טכניקה הרומן לתצוגה מהירה אנטיגן על משטח חיידקי מוצג, שיכלול משטח biotinylation ואחריו חשיפה חלבונים עניין בפיוז'ן עם אבידין monomeric. טעינת BCG עם אנטיגנים שנבחר בהצלחה משפר את immunogenicity שלה, רומז כי הקליגרפיות יכול להחליף את הגישות המסורתיות גנטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין
במאמר זה
סיכום
תקציר
השחפת (TB) היא מחלה זיהומית קשה, חיסון זמין רק מ חיידקי סטרפטקוקוס בוביס bacillus Calmette-Guérin (BCG) הינו בטוח ויעיל להגנה נגד חמור טרה-בתים דלקת קרום המוח ילדים, כמה צורות של המופץ טרה-בתים, אך אינו מצליח להגן נגד שחפת, וזו הצורה השכיחה ביותר של המחלה. מבטיח אסטרטגיות לשיפור BCG כעת להסתמך גם על השינוי שלה עם הגנים קידוד immunodominant מ. שחפת (Mtb)-אנטיגנים ספציפיים ו/או קומפלמנטציה עם הגנים קידוד שיתוף גורמים המעודדים אנטיגן הצגת תאים. מגבלות הגדולות גישות אלה כוללים יעילות נמוכה, יציבות נמוכה לרמת הבטיחות של וקטורים ביטוי לא בטוח. במחקר זה, אנו מציגים גישה אלטרנטיבית לשיפור החיסון, אשר מורכב קומפלמנטציה BCG עם חלבונים אקסוגני של עניין על פני השטח של חיידקים, במקום טרנספורמציה עם פלסמידים קידוד הגנים המתאימים. ראשית, חלבונים עניין באים לידי ביטוי פיוז'ן עם אבידין monomeric ב רגיל e. coli מערכות ביטוי אז נהגו לקשט את פני השטח של biotinylated ה-BCG. ניסויים בבעלי חיים באמצעות משטח BCG מעוטרים עם הפונדקאית אובלבומין אנטיגן מדגימים כי החיידק ששונה הוא מלא immunogenic, מסוגל גרימת תגובות תא T ספציפי. בסך הכל, הנתונים המוצגים כאן בחום תמיכה של הרומן שיטה יעילה לשינוי הצורה של החיסון BCG הנוכחי מחליף את הגישה המקובלת מפרך של קומפלמנטציה עם חומצות גרעין אקסוגני.
מבוא
אסטרטגיות שונות הוצעו כדי להחליף את החיסון הנוכחי שחפת BCG, כולל חלבון אדג'וונט מערכות, טכנולוגיות הווקטורי ויראלי, זנים M.tb בשידור חי הקלוש של זנים מהונדסים BCG, גם להחדיר גנים יתר ביטוי אנטיגנים BCG באים לא מספיק לידי ביטוי במהלך זיהום1 או שחרור מהיר למוט אוכף-אנטיגנים ספציפיים מציג BCG2. עם זאת, הנדסה גנטית, פונה מחסומים רבים כולל רמת לא בטוח בטיחות התהליך זמן רב, יעילות נמוכה של הביטוי וקטורים4,5. לגבי שיפור BCG, גישה חלופית יש צורך לשפר את immunogenicity ללא צורך מסעה גנטי לא בטוח.
במחקר זה, נסקור אסטרטגיה הרומן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל בעלי החיים היו נשמרים על פי פרוטוקולים אושרה על ידי חיה אכפת ועדות שימוש ב אוניברסיטת בריטיש קולומביה. הניסויים היו אושרה על ידי חיה אכפת לי להשתמש ועדות, שבוצעה על פי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים. המספר רווחת בעלי חיים אבטחת הוא A11-0247.
1. דור של חלבונים פיוז'ן אבידין Monomeric לבטא פלסמידים
- תת לשבט monomeric אבידין רצף12 לתוך פלסמיד pDEST17 בין האתרים "CTC", "גה" המתאים 133-134bp. (כלומר, בין 6-histag pDEST17 Attr1 רקומבינציה האתר) כדי להשיג p17-Avi.
