הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

6.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56411

⸱

9 בנובמבר 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

תקציר

כימוטקסיס, או העברה את הדרגה של chemoattractant, הוא מצב הבין בצורה הטובה ביותר של ההעברה מכוונת. מחקרים באמצעות אמבה חברתית Dictyostelium discoideum גילה כי מורכבות האות התמרה חושית רשת של מסלולים מקבילים מגביר את התגובה chemoattractants, מוביל פלמור אקטין משוחד בליטה של פסאודופוד ב הכיוון של מעבר צבע. לעומת זאת, המנגנונים המולקולריים נהיגה סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, לדוגמה, עקב חשיפה להטיית זרימה או שדות חשמליים, לא ידועים. הרגולטורים רבים כימוטקסיס התערוכה לוקליזציה המובילים או לקרטע קצה תא נודדים, כמו גם להציג שינויים חולף לוקליזציה או הפעלת בעקבות גירוי גלובלית עם chemoattractant. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של סוגים אחרים של ההעברה מכוונת פיתחנו שיטה המאפשרת בחינת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני המבוסס על חשיפה קצר (2-5 s) להטיית זרימה. יכול להיות מועברת לגירוי הזה בערוץ תוך הדמיה תאים המבטאים שכותרתו fluorescently ביולוגיים לבחון התנהגות תא בודד. בנוסף, האוכלוסייה התא יכול להיות מגורה צלחת, lysed, ו immunoblotted באמצעות נוגדנים לזהות גירסאות פעיל של חלבונים עניין. על ידי שילוב שני מבחני, ניתן לבחון מגוון רחב של מולקולות מופעל על ידי שינויים לוקליזציה subcellular ו/או זירחון. בשיטה זו אנו נקבע כי גירוי מכני חריפה מפעיל הפעלה של התמרה חושית האות chemotactic ורשתות שלד התא אקטין. היכולת לבחון תגובות תאית חריפה גירוי מכני חשוב להבנת האירועים ייזום הכרחי עבור גזירה זרימה-induced תנועתיות. גישה זו מספקת גם כלי לימוד chemotactic האות התמרה חושית הרשת ללא השפעת מבלבלים הקולטן chemoattractant.

מבוא

ההעברה של התאים האיקריוטים מוטה על ידי רמזים כימיים מגוונים בסביבה, לרבות מעברי צבע של chemoattractants מסיסים או מאוגד המצע, נוקשות משתנה של מצעים, שדות חשמליים או הטיה זרימה. אמנם היו הרבה התקדמות בהבנתנו המנגנונים המולקולריים נהיגה כימוטקסיס, פחות ידוע על סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, כמה אותות אלה מגוונים משולבים ברמה התאית לייצר מאוחדת נודדות תגובה.

ביים ההעברה לכיוון הגדלת ריכוז chemoattractant כוללת שלושה מרכיבים התנהגותיים: תנועתיות כיוונית חישה, קטביות1. תנועתיות מתייחס לתנועה אקראית של תאים מושגת על ידי בליטה pseudopod. כיוונים חישה היא היכולת של תא כדי לזהות את מקור chemoattractant, אשר יכול להתרחש אפילו באופן מתאושש תאים. קוטביות מתייחס ההתפלגות סימטרית יציבה יותר של רכיבים תאיים בין המוביל לבין לקרטע קצה תא, מה שמוביל התמדה מוגברת בתנועה.

תגובה תאית chemoattractant תלוי הפעילות של ארבע רשתות בקרה רגולטריות שהוגדר מושגית: קולטן / גרם חלבון, אותות, שלד התא אקטין, קוטביות1. Chemoattractant מחייב לקולטן G-חלבון בשילוב משדר את האות דרך heterotrimeric גרם חלבונים α וβγ לרשת התמרה חושית האות במורד הזרם, אשר מגביר את האות כיוונית. משעולים מרובות בתוך הרשת התמרה חושית אות לפעול במקביל, להאכיל לתוך הרשת שלד התא אקטין פלמור אקטין הסטייה ולאחר חדירת pseudopod הסוגר, בכיוון של מעבר הצבע. חשוב סמביוזה כימוטקסיס נמנים GTPase בראס, TorC2, phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) homolog פוספטאז ו- tensin (PTEN), guanylyl cyclase. מנגנוני משוב בתוך הרשת התמרה חושית אות ובין אותות לבין אקטין שלד התא רשתות נוספות להגביר את התגובה. בסופו של דבר, הרשת קוטביות מוגדרת היטב מקבל קלט שלד התא אקטין, בהמשך biases האות התמרה חושית הרשת כדי לקדם את ההעברה מתמיד בכיוון של מעבר הצבע.

