מאמר שיטה

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

DOI:

10.3791/56423

⸱

2 בינואר 2018

 ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, 3Molecular Biology Institute Interdepartmental Program, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול מתרבים ביצירת ו fibroblasts השבתה הדרגתית העיקרי עורי אנושי, ניטור התעתיק הניוון ולאחר זיהוי גנים רקובה באופן שונה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרדמה הוא מצב זמני, הפיכה בה תאים חדלו חלוקת התא, אך לשמר את היכולת להתרבות. מחקרים רבים, כולל שלנו, הראו כי תרדמה קשורה נפוצה שינויים בביטוי הגנים. חלק משינויים אלה להתרחש דרך שינויים ברמה או פעילות של גורמי שעתוק התפשטות-הקשורים, כגון E2F ו- MYC. הראו כי ה-mRNA דעיכה יכול לתרום גם שינויים בביטוי הגנים בין תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים הליך הקמת תרבויות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית של העורלה עורי האנושי fibroblasts. לאחר מכן נתאר את נהלי עיכוב חדש שעתוק בתאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית עם ואקטינומיצין D (ActD). טיפול ActD מייצג גישה ישירה, לשחזור בריא שעתוק חדש מהשחתה תעתיק. חיסרון של טיפול ActD היא כי מסלול הזמן חייב להיות מוגבל למסגרת זמן קצר כי ActD משפיע על התא הכדאיות. התעתיק רמות מנוטרים לאורך זמן לקביעת תעתיק הניוון. הליך זה מאפשר הזיהוי של גנים איזופורמים כי התערוכה הריקבון הדיפרנציאלי ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות מצב יציב של הפרוטוקולים משקפים את התרומה של התעתיק סינתזה ודעיכה תעתיק. מוסדר והוא תעתיק מתואמת דעיכה מנגנון חשוב לשליטה תהליכים ביולוגיים1,2,3,4. לדוגמה, התעתיק הניוון הוכחו לתרום הסדרה הטמפורלי של אירועים בעקבות ההפעלה על-ידי הגידול נקרוזה מקדם ציטוקינים דלקתיים5.

אנחנו הראו בעבר כי המעבר בין התפשטות תרדמה בתוך ראשי fibroblasts האנושי קשורה לשינויים ברמות תעתיק של גנים רבים6. חלק משינויים אלה משקפים הבדלים בפעילות של גורמי שעתוק בין שתי מדינות אלה.

שינוי בקצב של תמליל רדיואקטיבית יכול לתרום גם שינויים ברמת הביטוי של תעתיק שני מצבים שונים7,8. בהתבסס על הממצאים שלנו מוקדם יותר כי המעבר בין התפשטות תרדמה קשורה לשינויים ברמות של מיקרו Rna מספר9, שאלנו יש גם תרומה מהשחתה התעתיק דיפרנציאלית משתנה ב ביטוי גנים ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית.

כדי לעקוב אחר תעתיק יציבות, קבענו שיעור הריקבון של הפרוטוקולים הגנום כולו ב מתרבים לעומת תאים השבתה הדרגתית. כדי להשיג זאת, אנחנו במעקב הניוון ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית על ידי היכרות עם מעכב של שעתוק חדשים וניטור קצב שבו תעתיקים בודדים נעלם עם הזמן. היתרון של גישה זו הוא, לעומת שיטות המפקחים פשוט ביטוי גנים הכוללת, על ידי עיכוב סינתזה חדשה התעתיק, נוכל לקבוע את קצב הדעיכה תחפש ברישומים אלה בנפרד מן הקצב שבו הם עיבד.

טיפול ActD לעכב שעתוק חדשים ולקבוע תעתיק הניוון יושם בהצלחה במחקרים קודמים מרובים. ActD שימש לנתח את חשיבות יציבות הרנ א משתנה בשפע התעתיק הנובעים הטיפול בעזרת ציטוקינים פרו-דלקתיים5. בגישה דומה שימש גם לנתח את ההבדלים התעתיק קצב הדעיכה ב מתרבים לעומת תאים C2C12 כפי הם מאמצים של פנוטיפ של שריר הבדיל10. כדוגמה נוספת, ה-mRNA מחצית החיים הכללית גם זוהתה pluripotent, תאי גזע עובריים בעכבר הבדיל11. בדוגמאות אלה, ריקבון mRNA הוכח להיות חשוב עבור ויסות התעתיק שפע, את המעבר של תאים תאים שונים הברית.

