מאמר שיטה

רולר ששונתה שיטת צינור לדימות לסירוגין במדויק לשפות אחרות וחוזר על עצמו במהלך תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח בכל מערכת סגורה

DOI:

10.3791/56436

⸱

28 בדצמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הציגו כאן היא שיטת צינור רולר ששונה culturing, לסירוגין דימות ברזולוציה של המוח מכרסמים פרוסות בשבועות רבים עם שינוי מיקום מדויק על photoetched coverslips. הכדאיות עצביים, מורפולוגיה פרוסה מתוחזקים היטב. יישומים של השיטה במלואו סגור באמצעות וירוסים עבור ביטוי מסוים סוג התא הינם מסופקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוסות המוח מכרסמים בתרבית שימושיים הלומדים את ההתנהגות תאית ומולקולרית של נוירונים, עכשיו, דונלד סביבה המתחזק רבים של האינטראקציות שלהם נורמלי ויוו . פרוסות המתקבל מגוון של קווים העכבר הטרנסגניים או השימוש וקטורים נגיפי עבור ביטוי של חלבונים fluorescently מתויגות או כתבים פרוסות המוח פראי סוג לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. למרות פותחו מספר שיטות הדמיה פרוסות המוח, שילוב התרבות פרוסה עם היכולת לבצע דימות ברזולוציה חוזרות של תאים ספציפיים בפרוסות בשידור חי על פני תקופות זמן ארוך יש היוותה בעיות. הדבר נכון במיוחד כאשר נגיפי וקטורים משמשים עבור ביטוי של חלבונים אקסוגני מאז זה נעשית בתוך מערכת סגורה כדי להגן על המשתמשים ולמנוע זיהום לחצות. פשוט השינויים שבוצעו בשיטת תרבות רולר פרוסה המוח צינור לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה חוזרות של פרוסות במשך שבועות רבים במערכת סגורה מדווחים. Culturing פרוסות על photoetched coverslips מאפשר את השימוש סימני fiducial למיקום במהירות ובדיוק את הבמה כדי תמונה של שדה זהים לאורך זמן לפני ואחרי טיפולים שונים. דוגמאות מוצגים עבור השימוש בשיטה זו בשילוב עם מכתים עצביים מסוימים, ביטוי לבחון שינויים בארכיטקטורת פרוסה בהיפוקמפוס ויראלי בתיווך ביטוי עצביים של חלבונים פלורסנט, הפיתוח של פתולוגיה cofilin, אשר נצפתה בעבר בהיפוקמפוס של מחלת אלצהיימר (AD) בתגובה לטיפול פרוסה עם oligomers של פפטיד עמילואיד-β (Aβ).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התרבות העיקרי של נוירונים הפומבית מאזורים במוח מכרסמים היא כלי חשוב משמשים חוקרים לבחון את התגובות באופן פתולוגי בהפרות גירויים. אולם, מחקרים כאלה יש החיסרון להסתכל על נוירונים בדו מימד בלבד וללא מערכת תמיכה גליה שלהם. יתר על כן, אלא אם כן גדל בתנאים של צפיפות גבוהה מאוד (640 מ"מ/נוירונים2 או כ- 16% של שטח פנים) אותה הופכת בלתי אפשרי לעקוב את תוצר אקראי של דנדריט או האקסון יותר במרחק קצר מן הגוף תא, בהיפוקמפוס הכדאיות עצביים מעל 4 שבועות מסרב באופן משמעותי1, הגבלת השימוש של תרבויות הפומבית ללימודים מורחבים של פתולוגיות הקשורות לגיל. Culturing הפרוסות מקריסטלים של המוח מכרסמים הוא אופציה אטרקטיבית מתגבר על מגבלות אלה על-ידי שמירה של ארכיטקטורה התא מאורגן ואת הכדאיות במשך שבועות או חודשים. תנאים לשמירה על אזורים שונים רבים של המוח מכרסמים בתרבות פרוסה כבר מתואר2.