הערה: רצף הדנ א אבידין monomeric מוצגת להלן. שלוש מוטציות שהוצגה בפראי-סוג אבידין להשיג אבידין monomeric מוצגים תווים מו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם כללי בהליכים המתוארים לעיל, נבחנה הכדאיות של biotinylation משטח BCG וקישוט עם אנטיגן הפונדקאית ביצית. Immunogenicity של BCG שהשתנה היה אז נבדק בתוך vivo. השטח חיידקי סומן בקלות עם ביוטין לתצוגה מהירה של אנטיגנים chimeric אבידין ללא כל שינוי לזיהוי פנוטיפים חיידקי. BCG ששונה וכתוצאה מכך ביעילות בליעתו על ידי אנטיגן הצגת תאים, יכול לגרום תגובה חיסונית ספציפית ביצית בעכברים.
דור של פלסמידים פיוז'ן אבידין monomer.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנחנו דיווחו במחקר זה בגישה הלא גנטי לתצוגה מהירה ויעילה של חלבונים אקסוגני במשטח BCG להוסיף אנטיגנים ספציפיים או מאפיין פונקציונלי מסוים צפוי לשיפור ביעילות immunogenicity של החיידק. להדגים כי השטח תא BCG יכול להיות בקלות biotinylated לקישוט משטח מיידי עם אבידין פיוז'ן חלבונים. ניתן לבצע את ההליך הכולל בתוך 2 h, בזמן שינוי גנטי, מבחר של שיבוטים חיובית דורשת 2-3 חודשים של זמן השהיה. שינוי פני השטח אינה משפיעה על התפתחות חיידקים והישרדות. חיידקים מעוטרים עם אנטיגן הפונדקאית ביצית הצליחו לספק אנטיגן לתוך השביל מצגת אנטיגן,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים ד ר סטוקס R לזן של פסטר BCG ו א טלאל לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים גם GenScript על העזרה עם ג'ין סינתזה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נטול אנדוטוקסין, RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS ביוטין | תרמו פישר | 21328 | |
| סטרפטווידין מצומד FITC | סיגמא-אולדריץ' | S3762 | |
| פיקואריתרין (PE) מצומד I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL בינלאומי | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| שרף טיהור פוליהיסטידין-תג TALON | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 מצומד חולדה נגד עכבר CD4 | BD Bioscience | ||
| AF647 עכברים נגד עכברים IFN-g | BD Bioscience | ||
| AF647 עכברים נגד עכברים I-A/I-E | BD Bioscience | ||
| PeCy7 חולדה נגד עכבר CD4 | BD Bioscience | ||
| PE חולדה נגד עכבר CD8 Ab | BD Bioscience | ||
| AF 647 חולדה נגד עכבר H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC מצומד עז אנטי ארנב נוגדן | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 חולדה נגד עכבר CD4 | BD Bioscience | ||
| קטן במיוחד מצומד זהב עז אנטי ארנב IgG | אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 מרק | BD מערכות אבחון | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 קווי תאי מקרופאגים עכברים | סוג אמריקאי אוסף | ||
| pDEST17 פלסמיד | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA פלסמיד | GenScript | SD1176 | |
| BP קלונאז | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 פלסמיד | Invitrogen | 12536017 | |
| עמודות Ni-NTA | Qiagen | 31014 | |
| רכזי חלבון פירס | תרמו פישר | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי Axioplan II | קרל זייס בע"מ | ||
| מצלמה דיגיטלית CCD | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV מיקרוסקופ אלקטרונים | חברת FEI | G2 200Kv | |
| 70μ מסננת תאי פלקון | תרמו פישר | 87712 | |
| ערכת בחירה חיובית ביוטין של עכבר EasyStep | StemCell | 18556 | |
| ביוטין-Ter119/תאי ארטירואיד נוגדן | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| ערכת ציטופיקס/ציטופרם | BD Pharmingen | 554714 | |
| מערכת בדיקת לוציפראז Bright-Glo | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | פרומגה | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 מיקרוטום | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 מייבש הקפאה | Savant Instruments | NL 50 | |
| בקבוקוני זכוכית Wheaton boroscilicate | Wheaton | VWR 66011-675 |
מקורות
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
