-30 רצף במעלה הזרם של הקדמי shRNA ואת הרצף על הלולאה shRNA, בהתאמה. ספריות שונות יחייבו oligos שונים. להתאים את טיהור צעדים כדי לבודד את מידות המוצר שונים לפי הצורך.
    2. שימוש חרוזים ובחירת גודל כדי להסיר תחל דנ א גנומי, ולשחזר PCR מוצרים בין 100 ו-200 bp. לפי התקנון כלל עם החרוזים.
    3. להכין ספריה רצף על רצף של החצי-סיכות ראש. צור לפחות 50 מיליון קריאות לכל מסך. בצע את הפרוטוקול המתאים רצף ערכת וציוד.
      הערה: 50 מיליון קריאות לכל מסך מספק ייצוג כל shRNA בספריה 1000-fold, כ 10-fold כיסוי של כל זיהום עצמאית (בוצעו 100-fold ייצוג כל shRNA), אשר מבטיח ייצוג הולם של כל אירוע זיהום.
    4. לספור בכל shRNA באמצעות סקריפט פרל שחשוב רצפי עם תואם מושלם. בחרה shRNAs שהיה קורא לפחות 10 בבריכה פולסים עם כיוון מוקדם לניתוח נוסף. לחשב את enrichments כמו יחסי של פוסט-כדי preselection נחשב ולקבוע שיעור גילוי שקר (פד) על בסיס 1000 צירופים. בחרה גנים ממוקד על ידי shRNAs עם < 5% פד כמו "מכה" לבדיקה נוספת.

3. אימות של סיכות מזוהה ("להיטים")

  1. Lentiviruses אריזה המכילה shRNAs זיהה במסך
    1. זרע 8 x 10 מטרים 2936 תאים לכל צלחת על צלחות 10 ס מ.
    2. למחרת, החלף את המדיה 9 מיליליטר תרופתיים DMEM-10 לכל צלחת; זה 30 דקות לפני תרביות תאים.
    3. במהלך המרווח של 30 דקות, להכין תערובות שני תקנים:
      1. להכין לערבב 1 (לכל צלחת/shRNA; קנה המידה של פי המספר הכולל של shRNAs): µL 10 של 2 מ"ג/מ"ל polyethylenimine (פיי) ב- 0.5 מ"ל של האופטימלית מדיה חיוני מינימלי. לערבב על-ידי pipetting, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      2. להכין תערובת 2 (לכל shRNA): 4 µg של וקטור shRNA שנארז µg 1.5 של וקטור המעטפה VSV-G (pMD2.G), µg 2.5 של וקטור אריזה (psPAX2), מעורב ב- 0.5 מ"ל של האופטימלית מדיה חיוני מינימלי.
        הערה: כוללים וקטור lentiviral ריק לאריזה לשימוש מאוחר יותר זיהומים כפקד שלילי.
    4. להוסיף 0.5 מ של מיקס 1 בכל aliquot של שילוב 2 ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    5. החל את התערובת על כל צלחת מהשלב 3.1.2 אופנה dropwise; מערבולת את הצלחת בעדינות כדי לערבב.
    6. למחרת, להחליף את המדיה 5 מ של DMEM טריים-10.
    7. 48 שעות לאחר הראשונית תרביות תאים, לאסוף את תגובת שיקוע ולהפעיל אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. טרום רטוב את המסנן עם DMEM-10 כדי למקסם את השחזור.
    8. Aliquot תגובת שיקוע שסוננו לתוך כמויות אידיאלי עבור הדבקה צלחת 6-. ובכן, ובכן.
    9. להקפיא את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, או פנה/י מיד עם התמרה חושית.
  2. התמרה חושית ובדיקות של סיכות בודדות לוציפראז כתב הפעלה מחדש, שהפעלה של הגן MeCP2 פראי-סוג שי.
    1. בבוקר, צלחת עונה 1 פרק 105 Xi תאים/טוב על גבי לוחות טוב 6.
    2. אחר הצהריים, להדביק את הצלחות על-ידי החלפת המדיה 2 מ"ל של טרי DMEM-10 המכילה תגובת שיקוע lentiviral, 5-10 µg/mL של polybrene. להדביק פקד היטב עם תגובת שיקוע ויראלי המופק וקטור lentiviral ריק.
    3. למחרת, החלף את המדיה 2 מ של puromycin 1 מ"ג/מ"ל המכיל DMEM-10. תרבות במשך ארבעה ימים.
    4. להחליף את התקשורת עם 2 מ"ל של DMEM טריים-10 ולאפשר 48-72 שעות להתאוששות.
    5. לגייס את התאים עם 150 µL של 0.05% טריפסין-EDTA. תקופת דגירה של 2-5 דקות ב 37 º C. להרוות 1.5 מ של DMEM-10. העבר את התאים צינורות חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה ב x 500 גרם ל-10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הסר את המדיה, resuspend את התאים במאגר 100 µL פירוק המסופק בערכה assay לוציפראז. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. להעביר את lysates צלחת 96-ובכן לבן ו assay לפעילות לוציפראז באמצעות הפרוטוקול המצורף לערכה. כדי להשתמש Xa תאים פקד חיובי Xi תאים נגועים וקטור lentiviral ריק כפקד שלילי.
      הערה: למנוע חשיפת צלחות לבן של אור ניאון לפני וזמינותו; זה להפחית את הרקע, להגביר את הרגישות וזמינותו. פרוטוקול המסופק בערכה assay נמצאה ליעילות מרבית אם ביצע בחושך במידת האפשר.
    7. כדי לקבוע אם הסיכה היתה השפעה על רמת ביטוי MeCP2 על שמושרש פעיל, לבודד RNA מתאי Xi tranduced ולמדוד את רמת ה-mRNA MeCP2 באמצעות PCR כמותי עם תחל שנועדו להגביר את רק פראי סוג MeCP2 (f: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. אופציונלי: להגביר את הרגישות של וזמינותו על-ידי הוספת 5-עזה ריכוז סופי של 0.2 µM לאחר התאים התאוששו מהבחירה puromycin. התרבות התאים עבור 72 h ללא החלפת המדיה ולאחר מכן assay לפעילות לוציפראז באמצעות ערכת assay לוציפראז מסחרי.
    9. למדוד שהפעלה של MeCP2 פראי-סוג המושתק. להדביק תאים Xa, אשר הנמל הסוג הפרוע MeCP2 על ה-Xi, עם וקטור שמכיל סיכות בודדות, השלבים פרוטוקול 3.2.1. -3.2.4. RNA מתאי לבודד ולמדוד את רמת MeCP2 mRNA באמצעות PCR כמותי עם תחל שנועדו להגביר את רק פראי סוג MeCP2 (f: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', r: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