יישום השיטות המתוארות להלן, גילינו לשינויים התעתיק הניוון כ 500 גנים בהשוואת fibroblasts הברית מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית12. בפרט, גילינו כי המטרות של microRNA מיר-29, אשר downregulated בתאים השבתה הדרגתית, התייצבו כאשר תאי מעבר תרדמה. נתאר כאן את המתודולוגיה שהשתמשנו כדי לקבוע הניוון תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. מתודולוגיה זו שימושית לצורך השוואת הכללית הניוון mRNA בשני נושאים שונים אך דומים לתנאים כאשר מידע אודות במהירות מרקיבים גנים מתבקשת. זה יכול לשמש גם כדי לטפל שאלות אחרות כגון ההשפעה של התא תנאי התרבות על התעתיק ריקבון, למשל, לשניים מימד לעומת שלוש התרבויות תלת-ממדי. הניוון יכול להיות נחוש הגנום כולו עם שיטות כמו מיקרו-מערכים או RNA-תת סעיף. לחילופין, qPCR בזמן אמת או סופג הצפוני יכול לשמש כדי לקבוע את הניוון על בסיס ג'ין-מאת-גן או isoform-על ידי-isoform. המחירים הללו יכולים לשמש לאחר מכן כדי לחשב את זמן מחצית החיים של כל הגן בפיקוח וכדי לזהות גנים עם הניוון השונים של שני תנאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי המוסדיים סקירה קרשים אוניברסיטת פרינסטון, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.

1. מכינים את Fibroblasts מתרבים ומגדלי עכבות-קשר לקורס ActD זמן

הערה: פרוטוקול זה משתמש של timecourse עם ארבע timepoints. ניתן לאסוף שלוש דוגמאות ביולוגית עצמאית לכל timepoint על ידי איסוף תרביות רקמה שונים לוחות בניסוי אחד, או הניסוי יכול לחזור מספר פעמים עם תרבויות שונות של תאים. מניסיוננו, צלחת תרביות רקמה אחת של 10 ס מ (קוטר) (לוח אחד) מספק RNA מספיק לניתוח. במידת הצורך, באפשרותך איחדו מספר מנות תרביות רקמה עבור כל דגימה להגדיל את מספר תאים על כל timepoint. בנוסף, ניתן לבצע את הניסוי באותו fibroblasts מבודד מאנשים שונים כמו ביולוגית עצמאית משכפל.

  1. להקים תרבויות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית של תאים לניתוח דעיכה תעתיק. עבור תאים מתרבים, לפצל את התאים כל שלושה ימים בזמן התאים עכבות-קשר הופכים להיות מעוכבים-קשר.
    1. עבור תאי קשר-עכבות, לשנות את המדיום כל יומיים במשך 7 ימים. פצל את התאים proliferating יומיים לפני fibroblasts עכבות-קשר מוכנים לאוסף. דוגמה של ערכת תרבות תא מוצג באיור1. השלבים הנותרים בסעיף זה מספקות עבור הקמת ופיצול התאים פרוטוקול מפורט.
  2. לבודד fibroblasts עורי העיקרי מן העור neonatal לפי פרוטוקולים הוקמה13. המעבר fibroblasts כדי להבטיח אוכלוסיה הומוגנית.
    הערה: Fibroblasts יכול להיות קפוא, הקרת, במידת הצורך.
  3. להפשיר או replate fibroblasts, במידת הצורך. לגדול fibroblasts ב DMEM עם 10% סרום בתנאים סטריליים ב חממה תרביות רקמה-CO 37 ° C ו-5%2. השתמש fibroblasts כי כבר מבוגר בשביל פחות מעשרה פסוקים. Fibroblasts צריך להיות < 80% confluent ביום של פיצול תאים להפוך אוכלוסיות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית.
  4. כדי לפצל צלחת תרביות רקמה לוחות מרובים, prewarm PBS טריפסין, בינוני עם סרום באמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.
  5. האחות או להשתמש pipet להסיר את המדיום שהלוח תרביות רקמה עם תאים כדי להיות replated.
  6. Pipet PBS חמים על כל צלחת (10 מ"ל של פתרון עבור צלחת 150 מ מ, 5 מ של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6), ו- 1 מ"ל עבור טוב של צלחת טוב 12.
  7. וביופסיה או pipet כדי להסיר PBS שהלוח תרביות רקמה.
  8. בעדינות pipet 1 x טריפסין-EDTA על כל צלחת (8 מ"ל של פתרון לצלחת 150 מ מ, 3 מ"ל של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6 ו- 1 מ"ל עבור טוב של צלחת טוב 12).
    הערה: להפוך 1 x טריפסין-EDTA על ידי דילול סטרילי 10 x טריפסין-EDTA ב- PBS סטרילי. הפתרון הסופי 1 x צריך להיות EDTA טריפסין ו- 0.02% 0.05%.
  9. דגירה טריפסין עם תאים עבור 5 דקות.
  10. טפח בעדינות את הצלחת מכך התאים מהצלחת.
  11. Pipet כדי resuspend תאים להשעיה תא בודד.
  12. להעביר תאים בפתרון טריפסין צינור חרוטי המכיל באותו אמצעי אחסון של DMEM עם 10% סרום (8 מ של פתרון לצלחת 150 מ מ, 3 מ"ל של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6 1 מ"ל עבור טוב של 12 טוב לוח).
  13. ספין למטה תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב x 1000 g כדי להסיר טריפסין.
  14. Resuspend אמצעי אחסון המתאים של בינוני, ספירת תאים עם hemacytometer כדי לקבוע ריכוז התא.
  15. זרע 5 x 105 תאים לכל 100 מ מ לוח תרביות רקמה עבור מתרבים ותאים עכבות-קשר.
  16. באמצעות שיטה זו, להקים את הדגימות מתרבים ומגדלי עכבות-קשר הנדרש לצורך ניתוח (איור 1).