שתי שיטות העיקריים נמצאים בשימוש נרחב עבור תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח: culturing על ממברנות אוויר נוזלי ממשק3 או culturing על coverslips צינורות אטום הרשאה עושה סיבוב חממה רולר לספק אוורור4. פרוסות תרבותי על ממברנות יכול לדימות ישירות עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה פלורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ זקופה של מים טבילה מטרות5. לחלופין, פרוסות תרבותי על ממברנות הועבר לטיפולו כלי הזכוכית התחתונה כדי להשיג ברזולוציה טובה של הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה של6. עם זאת, שתי שיטות הדמיה פרוסות גדל על ממברנות הן מערכות פתוחות דורשים שינויים בינוני, לעתים קרובות להשתמש פטריות ו/או אנטיביוטיקה כדי למנוע או להפחית זיהום5,6. פרוסות על קרום-הממשק אוויר-בינוני לשמור על הישרדות ומורפולוגיה מעולה, אך חוזרים שוב ושוב אל מיקומים מדויקים במהלך דימות חוזרות בהגדלה גדולה היא משימה קשה ביותר, אלא אם הניסוי הוא בעקבות קבוצות קטנות בלבד של תאים הבעת סמן פלורסנט. למרות פרוסות גדל על ממברנות השתמשו בביטוי ויראלי בתיווך של5,transgenes6, פרוטוקולי אבטחה עשויה לדרוש מערכת תרבות סגורה להיות מועסק מסוימים וקטורים ויראלי המשמשים עבור ביטוי fluorescently מתויגות חלבונים ו כתבים של פיזיולוגיה של התא. יתר על כן, מטרות טבילה דורשים טיהור בין הדגימות שהופיעו לאחר מכן תרבות5. יישום מרכזי אחד של תרבויות ממשק ממברנה היא שילוב הדמיה ברזולוציה גבוהה עם אלקטרופיזיולוגיה-פעם נקודות7.

שיטת צינור רולר עם coverslips בתוך צינור פלסטיק אינו מתיר כל אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה ברזולוציה גבוהה מבלי להסיר את coverslip. לכן, בשיטה זו הוחלה לרוב על מחקרים ארוכי טווח שבו קיבוע שאחרי תצפיות שנעשו8. המתוארים כאן היא שיטה מנצל את הטכניקה תרבות של שפופרת רולר, אך על צינורות קדח-אאוט עם פרוסות על coverslips זה יכול לדימות שוב ושוב ככל התרבויות נשמרים. מערכת סגורה דורש שינוי בינונית עבור הדמיה, מנצל photoetched coverslips לספק סימני fiducial לאפשר הדמיה בהגדלה גדולה, לאחר ימים או שבועות, השדות מדויק בעבר עם תמונה.

אנו מיישמים שיטה זו לבחון שינויים בהיפוקמפוס מכרסמים, אזור מרכזי המוח המעורבים זיכרון ולמידה. מכרסמים ההיפוקמפוס הוא למד לעיתים קרובות כמודל עבור שינויים פתולוגיים או הקשורות לגיל נצפתה במהלך הפיתוח של פגיעה קוגניטיבית9, כגון אלה המתרחשות לספירה. השיטה שלנו מתאימה במיוחד ללמוד שינויים פתולוגיים להתפתח בתוך פרוסה אחת לאורך זמן בתגובה לשינויים סביבתיים, כגון העלאות Aβ פפטידים, אשר מאפיינת של המודעה8. פתולוגיה אחד המשויך מכרסמים ואנושי המוח לספירה היא הנוכחות של cofilin-אקטין אגרגטים והם מוטות, חבילות המכילות האחרון של חוטים cofilin, אקטין 1:1 יחס טוחנת10,11, 12. נצפו מוטות פרוסות קבוע של ההיפוקמפוס עכברוש לאחר הטיפול Aβ, כמו גם בתוך פרוסה המוח מכרסם חי לבטא cofilin-GFP נתון היפוקסיה8, הם עשויים לתרום תפקוד סינפטית ראיתי במודעה וקו. כאן אנו משתמשים culturing שיטה חדשה להתבונן על מסלול הזמן והפצה בתוך פרוסות של ביטוי חלבונים אקסוגני chimeric פלורסנט שהוצגו על ידי נגיפים שונים. אנחנו ואז לנצל את הביטוי הספציפי עצביים של מבנה הכתב cofilin לעקוב אחר ההתפתחות של cofilin רוד, פתולוגיה צבירה בפרוסות בהיפוקמפוס בתגובה לטיפול עם Aβ מסיסים oligomers (Aβo).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בבעלי חיים בעקבות גידול שאושרו ופרוטוקולים שימוש בבעלי חיים שמתאימים טיפול בעלי חיים, שימוש בהנחיות של קולורדו סטייט.