הרבה הבנתנו מכניסטית כימוטקסיס התאפשרה בשל התפתחות מתויג fluorescently ביולוגיים עבור רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות. הרגולטורים כימוטקסיס רבים יש של התפלגות סימטרית של המולקולה הרגולציה עצמה או הפעילות שלה. לדוגמה, ביולוגיים מזהה הופעלה גרסאות GTPases ראס קטן ולא Rap1 – ראס מחייב תחומים של Raf1 (המכונה "rbd" כאן), RalGDS, בהתאמה – בתרגום כדי בחוד החנית של2,תא chemotaxing3. באופן דומה, PI3K ו phosphatidylinositol המוצר שלה (3,4,5)-טריפוספט (PIP3), המוכר על ידי תחום הומולוגיה (PH) pleckstrin, גם להראות לוקליזציה בחזית תא4,5. לעומת זאת, PTEN 3-פוספטאז, אשר ממירה PIP3 בחזרה אל phosphatidylinositol (4.5)-bisphosphate, רגישה לקצה לקרטע תא6. חשוב, ביולוגיים אלה לשנות שלהם לוקליזציה בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant. הקצה המוביל סמנים, אשר cytosolic או על קצות בליטות בתא resting, relocalize אל קליפת המוח, ואילו מפגרות סמני קצה, אשר לוקליזציה קורטיקלית נעדרים מכל קצות בליטות בתא resting, הופכים cytosolic לאחר גירוי. ניתוח של התפלגות ביוסנסור בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant ממזער את התרומה של תנועתיות, קוטביות, אשר פעמים רבות וחיסול התצפיות. גירוי גלובלי או אחיד של השעיה תא עם chemoattractant משמש גם ככלי להערכת שינויים ברמת האוכלוסייה בהפעלת חלבון, לעיתים קרובות זוהה על ידי חלבון זרחון7,8,9 . Assay הביוכימי זה משמש בעיקר כדי להשיג מידע זמני, ואילו מיקרוסקופ משמש לאיסוף מידע זמני והן מרחבי על התנהגותם של רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות.

התמרה חושית אות הרשת משלבת תכונות של מערכת טמפרמנט10,11. תגובות לגירויים chemotactic העל-סף "all-or-none", להציג תקופות עקשן. תגובות מופעלות גם stochastically, יכול להראות התנהגות מתנדנדות. האות התמרה חושית אירועים הם נקודתיים לאזורים של קליפת המופצות גלים12,13,14,15. קדימה או אחורה, סמני את הנישה, או מביצועם מתוך, האזורים הפעילים של הגלים כציוד. בשל האזור עקשן נגררים אזור פעיל, הגלים מכוון הפוך להשמיד כאשר הם נפגשים. הגלים התמרה חושית אות כציוד ביסוד בליטות הסלולר המתווכות תא העברה10.

חלק גדול מהמידע הנ על כימוטקסיס הופיע במחקרים אמבה חברתית Dictyostelium discoideum, למרות מנגנונים רגולטוריים דומים חלים גם נויטרופילים, אחרים בתרבית של תאים סוגים16 . Dictyostelium הוא אורגניזם מודל ומבוססת שיש תגובה chemotactic חזקים במהלך רעב, כאשר אלפי תאים בודדים נודדים לכיוון מרכז צבירה, בסופו של דבר יוצרים גוף fruiting multicellular המכיל נבגי. כימוטקסיס חיוני גם בשלב הצמיחה תא בודד של האורגניזם לאיתור מקורות המזון חיידקי. חשוב, נדידה של תאים בודדים Dictyostelium דומה להפליא ההעברה. בתרבית של נויטרופילים או תאי סרטן גרורתי, אשר כולם עוברים העברה מסוג amoeboid מהירה מאוד. למעשה, שני הטופולוגיה הכוללת של רשתות רגולטוריות, כמו גם רבים מן המסלולים התמרה חושית אות בודדת מעורב כימוטקסיס נשמרים בין Dictyostelium בתרבית של לויקוציטים17. יתר על כן, תאים אחרים, כגון fibroblasts, להשתמש קולטן טירוזין kinases (RTK) במקום GPCRs; עם זאת, RTKs עשויים להאכיל לתוך רשתות דומות.

בניגוד כימוטקסיס, הבנה מעמיקה של המנגנונים איתות כי הכונן מצבי שונים של הגירה מכוון לוקה בחסר. בדומה לתאים בהעברה של מעבר הדרגתי chemoattractant מספר מחקרים דיווחו על הפעלה ו/או לוקליזציה של סמנים הקצה המוביל טיפוסי, כולל פלמור אקטין, PIP3 ו/או חוץ-תאית מוסדר אות קינאז (טיפשה) 1/2, ב הקדמי של תאים שעברו ביים ההעברה בתגובה להטיה זרימה או שינוי שדות חשמליים18,19,20,21. עם זאת, במחקרים אלה חשיפה מתמשכת הגירוי הביאה גם נדידת תאים, להשאיר פתוחה את השאלה אם, לדוגמה, הסימונים הקצה המוביל לשפה במיוחד בתגובה לגירוי, או אם הם פשוט להתאים לשפה בחוד בשל עלייה במספר pseudopods בחזית תא נודדים.

פיתחנו מבחני ומאפשרים לנו להתבונן התגובה של התאים חריפה ההפרעות מכני נמסר הטיה זרימה הן ברמת האוכלוסייה וכן תאים בודדים22. דומה גירוי גלובלית עם chemoattractant, stimula חריפהtion בתזרים הטיה מאפשר חקר תגובה תאית גירוי מכני ללא התרומה מבלבלים תנועתיות או קוטביות. שילוב של מבחני הביוכימי, מיקרוסקופית אלו עם לפליטת גנטית או תרופתי מאפשר לנו ללמוד על גירויים מכניים איך נתפסים משודר. יתר על כן, גישה זו מספק גם שיטה עבור הקשה לתוך המערכת במורד הזרם של הקולטן chemoattractant בהיעדר chemoattractant, ובכך לבודד את האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות מ הקולטן/G רשת חלבון.

