אנו מתארים פרוטוקול מתרבים ביצירת ו fibroblasts השבתה הדרגתית העיקרי עורי אנושי, ניטור התעתיק הניוון ולאחר זיהוי גנים רקובה באופן שונה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרדמה הוא מצב זמני, הפיכה בה תאים חדלו חלוקת התא, אך לשמר את היכולת להתרבות. מחקרים רבים, כולל שלנו, הראו כי תרדמה קשורה נפוצה שינויים בביטוי הגנים. חלק משינויים אלה להתרחש דרך שינויים ברמה או פעילות של גורמי שעתוק התפשטות-הקשורים, כגון E2F ו- MYC. הראו כי ה-mRNA דעיכה יכול לתרום גם שינויים בביטוי הגנים בין תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים הליך הקמת תרבויות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית של העורלה עורי האנושי fibroblasts. לאחר מכן נתאר את נהלי עיכוב חדש שעתוק בתאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית עם ואקטינומיצין D (ActD). טיפול ActD מייצג גישה ישירה, לשחזור בריא שעתוק חדש מהשחתה תעתיק. חיסרון של טיפול ActD היא כי מסלול הזמן חייב להיות מוגבל למסגרת זמן קצר כי ActD משפיע על התא הכדאיות. התעתיק רמות מנוטרים לאורך זמן לקביעת תעתיק הניוון. הליך זה מאפשר הזיהוי של גנים איזופורמים כי התערוכה הריקבון הדיפרנציאלי ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית.
מבוא
רמות מצב יציב של הפרוטוקולים משקפים את התרומה של התעתיק סינתזה ודעיכה תעתיק. מוסדר והוא תעתיק מתואמת דעיכה מנגנון חשוב לשליטה תהליכים ביולוגיים1,2,3,4. לדוגמה, התעתיק הניוון הוכחו לתרום הסדרה הטמפורלי של אירועים בעקבות ההפעלה על-ידי הגידול נקרוזה מקדם ציטוקינים דלקתיים5.
אנחנו הראו בעבר כי המעבר בין התפשטות תרדמה בתוך ראשי fibroblasts האנושי קשורה לשינויים ברמות תעתיק של גנים רבים6. חלק משינויים אלה משקפים הבדלים בפעילות של גורמי שעתוק בין שתי מדינות אלה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי המוסדיים סקירה קרשים אוניברסיטת פרינסטון, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.
1. מכינים את Fibroblasts מתרבים ומגדלי עכבות-קשר לקורס ActD זמן
הערה: פרוטוקול זה משתמש של timecourse עם ארבע timepoints. ניתן לאסוף שלוש דוגמאות ביולוגית עצמאית לכל timepoint על ידי איסוף תרביות רקמה שונים לוחות בניסוי אחד, או הניסוי יכול לחזור מספר פעמים עם תרבויות שונות של תאים. מניסיוננו, צלחת תרביות רקמה אחת של 10 ס מ (קוטר) (לוח אחד) מספק RNA מספיק לניתוח. במידת הצורך, באפשרותך איחדו מספר מנות תרביות רקמה עבור כל דגימה להגדיל את מספר תאים על כל timepoint. בנוסף, ניתן לבצע את הניסוי באותו fibroblasts מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנחנו דיווחו בעבר כי התוצאות של microarray ניתוחים של התעתיק הניוון ב מתרבים ומגדלי עכבות-קשר fibroblasts אנושי ראשוני על קורס 8 שעות זמן12. רשימת גנים עם שינוי משמעותי ביציבות התעתיק השוואת fibroblasts מתרבים ומגדלי עכבות-קשר הינו מסופק משלים טבלה 1. עוצמות קרינה פלואורסצנטית בזמן אפס ומעלה קורס זמן לאחר טיפול ActD הינם מסופקים. גנים נכללו ברשימה על-ידי קביעת הגנים יש מדרונות שונה באופן משמעותי בתנאים מתרבים ומגדלי עכבות-קשר באמצעות מבחן-ANOVA F. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תרדמה יכולה להיגרם על ידי אותות חיצוניים כולל נסיגה של mitogens או סרום, חוסר הידבקות תאים, וניגוד קשר. סימן דיכוי, אחת השיטות אפשריות מרובים עבור גרימת תרדמה, הוא תהליך מאוד אבולוציונית שנשמרת שבו תאים יציאה מחזור התא proliferative בתגובה מגע לתא. אנו מתמקדים כאן סימן דיכוי כדוגמה שיטה לזירוז תרדמה. מחקרים קודמים דיווחו כי קשר תא-cell יכול להשפיע על microRNA להן25, לכן, התוצאות לספק מידע על שיטת תרדמה אחת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע אילו שינויים הקשורים תרדמה למשל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.