הערה: פרוטוקול שלהלן מתאר את השיטה הכנה ותרבות דגירה ארוך טווח, הדמיה לסירוגין של פרוסות בהיפוקמפוס. בהיפוקמפוס פרוסה אחת מחוברת coverslip photoetched שהוכן באמצעות קריש פלזמה ולאחר מכן coverslips חתומות על הצד השטוח של צינור רולר קדח-אאוט, אשר נשמר בחממה רולר. קרישי דם פלזמה הם מומס עם פלסמין לפני זיהום ויראלי ביטוי חלבון פלואורסצנטי, דימות ברזולוציה גבוהה. הפלורסנט חיוני עצביים משמש לשיקוף נוירונים בתוך הפרוסות.

1. הכנת מתלה צינור רולר

  1. השתמש בתבנית המוצגת באיור 1A מודפס לגודל שמוצג על סרגל קנה מידה. עם מסמר, אגרוף חורים קטנים (גדול מספיק על סמן הצבע בסדר) בתבנית שבמרכזה החורים.
  2. הגדר את התבנית בתחתית צלחת תרביות רקמה 15 ס מ (קוטר נומינלי של 14 ס מ) ולסמן את מיקום החורים. חזור על זה בצלחת שניה.
  3. עם מקדחים מיועדים לשימוש על פלסטיק, תרגיל 6 חורים בקוטר 1.5 ס מ על כל מנה במערך משושה (4.8 ס מ מרכז למרכז) עם חור מרכזי 2.5 ס מ מהקצה של המנה. תרגיל 12 מ מ מהקצה הממוקמות equidistantly בין שני חורים גדולים יותר כפי שמוצג באיור 1Aשלושה חורים (3 מ מ קוטר).
  4. עם תחתית של כל מנה אחד מול השני, במקום 2.5 אינטש זמן מכונת בורג (3/16 ס מ קוטר) עם דסקית שטוחה באחד החורים קטנה ואחריה דסקית שטוחה השני חתיכה של פוליאתילן אבובים (מרווח, 4.7 ס"מ), עוד יתד נגדית , המנה תרביות רקמה שנייה, עוד יתד נגדית, דסקית נעילה, אגוז.
  5. חזור על שלב 1.4 על שני ברגים במכונה אחרים, והידוק רק באופן רופף עד ברגים במכונה כל נמצאים במקום. ואז להדק את האגוזים בצורה מאובטחת.
  6. לעבוד את grommets (5/16 אינץ 5/8 אינץ ' עבה, חור קוטר) לתוך החורים של המנה התחתון כדי להשיג הצינור רולר הסופית מתלה (איור 1B; מוצג עם שני צינורות במקום). מקם מדבקה על כל מדף עם מספר ייחודי.

