מאמר שיטה

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

11.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56407

⸱

16 בנובמבר 2017

 , 
1Roche Pharma Research and Early Development (pRED), Neuroimmunology, Roche Innovation Center Basel

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה דימות ברזולוציה, שחזור תלת מימדי של העכבר נוירו-וסקולריים יחידה, מחסום הדם - מוח באמצעות סעיפים לתרשים המוח. שיטה זו מאפשרת הפריט החזותי, ניתוח של כימות של organelles תאיים-BBB.

תקציר

מחסום הדם - מוח (BBB) הוא ממשק multicellular דינמי המסדירה את התעבורה של מולקולות בין את זרימת הדם למוח. Transcytosis על פני BBB מסדיר את המסירה של הורמונים, מטבוליטים נוגדנים טיפולית parenchyma המוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב immunofluorescence סעיפים לתרשים סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה להמחיש organelles subcellular בתוך תאי אנדותל-BBB לייזר. שילוב זה הנתונים-קבוצה עם תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית מאפשרת פילוח חצי אוטומטית את כימות של נפח נימי, השטח, כמו גם מספר ואת עוצמת תאיים organelles ב BBB. הגילוי של העכבר אנדוגני אימונוגלובולינים (IgG) בתוך שלפוחית תאיים, כימות שלהם ב BBB משמש להמחשת שיטת. פרוטוקול זה פוטנציאל ניתן להחיל את החקירה של מנגנוני השליטה BBB transcytosis של מולקולות שונות בתוך vivo.

מבוא

מחסום הדם - מוח (BBB) היא רציפה הסלולר מחסום שנוצר על ידי האסטרוציטים, pericytes, נוירונים, תאי אנדותל המפריד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) זרימת הדם1. ויסות תעבורה על פני BBB ממלא תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס המוח, מתווך על ידי מאפיינים מיוחדים של תאי אנדותל של המוח (בקס). הנוכחות של צמתי המערכת צר בין בקס קצב הבסיס נמוך של transcytosis להגביל את התעבורה paracellular ו- transcellular של מולקולות נישא בדם, בהתאמה2. לאחרונה, מסלול transcytosis ב בקס לרתום כדי לשפר את המסירה של מולקולות גדולות טיפולית עד3,המוח4. עם זאת, המנגנון של transcytosis על פני BBB טרם אושרו במלואו מאופיין5,6.

עבודה נרחב נעשה במבחנה כדי לפענח את המנגנונים תאית ומולקולרית ויסות תעבורה תאיים על פני בקס7,8,9,10, 11, אבל מערכות כאלה להיכשל כדי לסכם את אדריכלות מורכבים ופיזיולוגיה של היחידה נוירו-וסקולריים (NVU). מצד שני, מחקרים ויוו12,13 לספק מידע מפורט כמותית על תעריפי התחבורה ברחבי BBB אך אינם מספקים תובנות מנגנונים תאיים תחבורה. לכן, חוקרים מרכיבי NVU הסלולר, תאיים ויוו ו- ex-vivo נשאר מאוד מאתגר14. רק מספר מצומצם של טכניקות נתונות לנתח subcellular מבנים בתוך התאים של NVU. רוב המחקרים להשתמש מיקרוסקופ אלקטרונים אבל בטכניקה זו הוא מוגבל על ידי הפרוטוקולים המורכבים הדרושים עבור הכנת הרקמה הנכונה וטיפול הדגימה. לכן, הקמנו מתודולוגיה בהתבסס על רזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית שתאפשר עיבוד מוחי לדוגמאות הניתוח, כימות של תאי subcellular בתוך התאים NVU.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל את העכבר המוח מקטעים לתרשים כדי לבצע הדמיה כמותית של BBB ו- NVU ברמות סלולרית ו- subcellular. אנחנו נבדק ואומת מספר נוגדנים תמונה, לשחזר את NVU בשלושה ממדים. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר דימות ברזולוציה מירבית מוגבלת עקיפה אופטי של organelles בתוך המוח נימים. יחד עם ניתוח תמונות, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את העברת מקרומולקולות תאיים על פני BBB בתנאים שונים ניסיוני, למשל במודלים של העכבר המחלה של הקשורים ניוון מוחיים.

פרוטוקול

אישור אתיות במחקר זה סופק על ידי בטיחות מזון הפדרלי, המשרד הווטרינרי של שוויץ. כל הניסויים בוצעו תוך הקפדה על פקודת הפדרלי השוויצרי להגנת בעלי חיים ורווחתם, כמו גם על פי הכללים של האגודה מגוונת הסמכה של מעבדה חיה אכפת הבינלאומי (AAALAC).