תוך שימוש בטכניקות המתוארות להלן אנו לאחרונה הפגינו שגזירה חריפה הזה מוביל הפעלה של רכיבים מרובים של chemotactic האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא רשתות22. על-ידי החלת את הגירוי המכני חריפה במרווחי זמן שונים, להדגים, באופן דומה כדי chemoattractants, תגובה לגירויים מכני מפגין גם תכונות של מערכת טמפרמנט, כולל ההתנהגות all-or-none של התגובה תחת קולח תנאים ואת נוכחותם של תקופה עקשן. בסופו של דבר, על ידי שילוב של גירוי מכאני וכימי הראינו כי שני הגירויים לשתף האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות, המאפשרים סביר לשילוב של גירויים מרובים כדי נדידת תאים הסטייה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ההכנה של פתרונות

  1. מדיה להכין HL-5 באמצעות הפעולות הבאות: 10 גרם/ליטר דקסטרוז, peptone proteose 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 g/L, 0.965 g/L נה 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 g/L ח' 2 פו 4,, אלא אם צוין אחרת, סטרפטומיצין 0.03 נקודות g/L במים יונים. אוטוקלב המדיום וחנות בטמפרטורת החדר.
    הערה: עקב ההבדלים בין peptone proteose תמצית שמרים שנרכשה מן הספקים השונים, כמו גם בין קבוצות בודדות, ה-pH של המדיה ייתכן שיהיה צורך ניתן לכוונן את טווח טיפוסי של 6.4 ל 6.7.
  2. SM להכין צלחות באמצעות הפעולות הבאות: 10 גרם/ליטר דקסטרוז, peptone 10 גרם/ליטר, 1 g/L שמרים תמצית, 2.31 g/L ח' 2 PO 4, 1 g/L K-2-HPO-4 ו- 20 g/L אגר במים יונים. אוטוקלב, מגניב, ויוצקים 30 מ של הפתרון אגר לכל ס מ-10 צלחת פטרי. לאחר אגר מתמצק, אחסן את הצלחות ב 4 ° C עד כחודש.
  3. הכן 10 x באמצעות מאגר פוספט (PB) 13.4 g/L נה 2 HPO 4 ·7H 2 O ו- 6.8 g/L ח' 2 PO 4 במים יונים. לאחסן את המניה 10 x 4 ° C. Dilute עד 1 x עם מים יונים לשימוש.
  4. להכין מאגר DB מאת שכשהם 1 X חמאת בוטנים עם 2 מ מ MgSO 4 ו- 0.2 מ מ CaCl 2.
  5. הכן קפאין 100 מ מ במים יונים. חנות − 20 ° C
  6. להכין 100 מ מ מחנה פתרון מניות על ידי המסת monohydrate מלח נתרן המחנה במים יונים. הכן של 1 מ מ עובד מלאי במים יונים. לאחסן שני פתרונות מניות-− 20 מעלות צלזיוס. הכן המחנה הפתרון הסופי-הריכוז הרצוי ב- DB ביום של הניסוי-
    הערה: מלאי פתרונות ניתן להקפיא הקרת כמה פעמים.
  7. הכן חומצה פולית 25 מ מ ב- 1 x PB. מוסיפים כמה טיפות 1 N NaOH עד האבקה מתמוסס לחלוטין. חנות − 20 ° C
  8. להכין מאגר מדגם x 3, באמצעות הפעולות הבאות: pH מ מ 187.5 טריס-HCl 6.8, 6% (w/v) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), 30% גליצרול, 126 מ מ dithiothreitol, bromophenol 0.03% (w/v) כחול. Aliquot, בחנות − 20 מעלות צלזיוס
    1. מראש להשתמש, להפשיר באמבט מים 37 ° C ולהמשיך להכין מאגר מדגם עם מעכבי פרוטאז, פוספטאז על-ידי דילול 3 x דוגמת המאגר ל- 1 x, והוספת 50 מ"מ NaF, 2 מ מ נה 3 VO 4, 25 מ מ נתרן רב-תכליתי, ו- 1 x מלאה ללא EDTA פרוטאז מעכב קוקטייל במים יונים. הוסף את מעכבי מיד לפני תחילת ההליך המתואר צעדים 3.1.2-3.1.3.
  9. להכין 5 מ מ Latrunculin A פתרון דימתיל סולפוקסיד. Aliquot, בחנות − 20 מעלות צלזיוס

2. הכנה של תאים discoideum ד

הערה: לשמור על תאים discoideum ד בתקשורת HL-5 או תרביות רקמה צלחות או ההשעיה התרבות כפי שצוין בעבר תיאר 23. בעת הצורך, התמרת תאי עם fluorescently-ידי ביולוגיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים אלקטרופורציה 24. שונים זנים discoideum ד, כמו גם פלסמידים קידוד ביולוגיים או אחרות הגנים של עניין ניתן לקבל ממרכז המניות של Dicty (dictybase.org).