תודות
HAC היה המלומד במילטון אי קסל של קרן אלן ריטה (http://www.ritaallenfoundation.org). עבודה זו מומן על ידי מענקים HAC מן המרכז הלאומי הכללי לרפואה למדעי מענק הצטיינות P50 GM071508 (חוקר פרטי דוד בוטשטיין), 2007RSGl9572 גרנט חברת פארמה הקרן, הלאומית למדע קרן OCI גרנט-1047879 דוד לאוגוסט, המכון הלאומי של גנרל רפואי מדעי R01 GM081686, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית R01 GM0866465, אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר בתאי גזע CTSI המרכז לבריאות/UCLA NIH של הנשים איריס חזן גרנט UL1TR000124, והחברה לוקמיה לימפומה. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P50CA092131. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צנטריפוגות לצינורות מיקרו-צנטריפוגות המסוגלות להגיע ל-12,000 x g ו-4° C | |||
| ציוד להפעלת ג'ל | |||
| צלחות תרבית רקמות סטריליות וצינורות חרוטיים | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| סרום בקר עוברי | VWR | 35-010-CV | |
| פיפטות סרולוגיות סטריליות, פיפטורים וקצות פיפט לתרבית רקמות | |||
| פיפטות חד פעמיות עטופות בנפרד, ללא Rnase, קצות פיפטות וצינורות לבידוד וניתוח | |||
| כפפות חד פעמיות שיש ללבוש בעת טיפול בריאגנטים ודגימות | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | לטיהור משטחי עבודה מצינורות |
| RNase 2.0 מ"ל אפנדורף | |||
| טריפסין-EDTA פתרון 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| סטרילי PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | מעכב שעתוק |
| סטרילי DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | ממס לאקטינומיצין D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc מוצר |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 ביולוגיה מולקולרית כיתה | |
| אתנול | פישר Scientific | BP28184 | ביולוגיה מולקולרית כיתה |
| RNase ללא גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל תמיסה מימית) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | נשא למשקעי |
| RNAערכת TURBO ללא DNA | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | מסירה DNA עם DNase, ואז, בשלב הבא, משבית את ה-DNA ומסיר קטיונים דו-ערכיים |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc מוצר |
| טוען צבע לג'ל RNA | Thermo Fisher Scientific | R0641 | מתאים אפילו לדנטורזה |
| של סמני | Millenium RNAThermo Fisher Scientific | AM7150 | סולם RNA |
| ערכת RNA בצבע אחד Agilent | Technology | 5188-5282 | דוגמה לבקרת ספייק אין לניתוח מיקרו-מערך Agient |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | כיתה ביולוגיה מולקולרית, עבור מאגר TAE |
| חומצה אצטית קרחונית | Fisher Scientific | A38-500 | עבור מאגר TAE |
| EDTA | Fisher מדעי | BP120-500 | אלקטרופורזה כיתה, עבור ג'לים |
| אתידיום ברומיד | Millipore Sigma | E7637 | לביולוגיה מולקולרית |
| RNA חיצוני בקרות קונסורציום RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | בקרת ספייק אין עבור RNA Seq |
| TruSeq ערכת הכנת ספריית mRNA תקועה A (48 דגימות, 12 אינדקסים) | Illumina | RS-122-2101 | עבור RNA Seq |
| 96 בארות 0.3 מ"ל PCR צלחת תרמו | פישר סיינטיפיק | AB-0600 | לאטמי דבק qPCR |
| Microseal B | Bio-Rad | MSB1001 | |
| למאגרי ריאגנטים qPCR Rnase/Dnase | VWR | 89094-662 | עבור qPCR |
| Rnase/Dnase-free בזמן אמת שמונה רצועות וכובעים | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | עבור qPCR |
| בזמן אמתSuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | עבור qPCR בזמן אמת |
| AMPure XP חרוזים | בקמן קולטר | A63880 | עבור qPCR בזמן אמת |
מקורות
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