1. דור של המוח Free-floating מקטעים

  1. כדי להבטיח איכות אופטימלית לדוגמה, להכין פתרון טריים של 2% paraformaldehyde (PFA) בתוך תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) ביום של זלוף.
    התראה: PFA רעיל למדי על-ידי מגע עם העור קרצינוגן אפשרי. השתמש nitrile כפפות כדי להתמודד עם כדורגלן ולהכין את הפתרון ברדס fume כימי.
    1. להכין 60 מ של כדורגלן פתרון לכל חיה.
    2. הביאו PFA לתוך פתרון על ידי הגדלת ה-pH עם 180-200 µL של פתרון קו 5 מ' עבור כל 100 מ של PBS וחימום הפתרון עד 60 מעלות צלזיוס
      הערה: NaOH לא אמור לשמש גם הוא משפיע באופן שלילי שימור רקמות על קיבעון.
    3. ומצננים את פתרון עד לטמפרטורת החדר ולהביא ה-pH עד 7.4 באמצעות מסנן HCl. הפתרון באמצעות נייר סינון (ראה טבלה של חומרים).
  2. לביצוע אובססיה העכבר כל דרך transcardial זלוף כמו שתואר לעיל 15 עם מספר שינויים. ראשית, לשטוף את הדם מן להערכת באמצעות 20 מ של PBS ואז perfuse עם 40 מ של 2% PFA.
  3. להסיר במוח הגולגולת שתואר לעיל 15.
  4. Immerse טרי 2% PFA-perfused המוח ב- 20 מ של 2% PFA במשך 7 שעות ב 4 ° C עבור קיבוע שאחרי.
    הערה: הגדלת הדגירה של מחברים לא מומלץ כי זה יכול למנוע גילוי של מבנים תאיים.
  5. בהרחבה לשטוף את המוח עם PBS קר כקרח.
  6. הטבע קבוע המוח ב- agarose.
    1. הכן agarose 3% פתרון ב- PBS באמצעות מיקרוגל לחימום. בעדינות מערבולת הפתרון תקרר אותו אלא למנוע התמצקות.
    2. יבש את עודפי ל- PBS סביב המוח לפני טבילה לתוך הפתרון agarose במיכל פלסטיק. לסובב את המוח פנימה agarose להסיר בועות אוויר. לאפשר את agarose לגבש מאת מרגיע את זה על קרח
    3. בזהירות להסיר את החסימה agarose מהגורם פלסטיק, לחתוך קוביה סביב המוח באמצעות סכין גילוח. הר המוח אל בעל הדגימה vibratome (ראה טבלה של חומרים) באמצעות דבק cyanoacrylate (ראה טבלה של חומרים). לאפשר מספיק זמן בשביל הדבק שבמהלכו לפני שתמשיך חלוקתה.
  7. העברת המוח ב בעל הדגימה למגש מאגר vibratome מלא עם PBS. להשתמש vibratome את סעיף 100 פרוסות המוח מיקרומטר (הווריד או הילתית). לאסוף את המוח ובסעיף צלחת 6-ובכן בעבר מלא PBS.
  8. על גימור המוח חלוקתה, בזהירות להסיר PBS ולהחליף עם פתרון 1:1 של PBS/גליצרול.
  9. לאחסן מקטעים גליצרול/PBS ב-20 מעלות צלזיוס

2. תא או אברון Labelling על ידי צביעת Immunofluorescence

  1. בקפידה העברת מקטע המוח לבאר של צלחת 24-ובכן בעבר מלא µL 500 ל- PBS לכל טוב. המקטע יישארו הבאר אותו עד סוף ההליך.
  2. לשטוף את המקטע פעמיים עם 500 µL ל- PBS עבור 5 דקות תחת עצבנות עדין.
  3. להסיר את PBS ולבצע בו זמנית וללא permeabilization של פרוסות המוח.
    1. להכין פתרון חסימה ו permeabilization עם 0.3% טריטון-X ו- 10% חמור סרום ב- PBS.
      הערה: סרום חמור יכול להיות מוחלף עם סרום העז להתאים המארח מינים של הנוגדנים משני ספציפי משמש.
    2. דגירה חלקים עם 250 µL פתרון חסימה ו permeabilization עבור h 1 בטמפרטורת החדר תחת עצבנות עדין.
  4. להסיר את הפתרון ולהוסיף פתרון PBS המכיל 5% חמור בסרום נוגדן ראשוני-דילול המתאים (למשל, בטחונות כדי 1:1, 000). דגירה בין לילה ב 4 ° C תחת עצבנות עדין.
    הערה: ראה טבלה של חומרים עבור רשימה של נוגדנים בהצלחה תווית סוגי תאים שונים NVU עם פרוטוקול זה. דילול אופטימלית של נוגדנים הראשי חייב להיקבע מדעית. עבור תוויות סימולטני של אנטיגנים שונים, לדלל לכל הנוגדנים העיקרי בפתרון זהה. לכל הנוגדנים הראשי חייב להיות וגדל מינים שונים. כדי לשפר את הנוגדן חדירה, דגימות יכול להיות מודגרות עבור עד 72 שעות ב-4 מעלות צלזיוס
  5. הסר נוגדן פתרון של שטיפת מקטעי שלוש פעמים במשך 10 דקות ב- PBS תחת עדין עצבנות בטמפרטורת החדר. הסר PBS ולהוסיף 250 µL PBS פתרון המכילה 5% חמור סרום המתאים ספציפית נוגדן משני fluorescently עם תוויות ברורות. דגירה מקטעים בטמפרטורת החדר במשך 1 h תחת עצבנות עדין.
    1. ראה טבלה של חומרים עבור רשימה של הנוגדנים משני בשימוש עם פרוטוקול זה.
  6. להסיר נוגדן פתרון ושטוף הסעיפים שלוש פעמים במשך 10 דקות ב- PBS תחת עדין עצבנות בטמפרטורת החדר.
  7. להסיר PBS ולהוסיף µL 250 של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) פתרון עם ריכוז סופי של 1 µg/mL. דגירה מקטעים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות תחת עצבנות עדין. הסרה דאפי פתרון של שטיפת מקטעי 3 פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
  8. הר המקטע המוח על מליטה שקופיות מיקרוסקופ (למשל, שקופיות זכוכית של בונד היסטו). הסר בזהירות את עודף PBS סביב החלק בשקופית. להוסיף טיפה של הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים) על העליונה של המקטע המוח ובזהירות לכסות את זה עם coverslip זכוכית בורוסיליקט 0.17 מ מ (1.5 מס)-
    1. לאחסן דגימות ב 4 ° C מוגן מפני אור עד ביצוע הרכישה התמונה.