2. ActD זמן הקורס

  1. Resuspend ActD-ריכוז מניות של 1 מ"ג/מ"ל (עבור 1 מ ג של ActD, שימוש µL 950 ל- PBS סטרילי, µL 50 של דימתיל סולפוקסיד סטרילי).
    הערה: קפואים מלאי פתרונות של ActD צריך להיות יציב במשך חודש ב-20 ° C. תמיסות צריך להיות מושלך, אינם מאוחסנים להמשך השימוש.
  2. להוסיף ActD האחסון המתאים של מדיום prewarmed עבור כל תרבית תאים שכפל ביולוגי צלחות זה נקבעו מוכן של 0, 120, 240 ו- 480 דקות timepoints (איור 2). להוסיף ActD ריכוז של µg 15 לכל מיליליטר בינוני. מערבבים היטב, וארוקן את המדיום הישן ולהוסיף בינוני המכילים ActD לתאים.
    1. עבור מניה 1 מ"ג/מ"ל, להוסיף 15 µL ActD עבור כל מיליליטר בינוני, למשל, עבור 10 מ"ל של מדיום לצלחת 100 מ מ, להוסיף 150 µL ActD.
  3. כדי לאסוף את הדגימה timepoint אפס, תשאף בעדינות ירד ActD בינוני, והוא pipet prewarmed PBS אל התאים. Pipet 10 מ"ל של פתרון לצלחת 150 מ מ, 5 מ של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6 ו- 1 מ"ל עבור טוב של צלחת טוב 12.
  4. בעדינות מחוק לגמרי או pipet טוב, מגניב.
    הערה: כל השלבים הכרוכים RNA בידוד צריכה להתבצע עם RNase ללא מים, ללא RNase צינורות microcentrifuge נטולת RNase פיפטות. כפפות צריך להיות שחוקים ולא השתנה לעתים קרובות בעת עבודה עם ה-RNA.
  5. הוספת פנול-guanidine isothiocyanate פתרון (1 מ"ל/10-ס מ צלחת עם 4 x 105 על 4 x 107 תאים) ישירות לצלחת תרביות רקמה.
    הערה: פתרון isothiocyanate פנול-guanidine הוא פתרון monophasic שומרת על איכות ה-RNA בזמן lysing תאים ומפריד RNA DNA, חלבון אחד מהשני.
    התראה: isothiocyanate פנול ו- guanidine הם מאכל. השתמש הגנה הולמת.
  6. תערובת פתרון-תא isothiocyanate pipet פנול-guanidine לאורך מספר פעמים להכין תערובת הומוגנית.
    הערה: פתרון isothiocyanate פנול-guanidine lysate ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ב-20 ° C עבור עד שנה.
  7. לאסוף את כל נקודת זמן לאחר הכמות המתאימה של הזמן חלף באמצעות השיטה המתוארת בצעדים 2.3-2.6.