2. הכנת Coverslips שפופרות רולר

  1. ביצוע רוסמ קידוח החור בשנת רולר צינורות
    1. לקדוח חור 1.5 ס מ 8 ס מ עמוק בצד מרכז של 2 x 4 x 5.5 ס מ בלוק עץ בזווית כזו כי הצד השטוח של רולר צינור רצון להיות כמעט מקביל עם הרחוב בעת הכנסתו (איור 2א).
    2. להגדיל את החור באמצעות קובץ עץ עגול הרחב והן להתחדד החור כדי לאפשר החדרת צינור (רולר צינורות הם קצת יותר גדולים בקוטר לקראת הסוף cap) (איור 2B).
    3. לקדוח 1.5 ס מ קוטר אנכי חור, 5.5 ס"מ מהצד של הבניין, ממורכז מעל לחור צד (איור 2C).
    4. כאשר החור צד הוא צמצום מספיק, הכנס צינור רולר המסומן במקום הרצוי למרכז החור על הפרוסה, מקם את הצינור כך המקום המסומן ממורכזת בתוך החור אנכי 1.5 ס מ.
    5. הסר את הצינור, למדוד את המרחק בין הנקודה בסוף הצינור. לסמן את המרחק ממרכז של החור. החגיגה והכנס מסמר כדי לספק עצירה כראוי למקם את צינור קידוח (חץ באיור 2C).
    6. השתמש מסור לנתק את המסמר בסימני ההיכר של גוש עץ כדי למנוע פגיעה.
    7. להוסיף קליפים האביב על החלק התחתון של התוכנית, אם יש לי. עם חריצים המאפשרים לה להיות מעוגן (איור 2D שחור חץ). אחרת, השתמש סוגרים C להחזיק את החגיגה בצורה מאובטחת על גבי העיתונות קודח.
  2. באמצעות ג ' יג שתוארו לעיל החזק של הצב צינור פלסטיק תרבות שטוח צדדית 11 ס עם הצד השטוח (איור 2א), לקדוח חור בקוטר 6 מ מ עם המרכז 1.0 ס מ מהתחתית וממורכז בין הצדדים של הצינור.
    הערה: מקדחה המיועדת פלסטיק אמור לשמש.
  3. עם כלי deburring מסתובב, להחלקת קצות החור (איור 2E) ולעשות 4 חריצים מבפנים הקצה של החור (איור 2E, הזחה) כדי להקל על ניקוז של החור במהלך הסיבוב.
  4. עם חור 12 מ"מ אגרוף, לחתוך דיסקים בקוטר 12 מ"מ גליונות גומי סיליקון דבק צדדית כפולה רעיל. באמצעות אגרוף נייר חור אחד רגיל (6 מ מ קוטר), לעשות חור במרכז כל דיסק.
  5. לשטוף את צינורות קדח עם 70% אתנול, אוויר יבש אותם בבטיחות ביולוגית ארונית, ולחטא הצינורות ודיסקים דבק מנוקב למשך 40 דקות תחת מנורת UV (30 W במרחק ממוצע 70 ס"מ) בארון הבטיחות הביולוגי.
  6. למקם מחדש את צינורות ודיסקים לאחר 20 דקות כך כל המשטחים החשופים סטריליים. תחת תנאים סטריליים, לקלף את וייט מוותר מדיסק דבק, ולהצמיד את גומי סיליקון החיצוני של שפופרת, יישור החורים (איור 2F).
    התראה: כדי למנוע חשיפה UV, לענוד הגנה העין וסגור הקבינט לפני להדליק את מנורת UV.
  7. נקה 12 מ מ קוטר photoetched (100 מרכז ממוספרים 1 מ מ ריבועים) גרמני coverslips זכוכית דקה. החזק את coverslips בעדינות עם מלקחיים וטבול אתנול מוחלטת, ואחריו מים, ואחריו שוב, אתנול מוחלטת, בסופו של דבר לטבול את coverslips ב להבה לשרוף האתנול. לאפשר coverslips להתקרר.
  8. מחזיק את coverslips עם מלקחיים, לטבול בתוך 2% 3-aminopropyltriethoxysilane ב אצטון עבור שטיפה ס' 10 על coverslips במים הנדסה גנטית, לאפשר לאוויר יבש.
  9. להגדיר את coverslips על נייר סינון סטרילי בתוך בטיחות ביולוגית ארון, תדליק אור UV. לחשוף בכל צד של coverslips כעשרים דקות.
    התראה: כדי למנוע חשיפה UV, לענוד הגנה העין וסגור הקבינט לפני להדליק את מנורת UV.