3. הדמיה ברזולוציה גבוהה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח

  1. בצע ייבוא תמונות עם מתאים סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלה של חומרים) עם קווי לייזר-405, 488, 561, 633 ננומטר על עירור של fluorophores באזורי ספקטרום אור כחול, ירוק, כתום ואדום. עבור רכישת התמונה, השתמש 63 X המטרה שמן עם הפתח המספרי של 1.4.
  2. ברכישת תפריט של התוכנה ששולטים המיקרוסקופ, להגדיר את התמונה רכישה פרמטרים. בתפריט הנפתח של ‘ תמונה בגודל ’, בחר ערך של 1024 x 1024 פיקסלים. לשנות את גודל פיקסל לערך בין 200 עד 300 ננומטר על-ידי התאמת הערך ‘ זום ’ תפריט. ”
    הערה: לניתוח של מבנים תאיים, להקטין את גודל פיקסל על 75 ננומטר. ההגדרה גודל התמונה באופן משמעותי מגביר את הזמן רכישה, יכול להיות מופחת ל- 512 x 512 פיקסלים כדי לקצר את הזמן רכישה על ידי הדמיה שדה מבט קטן.
  3. , ' רכישה מהירות ' בתפריט הנפתח, בחר ערך של 400 הרץ, דהיינו 400 קווים לשניה. ב ' מערכות הגדרות & #39; תפריט, בחר ' עומק פיקסל ' הנפתחת תפריט, שנה את הערך ל 12 סיביות.
  4. בתוכנה מיקרוסקופ, בתוך ' רכישת ' טאב, החלף את האפשרות עבור רכישת מסגרת רציפים. להגדיר את עובי סעיף אופטי לערך בין 0.75 1 מיקרומטר לכל ערוץ על-ידי שינוי הערך ' חריר ' תפריט.
  5. בחלונית ' עבור פלורסנט עירור, להפעיל את הלייזר נדרש לגרות באופן מיטבי את fluorophores במדגם, לדוגמה 488 ננומטר לייזר קו fluorophore פולט-ירוק-
    הערה: השתמש הצופה ספקטרה fluorophore (ראה טבלה של חומרים) כדי לבחור את הלייזר עירור נאותה.
  6. בחלונית ' לגילוי פלורסנט, הזז את המחוון כדי לבחור את אורכי הגל זה נמדד בכל אחד מהערוצים, לדוגמה בין 510, 550 ננומטר על fluorophore פולט-ירוק-
    הערה: השתמש הצופה ספקטרה fluorophore (ראה טבלה של חומרים) כדי לבחור את אורכי הגל של זיהוי נאותים.
  7. להוסיף טיפה של שמן טבילה עם מדד השבירה 1.52 מעל coverslip עם ' ' המוח כדי להתאים את מקדם שבירה של זכוכית coverslip, המטרה. למקם את הדגימה במיקרוסקופ, להדליק את המנורה פלורסנטי להמחיש את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ המשקפת.
  8. באמצעות הלחצנים לדוכן מיקרוסקופ, לשנות את הגלגל מסנן כדי לבחור מסנן המתאים להמחשת גרעינים שהוכתמו דאפי. להשתמש את המוקד גס כדי להביא את האות מן הגרעינים שהוכתמו דאפי להתמקד.
  9. באמצעות הלחצנים לדוכן מיקרוסקופ, להחליף מסננים כדי להמחיש את האות של סמנים וסקולרית (לדוגמה, CollagenIV או CD31), מרכז שדה הראייה על מקטע נימי בודדים.
  10. ללחוץ על כפתור כדי להפעיל את מצב live-scan. במהלך סריקה להתאים את עוצמת הלייזר ורווח לכל ערוץ להגדיל את הטווח הדינמי של התמונות ולהימנע פיקסל רוויה.
    הערה: השתמש בטבלת בדיקת מידע אשר תוויות פיקסלים רווי להעריך באופן חזותי רוויית יתר. כדי להימנע רוויית יתר אות, התאם את ההגדרות עם הדגימה אשר צפויה להיות ניאון האות הגבוה ביותר.
  11. להגדיר את הערך עבור קו ממוצע של-2-
    הערה: בעת שימוש רכישה מהירויות גבוהות יותר, להגדיל את הערך כדי להפחית את הרעש.
  12. צור להתחיל ולסיים מקטעים עבור ביצוע אופטי z-במחסן המתפרסים על פני כל כמות נים. להשתמש בגודל שלב של 0.45 מיקרומטר.
    הערה: אם תמונות ישמש על כימות עוקבות, לשמור את ההגדרות רכישה זהה עבור ערכת הנתונים המלאה.
  13. על כימות, לרכוש 10 עד 20 z-במחסן לכל מקטע של פחות שלושה עכברים שונים להשוואות סטטיסטי.
    הערה: לרכוש ערכת הנתונים המלא באותה הפעלת כדי לצמצם את השונות הנובעות מדגם הלבנת ולייזר עוצמת תנודות.