  1. וצמיחה של אוסף תאים וגטטיבי discoideum ד
    1. לניתוח של תאי צמח, גדל התאים בנוכחות חיידקים כדי להפחית את מספר macropinosomes, אשר בדרך כלל הם נצפו תאים שגודלו axenically 25.
      1. הכן תרבות של קלבסיאלה aerogenes על ידי מזריקים מספר קטן של תאים מניה גליצרול או תרבות קודמות לתוך האחסון הרצוי של מדיום HL-5 ללא אנטיביוטיקה. דגירה התרבות חיידקי על שאכר מסלולית-200 סל ד (0.42 x g) בטמפרטורת החדר (20-22 מעלות צלזיוס) עבור ה 16-18
        הערה: K. זן aerogenes המשמש כאן הוא פתוגניים שאינם (ראה הטבלה של חומרים).
    2. לאסוף discoideum ד בשלב הגידול האקספוננציאלי תרביות רקמה צלחות או מתרבות ההשעיה, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer על פי היצרן ' s הוראות. מורחים 1 x 10 5 ד discoideum תאים עם 260 ההשעיה ק' aerogenes µL בצלחת SM. הפעל את הצלחת הפוכה למטה למחרת. לגדל תאים בטמפרטורת החדר עד התאים discoideum ד להתחיל לנקות את הדשא חיידקי, אבל לפני שהם מתחילים צבירה (~ 36-48 שעות).
    3. לאסוף תאים discoideum ד במאגר 5 מ ל DB על ידי גירוד אותם עם מפזר הזכוכית. העברת תאים צינור פוליפרופילן 50 מ. יש לשטוף את הצלחת עם עוד 5 מ ל DB מאגר ובריכה עם ההשעיה המקורית. למלא את הצינור כדי 50 מ עם מאגר DB.
    4. צנטריפוגה המתלה discoideum ד ב g 360 x עבור 3-4 דקות וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 50 מ ל DB מאגר. חזור על השלבים כביסה עד תגובת שיקוע לנקות (שוטף ~ 3-4). Resuspend בגדר התא האחרון במאגר DB כדי צפיפות הסופי של 5 ~ x 10 6 תאים למ"ל.
  2. הכנה של מצבור-תאים המוסמכת discoideum ד
    1. פיתוח discoideum ד תאים על ידי הרעבה 1 h ואחריו 4 שעות של הרעבה, הפועמים עם 50 ננומטר מחנה כל 6 דקות על פי תקן תקנות 23.
    2. בעקבות התפתחות, למדוד את עוצמת הקול הסופי של השעיה תא.
    3. מבוסס על המספר הראשוני של התאים המשמש לפיתוח, לחשב תא צפיפות של התליה האחרון.
      הערה: אם מחנה תימסר כרכים µL 100 לכל 6 דקות, נפח התאים מגדילה 1 מ"ל לכל שעה הפועמים המחנה. לפיכך, עבור התנאים רגיל באמצעות תאים 7 8 x 10 מ 4 ל DB, אחרי 4 שעות של פיתוח אמצעי האחסון הסופי הוא 7 mL ואת צפיפות תא הסופית היא ~1.1 x 10 7 תאים למ"ל.

3. ניתוח הביוכימי של התא התגובה מכנית או גירוי כימי

תאים
  1. חריפה מכני גירוי של תאים ואחריו פירוק התא
    1. צלחת 2 x 10 6 צבירת-מוסמך (מתוך שלב 2.2) לאחר 4 שעות של פיתוח במנות 35 מ מ עם 2 מ ל DB. לאפשר את התאים לצרף 10 דקות בטמפרטורת החדר. רחץ תאים פעמיים עם 1 מ ל DB. דגירה תאים ב- DB עם 2.5 מ"מ קפאין למשך 30 דקות ללא כל הפרעה הלוחיות.
      הערה: אם התאים צריכים להיות מטופלים עם מעכב תרופתי, להוסיף ריכוז הרצוי של מעכב או באותו אמצעי אחסון של הרכב המתאים במהלך basalation עם קפאין.
    2. כדי להחיל גירוי מכני, למקם את הצלחת (אחד בכל פעם) תפקודי לב / נשימה ולהדליק מייד ב 150 סל ד (0.24 x g) עבור 5 ס
      הערה: הצלחת יכול גם להיות באופן ידני מגורה על ידי התנועה באופן cross-wise כ 5 ס
    3. וביופסיה המאגר הצביעו פעמים לאחר תחילת הגירוי. מיד lyse בתאים על-ידי הוספת 100 מאגר מדגם µL עם מעכבי פרוטאז, פוספטאז.
    4. למקם את הצלחת על קרח, ולאסוף את lysate לתוך צינור 1.5-mL. עבור ' זמן 0 ', lyse התאים מבלי לרעוד. העברת הצינורות גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות מיד לאחר פירוק. להמשיך עם immunoblotting או לאחסן lysates ב-20 מעלות צלזיוס
  2. גירוי של תאים עם Chemoattractant
    1. Basalate תאים צבירת-המוסמכת לאחר 4 שעות של פיתוח על ידי במהירות בטילטול בנוכחות קפאין 5 מ מ- 200 סל"ד (0.42 x g) על תפקודי לב / נשימה למשך 30 דקות.
      1. צנטריפוגה התליה תא ב- 360 x g עבור 3-4 דקות וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 10 מ"ל מאגר DB קר כקרח. חזור על השלב כביסה.
    2. Resuspend בגדר התא האחרון במאגר DB כקרח כדי צפיפות הסופי של 4 x 10 7 תאים למ"ל לפי מספר התא הראשוני השתמשו לפתח את התאים (ראה שלב 2.2). לשמור על התליה תא על הקרח לפני stimulהתקדמ.
      1. µL 50 פיפטה של 10 מיקרומטר למחנה או הרכב לתוך כוס פוליסטירן מונחת תפקודי לב / נשימה.
    3. כדי לגרות את התאים, להוסיף µL 450 של התליה תא קר כקרח מאותה הכוס ולפנות מיד ניעור ב 200 סל"ד (0.42 x גרם). At במועדים שונים לאחר תחילת הגירוי (למשל 10, 30, 45, 60, 120 s) בקצרה לעצור ניעור, להוציא 50 aliquots µL תא השעיה, lyse בתאים על-ידי הוספת אותם צינורות 1.5 mL המכיל 25 µL 3 X דוגמת המאגר.
      1. על ' זמן 0 ', השתמש תאים מן התליה תא קר כקרח unstimulated.
        הערה: הטמפרטורה הסופי של התליה תא במהלך גירוי היא ~ 9 ° C 26. בתנאים אלה התגובה שיא מתרחשת מעט מאוחר יותר שיא נצפתה לגירוי לבצע בטמפרטורת החדר (לדוגמה, גירוי chemoattractant של תאים חסיד על המיקרוסקופ, או גירוי מכני של תאים חסיד).
    4. להעביר הצינורות גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות מיד לאחר פירוק. להמשיך עם immunoblotting או לאחסן lysates ב-20 מעלות צלזיוס
  3. ניתוח של התא תגובה Immunoblotting
    1. רוץ lysates (מן השלבים 3.1.3 או 3.2.4) ב 4-15% טריס-HCl לזיהוי ג'ל, להעביר polyvinylidene פלואוריד ממברנה בלוק, immunoblot עם פוספו-PKC אפי Thr410 (כדי לזהות פוספו-PKBR1 ופוספו-PKBA). לזהות את האות על ידי דגירה עם חזרת מצומדת peroxidase ארנב אנטי משני נוגדן, ואחריו chemiluminescence באמצעות chemiluminescence משופרת המצע.
    2. לצורך זיהוי של מספר חלבונים, להסיר את האבן החשופה עם מאגר הפשטת ולאחר בדיקה מחדש עם נוגדן ראשוני נגד פוספו-p42/44 MAPK Thr302/304 (כדי לזהות פוספו-ERK2). לאשר חלבון שווה טעינה על-ידי מכתימה את הקרום פלואוריד polyvinylidene עם כחול מבריק Coomassie.