3. בידוד של RNA הכולל מהפתרון פנול-guanidine Isothiocyanate Lysate

  1. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי להבטיח התפרקות מוחלטת של RNA-חלבון מתחמי.
    הערה: השלבים של פרוטוקול פתרון isothiocyanate פנול-guanidine יכול להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם נכתב אחרת.
  2. מציגים את התמלילים ספייק-אין שליטה שניתן לאתר עם המתודולוגיה בשימוש.
להציג פקדים אלה לתוך כל מדגם מוכרת, ריכוז.
הערה: חיצוני RNA שליטה consortium (ERCC) ספייק-אין שליטה mix14 עוצב במיוחד כפקד ספייק-in עבור ה-RNA-תת סעיף. זה יכול לשמש גם עבור שהכלים בצפון או qPCR בזמן אמת. ספייק-אין פקדים שתוכננה במיוחד עבור טכנולוגיות microarray הינם גם זמינים (ראה הטבלה של חומרים).
  • להעביר את התערובת פתרון של פנול-guanidine isothiocyanate צינור microcentrifuge 2.0 mL עם פיפטה. הוספת 0.2 מ"ל כלורופורם לתערובת פנול-guanidine isothiocyanate פתרון עבור כל 1 מ"ל של פנול-guanidine isothiocyanate פתרון בשימוש (למשללהוסיף כלורופורם 0.3 mL מ ל 1.5 פנול-guanidine isothiocyanate פתרון תערובת).
  • לנער את הצינור microcentrifuge נמרצות במשך 15 s ואז דגירה כלורופורם-פנול-guanidine isothiocyanate תערובת בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
  • ספין דגימות ב 12,000 x g עבור 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר ספין הראשונית, המדגם צריך להפריד לתוך 3 שכבות - שכבת אורגני האדום התחתון, לאטמוספרה לבן/ורוד באמצע, שכבה מימית ברורה על העליונה (איור 3).
  • להעביר צינור microcentrifuge 2.0 mL חדש באמצעות micropipette של השכבה המימית.
    הערה: תיזהר שלא להפריע את לאטמוספרה במהלך תהליך זה. זה בסדר להשאיר חלק השבר מימית. עדיף להשאיר חלק השבר מימית מאשר כדי לכלול גם כמה מן הרבדים לאטמוספרה, ככוללת את לאטמוספרה שכבה לזהם את הרנ א עם ה-DNA. השכבה המימית יהיה כ חצי נפח הראשונית, אז על 0.9 מ ל אם התערובת פתרון/כלורופורם פנול-guanidine isothiocyanate היה 1.8 מ.
  • להתעלם לאטמוספרה ושברים אורגני.
  • להוסיף אמצעי שווה של 2-פרופנול השבר מימית, היפוך הצינור 10 פעמים. להוסיף עד 1 µL של 20 מ"ג/מ"ל תמיסה מימית של גליקוגן לכל 20 µL מדגם, במיוחד אם התשואה צפוי להיות נמוך כי פחות מ 106 תאים שנאספו.
    הערה: התוצאה תהיה גלולה צפוף, מוצק קל לעקוב אחרי השלבים ספין שאחריו.
  • דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  • ספין דגימות ב 12,000 x g עבור 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. ודא כי בסוף המהדורה הזו, הרנ א יש זירז להקים גלולה לבן בתחתית הצינורית.
  • עם פיפטה, להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע לוקח טיפול מיוחד שלא להפריע בגדר RNA לבן.
    הערה: טיפ pipet משוחרר החזיק ביד יכול לשמש כדי להסיר עודפי אתנול. אם בגדר RNA מופרע, אבל לא יימחקו, החוקר יכול לחזור על העובדות, להסיר את תגובת שיקוע שוב. להימנע מהשלכת בגדר כמו זה ידרוש החוקר לחזור על התהליך כולו.
  • להכין פתרון של 75% אתנול וביו -25% נוקלאז ללא מים. להוסיף 1 מ"ל של 75% אתנול לכל 1 מ"ל של פנול-guanidine isothiocyanate פתרון ריאגנט לשטוף את גלולה.
  • ספין דגימות ב x 12,000 g 10 דקות ב 4 º C.
  • לאחר הסרת מרבית תגובת שיקוע, להשתמש pipet כדי להסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר, תוך עדיין דאגה שלא להפריע בגדר.
    הערה: בגדר RNA היא פחות קומפקטית בשלב זה ונוטה לנוע. . לנהוג במשנה זהירות בעת טיפול בגדר בנקודה זו כדי להימנע מאובדן את הרנ א
  • ספין 12,000 x דגימות g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי הצניפה כל עודף אתנול.
  • הסר כל אתנול עודף הצינור באמצעות micropipette מקפיד לא להפריע בגדר.
  • תנו לאוויר צניפה RNA יבש במשך 5 דקות.
  • להוסיף 50 µL של מים נטולי נוקלאז בגדר RNA, בגדר במים נטולי נוקלאז resuspend.
  • מתייחסים דגימות עם 1 µL DNase (2 יחידות/µL) כדי להסיר DNA ולאחר מכן הפוך ללא פעיל DNase ו קטיונים (ראה טבלה של חומרים).
  • חנות RNA דגימות 2.0 mL צינורות microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס.