3. בהיפוקמפוס פרוסה הכנה

  1. לפני שמתחילים את הקרע, היכונו חצאים של סכיני גילוח פיפיות למסוק רקמות. מקפלים את הלהבים לאורכו בזהירות עם האצבעות והכנס לשניים.
  2. יש לשטוף את החצאים להב עם אצטון באמצעות מקלון צמר גפן כדי לנקות אותם, ולאחריה שטיפה מוחלטת אתנול, אוויר ייבוש.
לפני הרכבה להב חצי למסוק רקמות, לעקר אותה על ידי שטיפה עם 70% אתנול.
  • בצע את הפרוטוקולים אושרה על ידי המוסדיים חיה אכפת שימוש הוועדה; לאחר הרדמה איזופלוריין, המתת חסד גור עכבר או חולדה בת 4-7 יום ע י עריפת ראשו, להסיר את הראש עם מספריים או הגיליוטינה.
    הערה: פרוטוקול התרבות פרוסה המוח היא עצמאית של עכבר או חולדה זן או גנוטיפ. קווים העכבר הטרנסגניים רבים עם רקע גנטי שונה שימשו.
  • לשטוף את הראש עם 70% אתנול, ולמקם אותו 60 מ מ פטרי. עד הרכבה סופית הפרוסה המוח את השפופרת רולר, כל השלבים הבאים מבוצעות בתא למינארי כדי לשמור על עקרות.
  • באמצעות סכין כירורגית #21, לבצע חתך הסאגיטלי דרך העור הגולגולת. עם מלקחיים דומונט #5, פיל בחזרה את העור ואת הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
  • עם מלקחיים סגור, בעדינות להקניט המוח כולו, שחרור אותו על-ידי צובט עם המלקחיים דרך גזע המוח מאחורי המוח הקטן. מקום במוח תבשיל סטרילי 60 מ מ המכילה גלוקוז מאוזנת Solution/0.5% מלח של 4 ° C Gey (GBSS/גלוקוז).
  • באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה להמחיש את המוח (איור 3א), במקום הצד הגבי למוח, לחתוך את השליש הקדמי של המוח, המוח הקטן עם להב כירורגי (איור 3ב).
    1. עם מלקחיים, להחזיק את הצד האחורי של המוח החתוך למעלה ואת הצד הבטני כנגד הצד של הפטרי ליציבות. בעדינות להקניט קרומי המוח נמצא סביב האמצע הסאגיטלי ולהסיר את רקמת המוח האמצעי באמצעות בסדר משופעת דומונט #5 מלקחיים (איור 3C, עיגול מקווקו).
    2. לעשות שני חתכים לאורך הצד של המוח, כדי להפיץ את זה פתוח (איור 3C, קווים מקווקווים). ברגע המוח ממוקמת בצד הגבי למטה ופתח כפולה, פיסורה בהיפוקמפוס אמור להיות גלוי (איור 3ד', חץ).
    3. להעביר את המוח פתוח התפשטות חתיכה של הסרט פלסטיק polychlorotrifluoroethylene ומקם אותה שמגיע על הבמה של מסוק רקמות. להרטיב את הסכין עם GBSS/גלוקוז וקוצצים ההיפוקמפוס לפרוסות עבות ~ 300 מיקרומטר.
    4. עם פיפטה העברה, לרוקן את המוח הפרוס מהסרט פלסטיק לתוך תבשיל טריים 60 מ מ המכילה GBSS/גלוקוז (איור 3E). בעדינות לצבוט את ואת לקנטר משם, עם מלקחיים משופעת בסדר, קרומי המוח הנותרים ורקמות אחרות שאינן בהיפוקמפוס (איור 3F) מ. הפרוסות (איור 3G, H).