4. תמונה עיבוד של תמונות תלת מימדיות של היחידה נוירו-וסקולריים

  1. (אופציונלי) כדי להגדיל את הרזולוציה צירית של z-המחסן נרכש, לבצע deconvolution של ערכת הנתונים תמונה באמצעות תוכנה מתאימה (ראה טבלה של חומרים ).
    1. בתוכנה deconvolution, לשנות את ההגדרות כדי לבצע " עיוור " deconvolution, (דהיינו, באמצעות פונקצית נקודת-התפשטות אדפטיבית).
    2. הגדרות תוכנה deconvolution, החלף את האפשרות לשם הסרת רקע; אפשרות זו לקבוע את הערך הקטן ביותר בעוצמה באוסף תמונות ויש מהמסיכה זה ערכי העוצמה של כל הפיקסלים בתמונה.
    3. הגדרות תוכנה deconvolution, לגלול את האפשרויות עבור לשנות קנה מידה עוצמת, שינוי גודל של 16 סיביות לעומק; אפשרויות אלה וימשיך את ערכי העוצמה המקורי ואת טווח דינמי של התמונות-
    4. בתפריט של ' השבירה ', להגדיר את הערך 1.52. ב ' להגדיר אורך גל ' בתפריט, בחר הפליטה ערכים בכל אחד מהערוצים בתמונה. לדוגמה, בחר 520 עבור fluorophore פולט-ירוק-
  2. לפתוח את ערכת נתוני תמונה באמצעות תוכנה מתאימה הדמיה וניתוח של ערכות נתונים תלת-ממדי (ראה טבלה של חומרים). תוכנת ניתוח של התמונה, לחץ " Surpass " לחצן לעיבוד הגוף התלת-ממדי של נימים.
  3. בעיתונות תוכנת ניתוח תמונה " משטח חדש הוסף " כפתור כדי לחלק את השטח נימי. השתמש בחצים התחתון כדי לעבור בין השלבים באשף יצירת משטח.
    1. , ' צור ' טאב, להגדיר את ערוץ המקור בערוץ עם סמן נימי, לדוגמה CollagenIV, ולקבוע את הפירוט שטח לערך של 0.5 מיקרומטר.
      הערה: האפשרות האחרונה חל לסנן לפי עקומת גאוס התמונה וקובעת את החלקות של פני השטח.
    2. , ' ליצור ' טאב, החלף את האפשרות על הסף אינטנסיביות מוחלטת.
      הערה: אפשרות זו תיצור משטח על ידי יצירת מסיכה המבוססת על העוצמה המוחלטת של הערוץ שנבחר בתמונה.
    3. על השלב הבא באשף יצירת משטח, להתאים את הסף בעוצמה נמוכה יותר עבור פני השטח על-ידי הזזת חלון הזזה על פני ההיסטוגרמה בעוצמה עד המסכה שניתנו מכסה את כל נימי בתמונה. לקבוע את טווח הערכים עבור פרמטר זה מדעית עבור כל ערכת נתונים.
    4. על השלב הסופי של האשף משטח היצירה, לחצו על התפריט הנפתח תחת " סוג המסנן " ובחר באפשרות ' המספר של Voxels '. להגדיר את המספר המינימלי של voxels לערך בין 1.0e5 ל 2.0e5.
      הערה: אפשרות זו תכלול משטחים עם מספר קטן של voxels, למשל, קטן מקטעים של נימים בקצה של המסגרת.
    5. לסיים את אשף יצירת משטח ולשמור את הפרמטרים הבריאה על ידי לחיצה " זוכר את הפרמטרים " בכרטיסיה מחדש של התפריט השטח.
    6. חזור על הפעולות לכל הדמיה ערכת נתונים על-ידי לטעון את הפרמטר המשמש את התמונה הראשונה. כוונן את הפרמטרים עבור עוצמה, סף, המספר המינימלי של voxels עבור כל תמונה לחשבון להבדלים בין רקע מורפולוגיה נימי, בהתאמה.
  4. קטע מבנים תאיים vesicular (למשל, endosomes מלא בנוגדנים), תחילה ליצור ערוץ חדש שכולל רק את האות פלורסנט מתוך נימי.
    הערה: תהליך זה להגדיר אזור של עניין על-ידי יצירת מסיכה באמצעות השטח נימי שנוצר בשלב 4.3
    1. בחר ' עריכה ' תפריט ' משטח נימי ' החלונית. תחת ' מסכה מאפיינים ', לחץ על " כל מסכת ". בחרו בערוץ המכיל את האות שלפוחית תאיים כמו ' מקור ערוץ ', דו-מצביים על האפשרות " לשכפל ערוץ לפני החלת מסיכת ".
    2. , ' מסיכה הגדרות ' עמודה, בחר " קבוע בתוך/מחוץ " ו " להגדיר voxels מחוץ למשטח: " והגדר את הערך שלו 0.00.
      הערה: תהליך זה תיצור ערוץ נוסף בתמונה שבה כל voxels מחוץ המסכה נימי יהיה ערך בעוצמה של 0. לכמת אירועים מחוץ נים (קרי, ב- parenchyma המוח), לבחור " להגדיר voxels בתוך משטח: " והגדר את הערך שלו 0.00.
    3. קטע מבנים vesicular, לחץ על הלחצן כדי להפעיל " להוסיף את המקומות החדשים " באשף. השתמש בחצים התחתון כדי לעבור בין השלבים באשף יצירת משטח.
    4. בכרטיסיה צור, להשתמש הנפתחת תחת " ערוץ המקור " כדי לבחור בערוץ רעולי פנים תאיים שנוצר בשלב 4.4.4.
    5. בכרטיסיה צור, תחת " ספוט זיהוי " סעיף, לקבוע את הקוטר המשוער של XY על ערך בטווח של 0.5 עד 1 מיקרומטר, בהתאם לגודל הממוצע של שלפוחית הנהוגות הניסוי. אפשרות זו קובעת את הגודל הקטן ביותר אשר יזוהו על ידי האלגוריתם פילוח.
    6. בכרטיסיה צור, תחת " ספוט זיהוי " סעיף, החלף את האפשרות לשם " רקע חיסור ".
      הערה: אפשרות זו חלקה את התמונה עם מסנן גאוסיאני של 0.75 ספוט רדיוס (מתוך הערך שבחרת בשלב 4.4.7) ולאחר מכן החסרת האינטנסיביות של התמונה המקורית Gaussian המסוננות לפי רדיוס ספוט 0.88.
    7. , ' ליצור ' טאב, לחץ על התפריט הנפתח תחת ' סוג המסנן ' ובחר " איכות ". שים לב כי זה קטע התמונה על-ידי החלת ספי, המבוסס על העוצמה במרכז נקודות. להתאים את הסף בעוצמה נמוכה יותר על-ידי הזזת חלון הזזה על פני ' איכות ' להיסטוגרמה עד הרוב המכריע של שלפוחית לזיהוי לוחיות ההסבר.
      הערה: טווח הערכים עבור פרמטר זה צריך להיקבע מדעית עבור כל ערכת נתונים.
    8. לסיים את אשף הבריאה ספוט ולשמור את הפרמטרים יצירה על-ידי לחיצה על הלחצן " זוכר את הפרמטרים " בכרטיסיה מחדש של התפריט השטח.
    9. חזור על הפעולות לכל הדמיה ערכת נתונים על-ידי לטעון את הפרמטר המשמש את התמונה הראשונה. כוונן את הפרמטרים עבור ' איכות עוצמת סף ' עבור כל תמונה להביא בחשבון הבדלים בעוצמת רקע.