    • 4. ניתוח של התעתיק שפע

    1. לכמת RNA ולבדוק RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים של טוהר.
      הערה: היחס של ספיגת ב-260 nm 280 ננומטר צריך להיות כ 2.0 עבור ה-RNA.
    2. ניתוח ה-RNA עם ג'ל agarose 1% או טכנולוגיה שוות ערך להמחיש את מידת השפלה.
      הערה: שתי להקות ייצוג 18S ויכין 28S rRNA צריך להיות בבירור (איור 4). אם הלהקות האלה אינם גלויים, עשוי להיות מושפל את הרנ א. טיפים ירי צרות RNA השפלה ניתנים לדיון.
    3. צג שפע תעתיק aliquots שנאספו של RNA לעומת עלה בתקן פנימי באמצעות מיקרו-מערכים15, ה-RNA-Seq16, qPCR בזמן אמת17או18לחומה הצפונית.
      1. לקבוע את השפע עבור כל תעתיק בכל נקודה בזמן לעומת פקד עלה בהשפע ידוע.
        הערה: עבור מיקרו-מערכים, הערכים יהיה עוצמות קרינה פלואורסצנטית. עבור שהכלים בצפון, להקות על הסרט רנטגן ניתן לכמת. עבור qPCR בזמן אמת, התעתיק שפע יכול להיקבע by comparison with סטנדרטים ידועים עם 2- σσCT שיטת19. עבור ה-RNA-Seq, ניתן לקבוע ערכים מנורמל כמו FPKM או קטעים מפוצלים kilobase של אקסון לכל מיליון קריאות ממופה. עבור isoform ספציפיים הניוון, RNA-Seq נתונים ניתן לנתח באמצעות מתודולוגיות isoform-aware כגון DEXSeq20. Isoform ספציפיים הניוון נקבעים בצורה הטובה ביותר עם ה-RNA-תת סעיף. אם הם נקבע עם microarray נתונים, עליך להיות מנותח הנתונים על בסיס בדיקה-מאת-בדיקה ולא על בסיס ג'ין-מאת-גן. האנליסט עליך להיות זהיר בעת פירוש מידע מתוך מספר מצומצם של הגששים. למשל, ייתכן הגששים 5 או פחות כי הם אינפורמטיבי אודות isoform מסוים. במקרה זה, האנליסט יהיה צורך לקבוע אם ההתנהגות של רגשים אלו הוא עקבי מספיק כך שהתוצאות אמינות.
    4. לבצע qPCR בזמן אמת על ה RNA מבודד17 הדגימות שנאספו כדי לנתח במהירות רקובה גנים, כמו c-Myc ו גן לאט רקובה כמו GAPDH, לצבור אמון זה ריקבון התעתיק המחירים זוהו באופן מדויק.
      הערה: לאישור נוסף, qPCR בזמן אמת isoform ספציפיים הגששים ניתן להיות שפותחה, המשמשת לפיקוח של השפע איזופורמים ספציפיות לאורך זמן21.