    • 4. ציפוי פרוסות

    1. פעם אחת פרוסות הושגו, מקום 2 µL של עוף פלזמה על המרכז בצד photoetched coverslip מוכן. מורחים פלזמה מעט כדי להשיג נקודה בקוטר 3-4 מ מ.
      הערה: הצד photoetched הוא הצד העליון של coverslip כאשר צפו דרך מיקרוסקופ ניתוח כזה כי המספרים הם שכיוונו כראוי.
    2. העבר 1 פרוסה המוח עם מרית צרות-קצה סטרילי (איור 4א') במקום פלזמה (איור 4B). להשתמש מלקחיים סגורות כדי לשמור על הפרוסה בקצה מרית כשאתם מרימים את הפרוסה GBSS/גלוקוז.
    3. תיגע המרית כדי לזהות את coverslip, ועם מלקחיים סגור הפלזמה, לדחוף את הפרוסה על גבי coverslip.
    4. 2.5 מיקס µL של פלסמה עם 2.5 µL של תרומבין בשפופרת נפרדים. במהירות מקום µL 2.5 של תערובת זו מעל ומסביב את הפרוסה ואת pipet למעלה ולמטה בעדינות לערבב את זה (איור 4B).
      הערה: הפלזמה ייקרש בתוך 10-15 s, כך זה צריך להיעשות במהירות. אם הפרוסה אדהזיה היא בעיה, מערבבים 5 µL פלזמה עם 5 µL תרומבין ולהשתמש µL 4-5 על הפרוסה, הסרת לאחר ערבוב כך הפרוסה שקרים שטוח על coverslip.
    5. הסר את כיסוי מן הצד החשוף של הדבק גומי סיליקון בעבר למוט צינור רולר הפלסטיק ברור ולמקם את coverslip עם הפרוסה המוח על גבי הדבק יישור הפרוסה בתוך החור (איור 4C).
    6. כדי להבטיח הדבקות, החל רכים, הלחץ אפילו coverslip עם האגודל על ידי לוחץ את coverslip באופן שווה ואני שומר את זה בשביל בערך 1 דקות בעת העברת אותו בארון לבטיחות ביולוגית.
    7. ב- cabinet בטיחות ביולוגית, להוסיף 0.8 מ ל א Neurobasal מלאה תרבות בינוני (טבלה של חומרים) כל שפופרת (איור 4D).
    8. זרימה של 5% CO2/95% תערובת אוויר דרך סטרילי מחובר כותנה פסטר פיפטה מוחזק באופן מאובטח על ידי מלחציים. לשטוף את הצינור רולר עם תערובת גז, במהירות קאפ הצינור כמו זה נסוגה מפני סביב פיפטה.
    9. תווית הצינורות עם המספר פרוסה, לצבור מספר. הכנס צינורות לתוך ארון רולר, להבטיח שהם מאוזנים גיאומטריים. אם יש מספר אי-זוגי של צינורות, להוסיף צינורות כדי לאזן.
    10. למקם את המדפים חממה רולר 35 ° C עם רולים מפנה המדף רולר-על 10-13 RPH (איור 4E). כדי לשמור את המדיום בתחתית של הצינורות, הטיה החממה בחזרה כ 5° באמצעות העלאת החזית על לוח.
    11. הזן את מספר פרוסה, שפופרת לתוך גיליון אלקטרוני, אשר משמש כדי להקליט את כל המידע של טיפולים פרוסה ותאריכים תצפית.
    12. על יום 6 בתרבות, להוסיף 1 µL (0.002 U) של פלסמין פעיל כל שפופרת.
    13. לאחר הקרישים מתמוססים לחלוטין (בדרך כלל תוך מספר שעות), להסיר את המדיום, והחלף אותו בינוני טריים ללא פלסמין. במידת הצורך, פרוסות יכול להיות מודגרות עם פלסמין בן לילה, המדיום השתנה ביום למחרת.
    14. פרוסות בדרך כלל מודגרת למשך 7-10 ימים לפחות לפני שימוש בניסויים. האחות בינונית ולהחליפו ביום 3 או 4, שוב על יום 7 ולאחר כל 7 ימים לאחר מכן.

    5. הכנה של וקטורים ויראלי ביטוי Transgene

    הערה: הביטוי של transgenes בנוירונים של תרבויות פרוסה מושגת או באמצעות המוח של מכרסמים מהונדס גנטית, או על ידי החדרת את transgene על ידי הידבקות בווירוסים לקוי שכפול רקומביננטי.Adenoviruses (AV), adeno-הקשורים וירוסים (AAV) ו- lentivirus רקומביננטי וקטורים כל היו בשימוש בתרבויות שלנו פרוסה בהיפוקמפוס להבעה של חלבון פלואורסצנטי שונים כימרות פרוסות המוח.