5. כימות של תחבורה תאיים-BBB

  1. לכמת את נפח (מיקרומטר 3) ואת באזור (מיקרומטר 2) של המקטע נימי. בתוכנת ניתוח, לגשת ללוח סטטיסטיקה של המשטח לכלי הדם שנוצר בשלב 4.3. בחר ' מפורט ' טאב, ולהשתמש התפריט הנפתח כדי לבחור " כל הערכים " כדי למצוא את הערכים עבור אמצעי האחסון ופינת.
  2. לכמת את מספר שלפוחית בתוך המקטע נימי. בתוכנת ניתוח, לגשת ללוח סטטיסטיקת נקודות שנוצר בשלב 4.4. בחר ' הכללית ' טאב כדי למצוא את הערך של המספר הכולל של נקודות בתמונה.
  3. כדי לחשב את המספר של שלפוחית לכל אמצעי אחסון נימי, עבור כל תמונה לנרמל את מספר הנקודות על ידי אמצעי האחסון שחושבו בצעד 5.1. הכפל את הערך הזה ב-1,000 כדי לקבל את המספר של שלפוחית לכל מיקרומטר 1,000 3 אמצעי האחסון נימי.
  4. לכמת את עוצמת הכולל בתוך נימי ליצור משטח חדש שמכסה הבאות כל התמונה ההוראות המתוארות צעדים 4.3 עם השינויים הבאים. בחרו בערוץ המכיל את האות רלוונטי (למשל, mIgG) כערוץ מקור והגדר את הערך של רמת הפירוט שטח 5 מיקרומטר. כדי ליצור משטח שמכסה את כל התמונה, הגדר את הערך של הסף בעוצמה נמוכה ל- 0-
  5. בתוכנה ניתוח, לגשת ללוח סטטיסטיקה של המשטח שנוצר בשלב 5.4. בחר " מפורט " טאב, ולהשתמש התפריט הנפתח כדי לבחור " כל הערכים ". להקליט את הערכים עבור ' עוצמת סכום ' עבור הערוצים עניין; פרמטר זה תואם הסכום של ערכי העוצמה בודדים מעל כל הפיקסלים.
    הערה: לאות תאיים, זה תואם את הערוץ המשוכפל עם voxels מחוץ השטח מוגדר כ- 0.0. עבור אות ב- parenchyma המוח, זה תואם את הערוץ המשוכפל עם voxels בתוך השטח מוגדר כ- 0.0.
  6. כדי לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל אמצעי אחסון נימי, עבור כל תמונה לנרמל את העוצמה על-ידי אמצעי האחסון שחושבו בצעד 5.1. הכפל את הערך הזה ב- 1,000 לקבל את הערך עוצמת קרינה פלואורסצנטית לכל מיקרומטר 1,000 3 אמצעי האחסון נימי.
    הערה: עבור אותות פלואורסצנט ב- parenchyma המוח, לנרמל את הערכים לפי נפח התמונה הכוללת מינוס האחסון נימי, להכפיל ב-1,000 כדי לקבל את העוצמה הכוללת לכל מיקרומטר 1,000 3 של המוח parenchyma.
  7. חזור על התהליך עבור כל ערכת הנתונים ולהשתמש התוכנה המתאימה כדי לבצע ניתוח סטטיסטי של הנתונים.