    5.נחישות קבוע קצב הריקבון

    1. עבור כל timepoint, התמרת יומן הערכים שפע עבור כל תעתיק (גנים ספציפיים או isoform ספציפי).
      הערה: הפיכת יומן הערכים יהיה להמיר עקומות דעיכה מעריכית קווים שניתן להכניס עם מודל ליניארי דעיכה22.
    2. פרופיל ביטוי כל תעתיק (גנים ספציפיים או isoform ספציפי) מודל ליניארי דעיכה מתאים. הנוסחה לחישוב מודל כזה היא f(t) = C - r * t. במשוואה הזו, C הוא קבוע המייצג את הסכום ההתחלתי של תעתיק r הוא הקצב של ירידה, t הוא הזמן מאז תחילת הניסוי. מן המשוואה, לקבוע את קצב הדעיכה כמו r*ln(10) (ראו התייחסות11).
      הערה: חבילת התוכנה maSigPro היא גישה מבוססת-רגרסיה שנועדו לזהות פרופיל גנטי משמעותי ביטוי הבדלים זמן הקורס נתונים23. דוגמאות קוד תוצאות עבור maSigPro הינם זמינים: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
    3. לסנן גנים להיכשל מתאים מודל יומן-ליניארי דעיכה. זה יכול להתבצע עם מבחן-ANOVA F.
      הערה: במבחן F הוא מבוסס סטטיסטיקת F, אשר מוגדר וריאציית בין המדגם מחולק וריאציית בתוך דגימות. תקן ערכי-p להשוואות מרובות על-ידי החלת ליניארי step-up בנימיני, הוכברג גילוי שקר הליך24. Q-ערך הגדול מ- 0.05 עם F-המבחן יכול לשמש כמו ניתוק עבור גנים להיכשל מתאים מודל יומן-ליניארי דעיכה.
    4. לבצע מבחן-ANOVA F כדי לקבוע תעתיקים המונח אינטראקציה משמעותית בין מחזור התא קטגורית תנאי הזמן (גילוי שקר קצב, פד ר < 0.05).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אנחנו דיווחו בעבר כי התוצאות של microarray ניתוחים של התעתיק הניוון ב מתרבים ומגדלי עכבות-קשר fibroblasts אנושי ראשוני על קורס 8 שעות זמן12. רשימת גנים עם שינוי משמעותי ביציבות התעתיק השוואת fibroblasts מתרבים ומגדלי עכבות-קשר הינו מסופק משלים טבלה 1. עוצמות קרינה פלואורסצנטית בזמן אפס ומעלה קורס זמן לאחר טיפול ActD הינם מסופקים. גנים נכללו ברשימה על-ידי קביעת הגנים יש מדרונות שונה באופן משמעותי בתנאים מתרבים ומגדלי עכבות-קשר באמצעות מבחן-ANOVA F. ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    תרדמה יכולה להיגרם על ידי אותות חיצוניים כולל נסיגה של mitogens או סרום, חוסר הידבקות תאים, וניגוד קשר. סימן דיכוי, אחת השיטות אפשריות מרובים עבור גרימת תרדמה, הוא תהליך מאוד אבולוציונית שנשמרת שבו תאים יציאה מחזור התא proliferative בתגובה מגע לתא. אנו מתמקדים כאן סימן דיכוי כדוגמה שיטה לזירוז תרדמה. מחקרים קודמים דיווחו כי קשר תא-cell יכול להשפיע על microRNA להן25, לכן, התוצאות לספק מידע על שיטת תרדמה אחת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע אילו שינויים הקשורים תרדמה למשל.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    HAC היה המלומד במילטון אי קסל של קרן אלן ריטה (http://www.ritaallenfoundation.org). עבודה זו מומן על ידי מענקים HAC מן המרכז הלאומי הכללי לרפואה למדעי מענק הצטיינות P50 GM071508 (חוקר פרטי דוד בוטשטיין), 2007RSGl9572 גרנט חברת פארמה הקרן, הלאומית למדע קרן OCI גרנט-1047879 דוד לאוגוסט, המכון הלאומי של גנרל רפואי מדעי R01 GM081686, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית R01 GM0866465, אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר בתאי גזע CTSI המרכז לבריאות/UCLA NIH של הנשים איריס חזן גרנט UL1TR000124, והחברה לוקמיה לימפומה. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P50CA092131. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. HAC הוא חבר אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר תאי גזע, המכון לביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת UCLA, התוכנית באצירת לביואינפורמטיקה באוניברסיטת UCLA.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    צנטריפוגות לצינורות מיקרו-צנטריפוגות המסוגלות להגיע ל-12,000 x g ו-4° C
    ציוד להפעלת ג'ל
    צלחות תרבית רקמות סטריליות וצינורות חרוטיים
    Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-118
    סרום בקר עובריVWR35-010-CV
    פיפטות סרולוגיות סטריליות, פיפטורים וקצות פיפט לתרבית רקמות
    פיפטות חד פעמיות עטופות בנפרד, ללא Rnase, קצות פיפטות וצינורות לבידוד וניתוח
    כפפות חד פעמיות שיש ללבוש בעת טיפול בריאגנטים ודגימות
    RNaseZapInvitrogenAM9780לטיהור משטחי עבודה מצינורות
    RNase 2.0 מ"ל אפנדורף
    טריפסין-EDTA  פתרון 10XMillipore Sigma9002-07-07
    סטרילי PBSLife Technologies14190-250
    TrizolThermo Fisher Scientific15596018
    Actinomycin DMillipore SigmaA1410-2 mgמעכב שעתוק
    סטרילי DMSOFisher Scientific31-761-00MLממס לאקטינומיצין D