4. גירוי מכני וחמורות לחיות הדמיה של תאים בודדים על המיקרוסקופ

  1. הערכה של התגובה חריפה גירוי מכני באמצעות התקן הזרימה
    1. לאסוף ו לדלל וגטטיבי או צבירת-כשיר תאים ~ 1 x 10 6 תאים/מ ל DB כפי שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, בהתאמה. לטעון ~ 600 µL לתוך השקופית עם ערוץ (ראה את הטבלה של חומר עבור פרטים). מאפשרים לתאים לצרף במשך 10 דקות לוודא כי כל פתחי הכניסה בשקופית מלאים לגמרי. למעלה למעלה עם מאגר נוסף במידת הצורך.
      הערה: השקופית מסוים המשמש לניתוח יש שלוש כניסות, אשר להאכיל לתוך ערוצי צר, 1 מ מ, אבל מכן למזג לערוץ אחד רחב, 3 מ מ. הגובה של הערוץ הוא 0.4 מ מ. למרות התאים הם מצופים לאורך הערוץ, עם תמונה רק את החלק רחב.
    2. לעבור את אחת השורות שמצורף ל מאגר 50-mL דרך השסתום הראשי של יחידת fluidic (ראה טבלה של חומרים לפרטים). באמצעות התוכנה עבור המשאבה, ודא השסתום נסגר (כלומר משמאל). למלא את האגם עם DB.
      1. לקבוע את הלחץ 50 mbar, תפעיל את זה. מילוי ולשטוף את הקו עם DB על-ידי לחיצה על השסתום כדי לפתוח אותו. להפוך את הלחץ שוב כ- 0, סגור את השסתום לאחר ~ 30 ס
    3. להתחבר לאחד פתחי הכניסה שלושה בצד אחד של השקופית הקו ללא השמנה בועות אוויר. חבר את פתחי הכניסה שני אחרים. מתחבר לקו הביוב לים יחיד בצד השני של השקופית.
      הערה: הצנרת המשמשים את השורות קלט וניקוז בהגדרת הזה יש של קוטר פנימי של 1.6 מ מ.
    4. במקום השקופית על המיקרוסקופ תחת מטרה אוויר X 20. לשטוף את הערוץ, להחליף את השסתום כדי לפתוח את הקו ולחץ " לחץ על ", להתחיל בלחץ גבוה (~ 50 mbar או ~ 40 רמות דינ/cm 2) לדחוף את הנוזל דרך לניקוז.
      1. , ברגע הנוזל שיוצא הניקוז, להפחית לחץ חיצוני לאפס (כלומר. הכבידה זורמים בלבד, ~ 15 רמות דינ/cm 2), ולהמשיך שטיפה ~ 30 ס' מתג את השסתום למיקום ההפוך כדי לעצור את הזרימה.
    5. לרכוש תמונות עם תאורה RFP או ה-GFP על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה תחת 40 X שמן המטרה במרווחי s 3. עם השסתום במצב סגור, להפעיל את הלחץ בבית הלחץ הרצוי, בדרך כלל בין 15 ל- 40 רמות דינ/ס מ 2 (0 - 50 mbar).
    6. לאחר רכישת 5 מסגרות, לספק את הגירוי על ידי מיתוג את השסתום " פתח " עמדה. לבטל את זרימת אחרי 2-5 s על-ידי החלפת השסתום בכיוון הפוך לכיוון.
      הערה: עבור ביולוגיים חלשים מסוימים (למשל PTEN, CynA ו RalGDS) זה ייתכן שיהיה צורך תאים התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 40 X שמן המטרה.
  2. בדיקה ההשפעות של מעכבי תרופתי על תגובה חריפה גירוי מכני באמצעות התקן הזרימה
    1. צלחת תאים בשקופית עם ערוץ כפי שמתואר בשלב 4.1.1. הגדרת שתי שורות: להעביר קו אחד השסתום קבלה כמו שלב 4.1.2, והשאיר השני דרך הגב שסתום. תהדק את הקו שמאל ומכניסים את השסתום " סגורה " עמדה (שמאל). למלא בשורה אחת עם DB המכיל את הרכב המתאים ביותר, והשני עם הפתרון הכולל מעכב תרופתי עניין (למשל 5 מיקרומטר Latrunculin. א).
      הערה: יש צורך פיזית תהדק את הקו שמאל כי " סגורה " מצב השמאלי פותח את השסתום לקו הזה.
    2. מילוי ולשטוף הזכות שורה על-ידי הפעלת הלחץ ב- 50 mbar ואת החלפת השסתום " פתח " עמדה (מימין). להחליף השסתום שמאלה אחרי ~ 30 ס' מילוי ולשטוף את הקו שמאל על ידי הסרת את המלחציים עבור התחברות ש ~ 30 שני הקווים שני פתחי הכניסה בצד אחד של השקופית עם ערוץ חבר לים הנותרים, להתחבר הביוב לים יחיד בצד השני. < /l אני >
    3. לרחוץ את השקופית הכוללת המאגר של הקו הנכון ולבצע גירוי במאגר אותו כפי שתואר בשלבים 4.1.3 ו- 4.1.4 לעיל.