    1. להכין שכפול AV לקוי לביטוי את הרנ א עניין על פי השיטות שתוארו במקום אחר13,14. כייל נוגדנים וירוסים זיהומיות U/mL בשיטת דילול סדרתי באמצעות נוגדן כדי לשווק ביטוי חלבון כמו שמתואר14. לצפות cofilin אגרגטים היווצרות רוד cofilin-אקטין, לנצל את ה-cDNA cofilin-R21Q-mRFP (פלסמיד #51279)16.
      הערה: האמרגן 1 synapsin היא בחירה מצוינת עבור ביטוי מסוים עצביים15, בעוד האמרגן cytomegalovirus שימושית עבור נהיגה רמות הביטוי גבוהה סוגי תאים רבים13.
    2. להכין AAV על ידי שיתוף תקנים של העברת פלסמיד המכיל את הגן עניין פלסמיד נציג/כובע, עם או בלי פלסמיד המסייע, לתוך תאים אריזה HEK293, אשר מספקים את הגן E1 ויראלי, כפי שתואר לעיל17,18.
      הערה: Recombinant AAV יכולים להתבצע גם להכנסה יישוב לתוך הגנום התא המארח19. עבור פלסמיד העברה, אנו משתמשים אנושיים cofilin 1 מסומן C-מסוף mRFP1 קרינה פלואורסצנטית חלבון (פלסמיד #50856) משובטים לתוך synapsin המכילים מקדם AAV פלסמיד במורד הזרם חיישן GCaMP5G סידן20. פיסת דנ א קידוד הרצף פפטיד P2A עצמית שהפריד נוסף באמצעות PCR בין GCaMP5G ו- cofilin-RFP במהלך הכנת פלסמיד העברה למתן ביטוי של חלבונים שתי התמליל AAV יחידה21.
    3. הכן lentivirus רקומביננטי וקטורים באמצעות שיתוף תקנים של העברת פלסמיד המכיל את הגן או cDNA של אותות עניין ואינטגרציה, יחד עם lentivirus הדור השלישי אריזות תערובת המחלק את איסור פרסום ויראלי, פול פוט, rev ו גנים vsv-g על גבי שלושה פלסמידים נפרד22,23.
    4. עבור פלסמיד ההעברה, השתמש צעד אחד שכפול מערכת24 להרכיב את המקדם סינפסין ואת cDNA cofilin-R21Q-mRFP (מ פלסמיד #51279) לתוך pLKO.1-GFP (פלסמיד #30323), עם יזם סינפסין ו cofilin-R21Q-mRFP מחליף את hPGK יזם ו- GFP cDNA, בהתאמה.
    5. Transfect את פלסמיד הסופית לתאי HEK293T על ידי סידן פוספט כפי שתואר לעיל23.
    6. לאסוף בינוני ארבע המנות 10 ס מ, להתרכז כדי 500 µL באמצעות רכזים צנטריפוגלי 150 אלף דולר-הפסקת, לאחסן את lentivirus הסופית ב-80 מעלות צלזיוס aliquots קטן לאחר הקפאה מהירה בחנקן נוזלי. להפשיר רק פעם אחת aliquot שמאחורי הדבקת תאים.
    7. לקבוע מדעית שהנפח של כל סוג הוירוס מוכן להשיג את מידת הביטוי הרצוי על-ידי הגדרת מספר תרבויות פרוסה שונים לעקוב אחר הביטוי של transgenes לאחר ההדבקה עם כמויות שונות של וירוס.
      הערה: בדרך כלל, µL 1-10 של וירוס משמש לחתיכה.

    6. פרוסה טיפולים

    1. מדביק פרוסות עם וירוס
      1. עבודה של בטיחות ביולוגית הקבינט אישר עבור וירוס עבודה ברמת בטיחות ביולוגית מתאים וקטור, מערבבים aliquot של הנגיף (בדרך כלל 1-10 µL) 0.8 מ של מדיום מלאה.
      2. האחות האמצעי הפרוסה באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר למלכודת אוסף המכיל אקונומיקה. מלכודת משני משמש תמיד בין המלכודת הראשונה המקור ואקום.
      3. החלף בינוני aliquot המכיל וירוס המוכן מעל, לחזור הצינורות תרבות מתלה, ולמקם בחממה.
      4. אחרי 2-5 ימי המקננת את הפרוסות עם וירוס בארון הבטיחות הביולוגי, להסיר את המדיום המכיל וירוס עם פיפטה העברה סטרילי ולמקם אותו לתוך בקבוק המכיל סוכן אנטי ויראליים שאושרו להרוג וירוס.
    2. צביעת של נוירונים עם צבע חיוני
      1. להכין ולאחר לאחסן aliquots של הפלורסנט חיוני עצביים25 על-ידי µL 4 הקפאה מהירה של aliquots בחנקן נוזלי-ריכוז של 100 מיקרומטר ולאחסן אותם ב-20 ° C. לא ההקפאה/ההפשרה לצבוע יותר מפעם אחת.
      2. תווית נוירונים להמחשת על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, להפשיר aliquot אחד של לצבוע חיוני עצביים, לדלל עד 4 מ"ל במדיום Neurobasal מלאה (ריכוז לצבוע הסופי הוא 100 ננומטר).
      3. הסר את המדיום פרוסות על-ידי שאיפה (או עם פיפטה העברה אם המדיום מכיל וירוס) ולהחליף אותו עם 0.8 מ של המדיום המכיל 100 ננומטר לצבוע חיוני עצביים. להחזיר את הפרוסות מנגנון רולר בחממה.
      4. לאחר המקננת הפרוסות כבר שעתיים, תשאף המדיום המכיל צבע והחלף אותו 0.8 מ של טרי במדיום בטיחות ביולוגית ארון שלם.
        הערה: תיוג של נוירונים פרוסות עם צבע חיוני דורש כמה שעות של דגירה. תמונות ראשונות נלקחים בדרך כלל 24 שעות לאחר טיפול צבע. למרות נוירונים מסומנות באופן ספציפי, יש קרינה פלואורסצנטית רקע זה מסרב לתת יותר עצביים הדמיה במשך 2-3 ימים. עוצמת לצבוע חיוני מסרב לאחר 72 h.
      5. כדי לבצע שינויים מורפולוגיה פרוסה לאורך זמן, relabel את הפרוסות מדי 7 ימים.