    ChloroformThermo Fisher ScientificICN19400225MP Biomedicals, Inc מוצר
    IsopropanolFisher ScientificBP2618500 ביולוגיה מולקולרית כיתה
    אתנולפישר ScientificBP28184ביולוגיה מולקולרית כיתה
    RNase ללא גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל תמיסה מימית)Thermo Fisher ScientificR0551נשא למשקעי
    RNAערכת TURBO ללא DNAThermo Fisher ScientificAM1907מסירה DNA עם DNase, ואז, בשלב הבא,   משבית את ה-DNA ומסיר קטיונים דו-ערכיים
    AgaroseThermo Fisher ScientificICN820721MP Biomedicals, Inc מוצר
    טוען צבע לג'ל RNAThermo Fisher ScientificR0641מתאים אפילו לדנטורזה
    של סמניMillenium RNAThermo Fisher ScientificAM7150סולם RNA
    ערכת RNA בצבע אחד AgilentTechnology5188-5282דוגמה לבקרת ספייק אין לניתוח מיקרו-מערך Agient
    Tris baseFisher ScientificBP152-1כיתה ביולוגיה מולקולרית, עבור מאגר TAE
    חומצה אצטית קרחוניתFisher ScientificA38-500עבור מאגר TAE
    EDTAFisher מדעיBP120-500אלקטרופורזה כיתה, עבור ג'לים
    אתידיום ברומידMillipore SigmaE7637לביולוגיה מולקולרית
    RNA חיצוני בקרות קונסורציום RNA Spike-in MixThermo Fisher Scientific4456740בקרת ספייק אין עבור RNA Seq
    TruSeq ערכת הכנת ספריית mRNA תקועה A (48 דגימות, 12 אינדקסים)IlluminaRS-122-2101עבור RNA Seq
    96 בארות 0.3 מ"ל PCR צלחת תרמופישר סיינטיפיקAB-0600לאטמי דבק qPCR
    Microseal BBio-RadMSB1001
    למאגרי ריאגנטים qPCR Rnase/DnaseVWR89094-662עבור qPCR
    Rnase/Dnase-free בזמן אמת שמונה רצועות וכובעיםThermo Fisher ScientificAM12230עבור qPCR
    בזמן אמתSuperScript Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010עבור qPCR בזמן אמת
    AMPure XP חרוזיםבקמן קולטרA63880עבור qPCR בזמן אמת
    אגרוזRNARNA בזמן אמת בזמן אמת

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
    2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
    3. Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75(2005).
    4. Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
    5. Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
    6. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83(2006).
    7. Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
    8. Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
    9. Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121(2012).
    10. Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
    11. Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
    12. Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123(2017).
    13. Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
    14. Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
    15. Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
    16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
    17. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
    18. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
    19. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
    20. Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
    21. Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
    22. Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
    23. Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
    24. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
    25. Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
    26. Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115(2009).
    27. Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
    28. Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
    29. Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
    30. Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719(2014).
    31. Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
    32. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
    33. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
    34. Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
    35. Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    Decay RatesProliferating FibroblastsQuiescent FibroblastsActinomycin D TreatmentRNA Isolation ProtocolReal Time qPCR AnalysisHuman Dermal FibroblastsGene Expression ChangesRNA Purity CheckPhenol Guanidine Extraction

    מאמרים קשורים