      הערה: למרות הקו הנכון נבחר בפעם הראשונה בתוכנית התקנה זו, הצו יכול להיות הפוך.
    4. בעקבות גירוי, להחליף את השסתום כדי לפתוח את הקו הנכון בלחץ אפס (כלומר כוח המשיכה זרימה רק, ~ 15 רמות דינ/cm 2). להסיר את המלחציים מקו שמאל, להחליף את השסתום שמאלה כדי לפתוח את הקו הזה. תהדק את השורה הראשונה.
    5. לאחר הפעלת 3-5 מ של מאגר עם מעכב דרך, להחליף את השסתום ימינה כדי לעצור את הזרימה, דגירה התאים עם החומר המדכא עבור משך הזמן הנדרש (למשל 15 דקות). הפעל את הזרימה על-ידי החלפת השסתום כל מין ~ 10 ~ 15 s כדי למנוע מחסור בחמצן. חזור על גירוי עם השורה השניה.
  3. שיטה חלופית כדי להעריך בתגובה חריפה גירוי מכני באמצעות micropipette
    1. להגדיר את micropipette מלא עם DB על פי הנוהל המקובל 23. . תמשיכי ללחוץ פיצוי בבית 1,500 psi.
    2. לאסוף ו לדלל תאי צמח כפי שמתואר בשלב 2.1. מקום 25 טיפות µL של ~7.5 x 10 5 תאים למ"ל כדורים 1-ובכן, מאפשרים לדבוק לפחות 10 דקות ולכסות עם 3 מ ל DB.
    3. במקום החדר על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם מטרה שמן X 40. אתר את התאים. והורד בעדינות את micropipette לתוך באמצע שדה הראייה עד קודם שייגע בתחתית התא.
      הערה: מאז הלחץ הפיצוי נקבע בבית 1,500 Psi, התאים ללא הרף ייחשף לזרימה איטית מאוד של DB מ micropipette.
    4. מתחילים לרכוש תמונות עם תאורה RFP או ה-GFP במרווחי s 3. להחיל ' נקיים ' פונקציה לשחרר סיילין הנוזל. micropipette. המשך הדמיה אניn הנוכחות של זרימה בלחץ פיצוי לבד.
  4. שיטה חלופית כדי להעריך בתגובה חריפה גירוי מכני באמצעות תוספת מאגר בצובר
    1. לאסוף ו לדלל תאי צמח כפי שמתואר בשלב 2.1. µL מקום 20 טיפות של תאים-~ 1 x 10 6 תאים למ"ל ב DB באמצע טוב של חדר 8-. טוב. לאפשר תאים לדבוק במשך לפחות 10 דקות
    2. מתחילים לרכוש תמונות עם תאורה RFP-GFP ספציפיים או על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם מטרה X 40 במרווחי s 3. להתמקד באזור קרוב לקצה הירידה.
    3. להוסיף במהירות µL 430 של DB לצד אחד של הבאר. המשך הדמיה-
    4. לניתוח של האינטראקציה בין גירויים מכניים וכימיים, s 12 או 45 בעקבות גירוי מכני, בעדינות מוסיפים 50 µL של חומצה פולית (ריכוז סופי 20 ננומטר) או רכב (DB) ללא גרימת לתגובה מכני. המשך הדמיה-
  5. כימות של תגובה
    1. פתחו את התמונה TIFF 32 סיביות בתוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים לפרטים) 27-
    2. תחת ' נתח ', עבור אל הכרטיסיה " הגדרת המידות ". סמן את התיבה עבור ' מתכוון ערך אפור '. ודא שהקופסאות אינן נבדקות. לחץ על " אישור ".
    3. תחת ' תהליך ' טאב, לחץ על " רקע לחסר ". לשמור את רדיוס הכדור מתגלגל 50 פיקסלים, לא סימון אחת או יותר מהאפשרויות המופיעים בתפריט. תקריב על שימוש תא אחד ' זכוכית מגדלת ' כלי.
    4. שימוש ' מלבן ' הכלי, ציירו תיבה (~2.5 x 2.5 מיקרומטר 2) בציטוזול, מוודא לא למשוך אותו הגרעין או קרום פלזמה. העיתונות " Ctrl " + " M " מפתחות או ללכת ' נתח ' טאב ולאחר מכן לחץ על " מידה " כדי לקבוע את הערך אפור הממוצע של התיבה. להתקדם המסגרות ולמדוד שוב, לוודא את תיבת נשאר ציטוזול.
      הערה: מאז תאים discoideum ד לנוע במהירות רבה תיבת ניתן להעביר למסגרת הבאה להשאיר ציטוזול-
    5. אחרי כל המסגרות יש נותחו, להעתיק את הערכים לתוך גיליון אלקטרוני. לקחת בחשבון-לתא וריאציה רמות הביטוי של ביולוגיים שונים, לנרמל את הערכים עבור ערך האפור רשע נצפתה בזמן 0. לחשב את הדדיים של הערכים כדי לשקף ההצטברות של האות על קליפת-