תוצאות

כמה דוגמאות מייצגות של תמונות המתקבל הפרוטוקול המתואר כאן, חלקים במוח העכבר היו מוכתמים נוגדנים זיהוי מרכיבים שונים של NVU כולל את קרום המרתף, האסטרוציטים, pericytes, תאי אנדותל (ראה טבלה של חומרים של נוגדנים ספציפיים השתמשו) (איור 1A, D, ו- E). ברזולוציה זו אפשרי להבחין את התהליכים הנפרדים astrocytic והרגליים סוף-הנמצאים במגע ישיר עם נימים.

כדי להבליט את התאמתו של פרוטוקול זה לגילוי מבנים תאיים, סעיפים מוח מחיות שמעניינת הזריק ה נוגדן mAb86 אנטי-טאו אנושית16 היו מוכתמים של נוגדנים נגד fluorescently שכותרתה ( איור 1B). mAb86 ידוע במיוחד היעד נוירונים המבטאות צורה פתולוגית של טאו16. MAb86, באמצעות הפרוטוקול המתואר במסמך זה זוהה עם רזולוציה עקיפה-מוגבלת בתוך מבנים vesicular בודדים בתוך הנוירונים (איור 1בג). בנוסף, העכבר אנדוגני IgG זוהה מבנים תאיים בתוך תאי אנדותל אך לא pericytes (איור 1D-E ואיור 2).

רכישת ברזולוציה גבוהה קונאפוקלית z-ערימות של להערכת המוח מאפשר פילוח תלת מימדי של נימים ושלפוחיות תאיים-BBB. איור 2 מציג דוגמה של התהליך של עיבוד הממיין של נימי בלוחיות הסבר CollagenIV ועכבר IgG חיובי תאיים שלפוחית. מאת לכימות dataset מלא תמונות מקוטע, לדוגמה על ידי מדידת מספר שלפוחית לכל אמצעי אחסון נימי, זה אפשרי ללמוד שינויים תאיים תחבורה תהליכים בתנאים שונים. איור 3 בג מציג את ההבדלים בעוצמתם mIgG שלפוחית פלורסצנטיות ומספר המתייחס mIgG-parenchyma המוח, בהתאמה, על המחסור pericyte במודל עכבר pdgf-bret/ret כפי שדווחה בעבר 17. אותה גישה גם לאחרונה השתמשו כדי לנתח את השינויים בהעברה תאיים-BBB בין אזורים שונים במוח18.

figure-results-1
איור 1: Labelling של מספר סוגי תאים ומבנים subcellular של נוירו-וסקולריים ההוראה תמונות נציג של יחידת נוירו-וסקולריים (A ו- D), שלפוחית תאיים הכלול בתוך הנוירונים (B) או תאי אנדותל (E) שהושג עם פרוטוקול זה. העוצמה המקסימלית ההקרנה התמונה ב- A (למעלה) מציג את ההפצה של GFAP-חיוביות האסטרוציטים (אדום) סביב נימים מתויג מאת CollagenIV (ירוק). חצים להצביע על תהליכים astrocytic בודדים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. ברזולוציה זו, תהליכים בודדים אסטרוציט ו סוף-כפות רגליים הם נראים בבירור, כפי שמוצג בתמונה מוגדלת של האזור מסגרת (למטה). ראשי חץ הצבע על הקצה astrocytic-מטר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. בתמונה B מראה ההצטברות של נוגדן המוזרק באופן עקיף, mAb86 (ירוק), בתוך נוירון בהיפוקמפוס. ראשי חץ הצבע שלפוחית mAb86-חיוביים בודדים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. גרף ג' מציג את עוצמת פרופיל שורה שלפוחית יחיד. גודל שלפוחית הוערך מ לכל רוחב חצי מקסימום של התאמה לפי עקומת גאוס (קו שחור מוצק) של עקומת העוצמה (הקו הירוק, עיגולים). התמונות ב- D מראים שחזור תלת מימדי של (ירוק) תא אנדותל מוקף של pericyte (אדום) בתוך הנדן הבזליים (CollagenIV, אפור). הלוחות התחתון הצג את הערוצים פלורסצנטיות בודדים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. התמונות ב- E הראה הלוקליזציה של mIgG (אדום) בתאיים שלפוחית בתוך תאי אנדותל (משמאל לוח, CD31 בירוק) אבל לא בתוך pericytes (לוח נכון, CD13 בצבע ירוק). כל התמונות, דאפי צבעונית גרעינים מוצגים בכחול. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לוחות D ו- E שונו מן ההפניה17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2 : עיבוד תלת מימדי של נימים ושלפוחיות תאיים-מחסום הדם - מוח. עם הפרוטוקול המתואר, תמונות וידאו ברזולוציה גבוהה של נימים CollagenIV-חיוביות (ירוק) ועכבר IgG תאיים שלפוחית (אדום) היו רכשה (A). החלונית השמאלית מציגה את מקטע אופטי יחיד עם חתכים. החצים הצבע שלפוחית mIgG-חיוביים בודדים בתוך תאי אנדותל המוח. החלונית ' ' על שחזור מראה נכון 3D של z-מחסנית מלאה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים). נימי נפח (B) ושלפוחיות בודדים (ג) היו מעובד בשלושה ממדים, לכמת באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים). כל התמונות, דאפי צבעונית גרעינים מוצגים בכחול. גודל ברים = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3 : כימות של לוקליזציה תאיים mIgG ב BBB. להחליפן בתמונות מציג שחזורים תלת מימדיים (A) של נימים (בלוחיות הסבר collagenIV, ירוק) והפצה של mIgG (אדום), ב- C57BL/6 עכברים וב - pdgf-bret/ret pericyte דלה עכברים שתואר קודם לכן ב-19. גודל ברים = 10 מיקרומטר. התמונות ב- B הצג את פילוח של שלפוחית תאיים בתוך המסיכה CollagenIV. The גרף ב' מציגה את כימות השוואה של מספר שלפוחית mIgG לכל אמצעי אחסון של נים. כל נקודה מייצגת מדידות של מקטעים בודדים נימי. הקו המלא מציג את הממוצע של קווי השגיאה ומייצגים את סטיית התקן של הנתונים. התמונות ב- C הצג mIgG אות פלורסצנטיות מחוץ המסכה CollagenIV. באופן דומה, גרף ג' מציגה את כימות השוואה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית mIgG ב- parenchyma המוח בין עכברים C57BL/6 pdgf-bret/ret עכברים pericyte דלה. יחידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית היו מנורמל על ידי עוצמת parenchyma mIgG ממוצע נמדד כל העכברים C57BL/6. דמות זו שונתה מן ההפניה17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