העכבר גיד fibroblasts נבצרו מ שתואר לעיל XMeCP2-לוק-HR/X העכבר הנשיMeCP2 , מונצחים על ידי retroviral התמרה חושית של oncogenes E6, E7 מ HPV-16 virus7, שיכפל באמצעות דילול המגביל, ונבדק פעילות לוציפראז וביטוי לחלבון MeCP2 פראי-סוג (איור 1A ו 1B). פעילות לוציפראז הייתה חזקה אם הכתב הופיע Xa, בלתי מורגשת אם על Xi; הביטוי MeCP2 יליד הציג דפוס הדדיים. בחרנו שיבוט עם שום פעילות לוציפראז (Xi-8), שיבוט עם פעילות חזקה (Xa-3) לניסויים נוספים. כאשר Xi-8 תאים שטופלו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

האחרונים שלנו ללמוד6, יצרנו קו תא מאתר עם לוציפראז, גנים עמידות hygromycin דבוקה MeCP2 ב- Xi ולאחר transduced זה עם ספרייה של > מיקוד shRNAs 60,000 > 25,000 הגנים. מצאנו 30 גנים אשר יתרון הישרדות שהוענקו דפיקה למטה תחת בחירת hygromycin B, רומז תפקידם בשליטה של MeCP2 והשתקה שמושרש. תוצאות אלו היו אומת על-ידי transducing הקו תא המדווחת עם סיכות בודדות והערכה שהפעלה של הכתב לוציפראז שותק.

מציאת ארבע סיכות ראש העליון ב משכפל כל של המסך שלנו ממוקד XIST<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ד ר Leko תרם מאמר זה כעובדת פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן.  הדיעות שלו, לא בהכרח מייצגים מהנוף של מכוני הבריאות הלאומיים או ממשלת ארצות הברית

תודות

אנו מודים רוס Dickins של אוניברסיטת מלבורן למתן באדיבות הספרייה shRNA בשימוש על המסך. עבודה זו מומן על ידי רט תסמונת מחקר לבטוח (הארית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
293FT קו תאיםInvitrogenR700-07
5-AzacytidineSigmaA2385-100MG
Agencourt AMPure XPBeckman-CoulterA63881
נוגדן Anti-MECP2Millipore07-013
קולגנאזסיגמאC2674-1G
קורנינג 96 בארות מוצק פוליסטירן לבן מיקרופלטותפישר סיינטיפיק07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965-092
מעצר ביטוי וקטור רטרו-ויראלי מותאם למיקרו-RNA (pMSCV)Open BiosystemsEAV4679
מעצר ביטוי pSM2 ספריית shRNAmirOpen BiosystemsRMM3796
סרום בקר עובריפישרברנד03-600-511
HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501או שווה ערך
Hygromycin BCalbiochem400051-1MU
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
מערכת בדיקת לוציפראז Bright-Glo PromegaE2610בדיקה הומוגנית להקרנת מושבות
בדיקת לוציפראזPromegaE4530בדיקה לא הומוגנית לבדיקת סיכות שיער בודדות
Luminometer TopCount NXTPerkin ElmerN / Aאו לומינומטר דומה
MiSeq Reagent Kit v2IlluminaMS-102-2001השתמש בערכה התואמת לציוד שלך
Opti-MEMGibco31985-070
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
pMD2.GAddgene#12259וקטור
מעטפות VSV-GפוליבריןסיגמאTR-1003-G
פוליאתילנימיןPolysciences23966-1
psPAX2Addgene#12260וקטור אריזה
PuromycinGibcoA11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדוםGibco25300-054
מערכת

מקורות

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341(2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XMeCP2Western Blot

מאמרים קשורים