5. רציפה גירוי מכני, לחיות הדמיה של תאים בודדים על המיקרוסקופ

  1. להגדיר את התאים בדיוק כפי שתואר לעיל לניתוח גירוי מכני חריפה בשלבים 4.1.1 - 4.1.3. פתח את התקע כיסוי המאגר עם המאגר, אז יכול להיות עקף את אמצעי האחסון אם התגובה הוא ניתח יותר מ כמה דקות בכל פעם.
    הערה: כיוון המאגר נותר פתוח למשך הזמן של הניסוי, וזמינותו הזה מתקיים בהיעדר לחץ חיצוני וכן על זרימת הכבידה לבד. כדי להגביר את קצב הזרימה של חוק המשיכה, הניקוז ניתן להניח על השולחן מתחת למיקרוסקופ.
  2. להתחיל הדמיה תאים עם תאורה RFP-GFP ספציפיים או על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם מטרה X 40 במרווחי s 3 לצורך ניתוח של תגובות ביוסנסור. לחלופין, תמונה עם שלב החדות בעזרת מטרה X 20 במרווחי s 10 לניתוח של נדידת תאים הכללית.
  3. להפעיל את זרימת לאחר מספר מסגרות-הגדרת אפס-לחץ (כלומר זרימה הוא עקב כוח המשיכה לבד או ~ 15 רמות דינ/cm 2) על ידי מיתוג את השסתום למצב פתוח. כאשר רמת הנוזלים יורד עד 5-10 מ"ל במאגר המים, למעלה עם מאגר נוסף. הקפד להוסיף את הנוזלים בקפידה כך בועות אוויר לא להילכד בתוך הקווים.
    הערה: חשוב להוסיף נוזל של הטמפרטורה כדי למנוע תגובת הלם בתאים.
  4. לכמת תא מהירות והתמדה באמצעות תוכנת ניתוח ההעברה (ראה את הטבלה של חומרים לפרטים) על פי יצרן ' הוראות s.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זמני תגובה של הרגולטורים כימוטקסיס גירוי מכני חריפה