פרוטוקול שפורטו לעיל מתאר את ההכנות של מקטעים לתרשים המוח, צביעת immunofluorescent, ייבוא תמונות ניתוח הפרמטרים מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של BBB. בשיטה זו נעשה שימוש לאחרונה לחקור הלוקליזציה של נוגדן משלוח פלטפורמות3, התעבורה של IgG אנדוגני על פני ה-BBB17, והטרוגניות של BBB על אובדן pericyte18. שלבים שונים בפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים למטרה ספציפית של הניסוי. ראשית, השימוש של מקטעים (100 מיקרומטר) עבה מקלה על טיפולם במהלך ההליכים immunostaining, הרכבה. זה גם מאפשר שחזור תלת-ממד של הרשת נימי, יחידת נוירו-וסקולריים, ועל הדור של נימי וחתכי NVU. אולם, חדירה של נוגדנים בתוך המקטעים רקמות עשוי להשתנות, צביעת נוגדנים מסוימים יכול להיות מוגבל לשכבה שטחית של הרקמה קרוב coverslip. ניתן לשנות את הפרוטוקול על ידי הגדלת הריכוז של דטרגנט במהלך השלב permeabilization ו/או את אורך הצעד permeabilization כדי לשפר את הנוגדן חדירה לתוך הרקמה. שנית, איכות התמונה אולי התגלה כאשר מנסים לרכוש תמונות עמוק בתוך הרקמה (בד כ 20 עד 30 מיקרומטר מתחת לפני השטח) בשל פיזור אור, כמו גם סטייה אופטית של אי-התאמה של שבירה. כדי להתגבר על בעיה זו, ניתן לשלב שיטות חדשות עבור ניקוי רקמות ונוגדנים פעילים חדירה20 עם פרוטוקול זה כדי אחסון גדולים יותר תמונות של רקמה. שלישית, deconvolution מתבצע לאחר ייבוא תמונות כדי לשפר את הרזולוציה צירית של התמונה. הבחירה של האלגוריתם deconvolution עיוור בשימוש פרוטוקול זה היה מבוסס על (i) קלות השימוש, כפי אין חישוב מראש של הפונקציה בנקודה-התפשטות נדרשת, (ii) שלה חוסן לשיפור איכות התמונה21, ו- (iii) חוסר חפצי אמנות ב- mIgG מבנים תאיים לאחר יישום. בהתאם המבנים תאיים דמיינו במדגם, אלגוריתמים deconvolution אחרים עלולים לגרום איכות תמונה גבוהה יותר. 21,הפניות הבאות22 מספקים דיון מקיף היתרונות ואת המגבלות של אלגוריתמים נוספים deconvolution התמונה. לבסוף, השימוש של חבילת התוכנה של ניתוח תמונה מותרת את פילוח של נימים ומבנים תאיים בשלושה ממדים. בבירור וניתוח תמונות אינה מוגבלת התוכנה תיאר את הפרוטוקול ואת חבילות חלופיים, לדוגמה אלה דנו הפניה23, יכול לשמש לתמונות מקטע. ההתאמה של תוכנות שונות לניתוח של מבנים תאיים על פני BBB צריך לאמת מדעית על-ידי הערכת הדיוק של סגמנטציה.

מאז בשיטה זו מבוסס על דגימות קבוע, הוא אינו מספק מידע ישיר על הדינמיקה של transcytosis על פני BBB. עם זאת, ניתן לשלבו עם הזמן-קורס ניסויים24, לדוגמה על-ידי הזרקת המולקולה עניין ומדידת שלה הצטברות בתוך בקס בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה, לשחזר את קינטיקה של דרך הווריד תחבורה תאיים. היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת לניתוח של אזורים מוחי עמוק, כפי שמוצג18, אשר אינם נגישים כעת גישות intravital הדמיה בשידור חי. שלב קריטי במהלך הפרוטוקול הוא פיקוח קפדני על קיבוע הרקמה. קיבוע עם 4% PFA מפחיתה באופן דרמטי את immunogenicity של organelles תאיים ושל immunoglobulins אנדוגני או המנוהלת באופן עקיף17 (איור 1B). מגבלה של פרוטוקול זה היא הדרישה שלו באיכות גבוהה נוגדנים (קרי, צביעת שאינם ספציפיים נמוך, נמוך אשיג) מתאים immunofluorescence. ובלבד ריאגנטים כאלה זמינים, ניתן להחיל את שיטת לחקור לוקליזציה תאיים של חלבון בכל עניין. לדוגמה, הפרוטוקול שימש לזיהוי lysosomes המוח תאי אנדותל17. בנוסף יש לציין כי מאז פרוטוקול זה מבוסס על מיקרוסקופיה קונפוקלית, הרזולוציה לרוחב מוגבל על ידי עקיפה, אין אפשרות לזהות מבנים קטנים יותר כ 175 ל-250 ננומטר (איור 2).