כדי להעריך את התגובה של תאי discoideum ד כדי גירוי מכני, תאים מצבור המוסמכים חסיד נחשפו דופק קצרה של זרימה הטיה. צבירת-כשיר ד discoideum תאים מפרישים מחנה, אשר יכול להיות חש על ידי תאים שכנים. כדי להתגבר על התרומה של איתות התא-התא, תאים טופלו קפאין, אשר מעכב cyclase adenylyl ב discoideum ד , וכך מונע את הפרשת המחנה28. אכן, תאים טר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטות המתוארות כאן מציעים דרך נוחה כדי להעריך את האוכלוסייה והן תא בודד התנהגות בתגובה להטיה זרימה. חשוב, ואילו מחקרים קודמים ניתח לוקליזציה של המוביל, משתרך סמני קצה במהלך ההעברה, הגישה הנוכחית מאפשרת חקירת תופעות מיידית על-ידי החלת זרימת הטיה בחריפות. בשיטה זו אנו הוכיח כי, למעשה, התגובה הראשונית של תאים להטיית הזרימה אינה דורשת נדידת תאים. במקום זאת, התגובה המהירה וחולף הגירוי זרימה הטיה הראשונית מקדים כיווניות ההעברה ראיתי עם חשיפה ממושכת להטיית זרימה, בדומה התגובה הכללית הראשונית עם מעבר צבע chemoattractant.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק R35 GM118177 PND.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
דקסטרוזפישרD16-1השתמש להכנת מדיה HL-5 וצלחות SM (שלבים 1.1, 1.2)
פפטון פרוטאוזפישרDF0120-17-6השתמש להכנת מדיה HL-5 (שלב 1.1)
תמצית שמריםפישר50-550-445השתמש להכנת מדיה HL-5 וצלחות SM (שלבים 1.1, 1.2)
Na2HPO4· 7H2OFisherS373-500השתמש להכנת מדיה HL-5, ומאגר פוספט 10X (שלבים 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500השתמש להכנת מדיה HL-5, לוחות SM ומאגר פוספט 10X (שלבים 1.1-1.3)
סטרפטומיצין (דיהידרוסטרפטומיצין סולפט)פישרICN10040525השתמש להכנת מדיה HL-5 (שלב 1.1)
פפטון (Bacto)FisherDF0118-17-0השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)
K2HPO4FisherP288-100השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)
AgarFisherBP1423-500השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)
MgSO4FisherM65-500השתמש להכנת DB Buffer (שלב 1.4)
CaCl2FisherC79-500השתמש להכנת DB Buffer (שלב 1.4)
קפאיןפישרO1728-500השתמש להכנת קפאין (שלב 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 רגל, 5 רגל-מונופוספט מחזורי, מלח נתרן)פישר11-680-1100MGהשתמש להכנת cAMP (שלב 1.6)
חומצה פוליתSigmaF7876השתמש להכנת פוליק חומצה (שלב 1.7)
בסיס טריספישרBP152-500השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)
נתרן דודציל סולפט (SDS)פישרBP166-500השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)
גליצרולפישרG33-500השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)
דיתיותרייטול (DTT)Bio-Rad1610610השתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)
1610404 Bio-Radכחול ברומופנולהשתמש להכנת מאגר דגימה 3X (שלב 1.8)
NaFFisherS299-100השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)
נתרן פירופוספט דקהידראטפישרS390-500השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)
קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA (Roche)Sigma11873580001השתמש להכנת מאגר דגימה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (שלב 1.8)
Latrunculin AEnzo Life SciencesBML-T119-0100השתמש להכנת Latrunculin A (שלב 1.9)
4-15% Tris-HCl פוליאקרילאמיד ג'לBio-Rad3450029 שימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)
ממברנת פלואוריד פוליווינילידןBio-Rad1620177 שימוש לאימונובלוטינג (שלב 3.3)
פוספו-PKC (פאן) (zeta Thr410) (190D10) נוגדן ארנבאיתות תאים2060נוגדן ראשוני לשימוש באימונובלטינג (שלב 3.3)
פוספו-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) נוגדן XPCell Signaling4370נוגדן ראשוני לשימוש באימונובלטינג (שלב 3.3)
ארנב IgG HRP מקושר לכל הבטן (מחמור)GE HealthcareNA934-100ULנוגדן משני לשימוש באימונובלטינג (שלב 3.3)
מצע כימילומינסנציה משופר (Clarity Western ECL Substrate)Bio-Rad1705060לשימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)
מאגר הפשטה (שחזור פלוס מאגר הפשטת כתמים מערביים)פירסPI46430שימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278שימוש לאימונובלטינג (שלב 3.3)
K. aerogenes strain (לא פתוגני)Dicty Stock Center (dictybase.org)
שם<strong>חברהCatalog NumberComments
Materials and Equipment
Orbital shaker (דגם G-33, או חלופה דומה)New Brunswick ScientificUse כדי לגדל K. aerogenes (שלב 2.1.1), ולבזל ולעורר תאי D. discoideum (שלב 3). רדיוס הסיבוב של שייקר זה הוא 9.5 מ"מ.
צלחת פטרי 10 ס"מפישרFB0875712 השתמש להכנת צלחות SM (שלב 1.2)
המוציטומטרפישר02-671-51Bהשתמש לספירת תאים D. discoideum תאים (שלב 2.1.2)
צלחת 35 מ"מ (צלחת תרבית רקמות Corning Falcon Easy-Grip)פישר08-772Aהשתמש בצלחת D. discoideumתאים לגירוי מכני ואחריו ליזה של תאים (שלב 3.1.1)
פוליסטירן (5 מ"ל)VWR13915-985השתמש כדי לעורר D. discoideum תרחיף תאים עם חומר כימואטרקטיבי (שלב 3.2.2)
יחידה נוזלית עם משאבה (מערכת משאבת ibidi)Ibidi10902השתמש כדי לספק גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5)
שקופית עם תעלה (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 כיסוי פולימר, תרבית רקמות מטופלת, מעוקרת)Ibidi80316השתמש לצלחת D. discoideum תאים לגירוי מכני המועבר על ידי מכשיר נוזלי (שלבים 4.1, 4.2 ו-5)
מאגרי 50 מ"ל (מחזיק מאגר איבידי ליחידה נוזלית)Ibidi10978השתמש כדי להגדיר את המכשיר הנוזלי להעברת גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5)
קווים ליחידת הנוזל (סט זלוף צהוב וירוק)Ibidi10964השתמש כדי להגדיר את המכשיר הנוזלי להעברת גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5). הערה: ניתן לחתוך את שני הקווים גם מצינור 1.6 מ"מ (מספר קטלוגי 10842).
קו לניקוז (צינורות ID 1.6 מ"מ)Ibidi10842השתמש כדי להגדיר את המכשיר הנוזלי להעברת גירוי מכני לתאי D. discoideum בתעלה (שלבים 4.1, 4.2 ו-5).
Zeiss Observer.Z1 מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרת שמן 40X/1.3 ומטרת אוויר 20X/0.3 (או חלופה דומה)Zeissמשמש להדמיית תאים D. discoideum עם ניגודיות פאזה או תאורה פלואורסצנטית (שלבים 4 ו-5)
מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב UltraView מצויד ב-40&/1.25– 0.75 מטרת שמן (או חלופה דומה)Perkin-ElmerDM 16000חלופה המשמשת להדמיית תאי D. discoideum (שלב 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; דגם 5247, או חלופה דומה) עם Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D ו-5192000027השתמש כדי לספק גירוי מכני לתאי D. discoideum על ידי מיקרופיפטה (שלב 4.3). הערה: המספר הקטלוגי הוא עבור הגרסה החדשה ביותר של הציוד (4i).
מיקרופיפטה (פמטוטיפ; 1 μ קוטר חיצוני מ', 0.5 μ m קוטר פנימי )Eppendorf930000035השתמש כדי לספק גירוי מכני לתאי D. discoideum על ידי מיקרופיפטה (שלב 4.3)
קצות מיקרו-מעמיס (טיפים של Eppendorf Femtotips Microloader עבור Femtojet Microinjector)Eppendorf5242956.003השתמש למילוי המיקרופיפטה (femtotip) במאגר (שלב 4.3.1)
תא 1-באר (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)פישר12-565-472השתמש בצלחת תאי D. discoideum לגירוי מכני המועבר על ידי מיקרופיפטה (שלב 4.3.2)
תא 8 בארות (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)פישר12-565-338השתמש בצלחת תאי D. discoideum לגירוי מכני המסופק על ידי הוספת מאגר בתפזורת (שלב 4.4.1)
<חזק>שםCompanyCatalog NumberComments
Software
Image Analysis Software (Fiji)NIHhttps://fiji.sc/השתמש כדי לכמת תגובה לגירוי מכני (שלב 4.5)
תוכנת ניתוח הגירה (Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/השתמש כדי לכמת את מהירות התא וההתמדה (שלב 5.4)

מקורות

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זרימה גזמיתהעברה של אותותשלד האקטין התאיחיישנים ביולוגיים פלואורסצנטייםמנער מסובבתא מיקרופלואידיוסטרן בלוטנדידת תאים
הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.