מחקרים קודמים יש לבצע ניתוח מפורט של הרכב הסלולר של יחידת נוירו-וסקולריים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית25,26. עם זאת, חוקרים תחבורה תאיים-BBB מסתמך בעיקר על השימוש הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים19,27,28. שיטה זו מציעה לרוחב הרזולוציה הגבוהה ביותר של מבנים תאיים, מיקרוסקופ אלקטרונים נותר טכניקה מאתגר עם תפוקה נמוכה. יתר על כן, מספר מטרות מולקולריות שונות אשר ניתן לאבחן על ידי EM מצומצמת מאוד. פרוטוקול זה מציע חלופה נגישה לחקור תחבורה תאיים-BBB. הנוהל המלא, מאוסף המוח כדי ניתוח תמונות, ניתן לבצע 5 עד 6 ימים. אם נוגדנים המתאימים זמינים, immunofluorescence מאפשר זיהוי בו זמנית של מספר תאים סוגים/מולקולות בתוך באותה דגימת זרע. יתר על כן פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם סופר-רזולוציה טכניקות במיקרוסקופ כדי להתגבר על המגבלות רזולוציה מרחבית29. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר כימות של שינויים תאיים לוקליזציה של חלבונים עניין בתוך יחידת נוירו-וסקולריים. היישום שלה על שונות גנטית או תרופתי לפליטת יאפשר חוקרים את הפונקציות מבנה ותעבורה תאיים של ה BBB ויוו.

גילויים

מחברים הם תחת עבודה בשכר על ידי רוש.

תודות

קראוון עבודה נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט רושה (2014-2017).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שיבוט נוגדן חד שבטי של חולדה ER-MP12 כנגד CD31/PECAMNovus BiologicalsMCA2388Labels תאי אנדותל במוח
השתמש בדילול 1:100
לזהות עם חמור פוליקלונלי אנטי-חולדה IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן חד שבטי חולדה נגד PodocalyxinR& D SystemsMAB1556תוויות לומן של נימים
השתמש בדילול 1:100
לזהות עם חמור פוליקלונלי אנטי חולדות IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי ארנב נגד CollagenIVBiotrendBT21-5014-70תוויות קרום בסיס של נימים
השתמש בדילול 1:100
לזהות עם IgG אנטי-ארנב רב-שבטי של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, משמש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי עז כנגד CD13R& D SystemsAF2335תוויות pericytes
שימוש בדילול 1:100
זיהוי עם IgG פוליקלונלי נגד עזים של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
שיבוט נוגדן חד שבטי של עכבר G-A-5 כנגד GFAP בשילוב עם Cy3Abcamab49874תוויות אסטרוציטים
שימוש בדילול 1:100
נוגדן רב-שבטי ארנב נגד Iba-1Wako019-19741תוויות מיקרוגליה
שימוש בדילול 1:100
זיהוי עם חמור פוליקלונלי אנטי-חולדה IgG (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, המשמש בדילול 1:400
נוגדן חד שבטי של חולדה ABL93 gainst LAMP2Fitzgerald10R-CD107BBMSPתוויות ליזוזומים
השתמש בדילול 1:100
זיהוי עם IgG פוליקלונלי נגד חולדות של חמור (H+L) יחד עם צבע AlexaFluor מתאים, משמש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי של חמור נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor594LifeTechnologiesA21203שימוש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי של חמור נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor488LifeTechnologiesA21202שימוש בדילול 1:400
נוגדן רב-שבטי עז נגד עכבר IgG (H+L) AlexaFluor555LifeTechnologiesA21422שימוש בדילול 1:400
נייר סינוןSigma-AldrichWHA10334347Whatman נייר סינון איכותי קפל מראש
כיתה 0858 1/2,
דבק ציאנואקרילטרוט קארל258.1רוטי קול 1
מדיום הרכבה פלואורסצנטיDakoS3023Dako פלואורסצנטי הרכבה בינונית
עכברים בוגריםמעבדת ג'קסון000664C57BL/6J זכר או נקבה עכברים
בין גיל 9 ל-19 חודשים
VibratomeLeica Biosystems14047235612Leica VT100S להב רוטט מיקרוטום
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקליLeica MicrosystemsNALeica TCS SP8 X עם גלאי HyD
ולייזר אור לבן
תוכנת עיבוד תמונהLeica MicrosystemsNALeica Application Suite AF גרסה 3.1.0 לבנות 8587
תוכנת ניתוח תמונותBitplane תוכנה מדעיתNAImaris גרסה 7.6.5 לבנות 31770 עבור x64
Fluorescence SpectraViewerThermoFisher ScientificNAhttps://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science
/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
מגורען

מקורות

  1. Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
  2. Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
  3. Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  4. Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154(2014).
  5. Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
  6. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  7. Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
  8. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340(2014).
  9. Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990(2015).
  10. Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
  11. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
  12. Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
  13. Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
  14. Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  16. Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
  17. Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658(2016).
  18. Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
  19. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  20. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  21. Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
  22. Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
  23. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  24. Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
  25. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  26. Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  27. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  28. Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
  29. Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.