    7. פורסים הדמיה

    1. להציג פרוסות על מיקרוסקופ הפוכה. עבור הדמיה פלורסצנטיות המבריקים, ב- 24 שעות לפני הדמיה, חילופי תרבות בינונית בינונית Neurobasal A מלאה ללא מחוון ה-pH פנול אדום.
      הערה: לניסויים דיווחו כאן, פרוסות נצפים על מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות דיסק מסתובב הפוך מצויד פונקציה קווית מקודד x, y הבמה עם אלמנט פייזו z ובקרה מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה רגיש.
    2. העברת הצינור עם התרבות פרוסה לדימות של המנגנון צינור רולר לפני מחזיק שפופרת בהזמנה אישית (איור 5א), אשר ממוקם המתאם הבמה (איור 5B), כדי לשמור על coverslip בניצב המטרה לשמור על הפרוסה בכיוון זהה במהלך מפגשים הדמיה חוזרות על מרווחי זמן.
    3. לדחוף את המחוון על המתאם הבמה צמוד על צינור כדי להחזיק את הצינור בעמדה (איור 5B).
    לשמור על טמפרטורה פרוסה ב 35 ° C במהלך דימות באמצעות חימום רצועות ובקר thermoregulatory בנוי לתוך המתאם הבמה בהזמנה אישית (איור 5C).
    הערה: פרטים של בעל שפופרת, שלב מתאם, ניתן לגשת חימום: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • באמצעות כוח נמוך (למשל., 4 X) אובייקטיבית, transillumination שדה בהיר, להתמקד דפוס רשת photoetched (איור 6א) תחת הפרוסה. עבור הדמיה ההפעלה הראשונית, סריקה מהירה מסביב הפרוסה לאתר ולתעד את המספר עבור אזורים שונים שבהם רצוי הדמיה הגדלה גבוהה יותר (למשל, cornu ammonis (CA) 1, CA3, הפיתול משוננת (DG), וכו ').
  • להעביר את הבמה מקודדים הראשון המכיל אזור בעל עניין. לעבור 20 X המטרה אוויר ואתר סימן fiducial (למשל., עצה של מספר חרוט) (איור 6B).
  • לעבור אל יעד כוח גבוה (40 X או 60 X), בתרגום את מארק fiducial, ו ואז רשומת ה-x ואת y מיקום הבמה. הזז את הבמה כדי למצוא את השדות של עניין הסמוך ו שיא שלהם x ו- y הסטת מסימן fiducial (איור 6B, חץ). חזור על תחומים אחרים ברשת, אם רצונך בכך.
    הערה: העמדות את סט מסימן fiducial לאפשר פיתוח עקבית של coverslip באותו המיקום בעת הפרוסה הוא עם תמונה, אף-על-פי המקורי x, y הגדרה של הסימן fiducial משנה כאשר מתאם צינור או שלב הם להסיר והחליפו.
  • ללכוד את התמונה Z-מחסנית בתוך כל אחד מהשדות שנבחרו באמצעות הפקד אובייקטיבית מיקרוסקופ או פקד הבמה piezo, אם הם זמינים.
    הערה: התמונה מטוסים מתקבלים בדרך כלל במרווחים של 0.5 מיקרומטר 2 מיקרומטר, תלוי בגודל הרזולוציה הרצויה של תכונות התמונה. בניית תמונה תלת-ממד באיכות דורש כי תכונות תמונה להתמשך על פני מישורים מרובים של רכישה, אז כדי להמחיש התכונות קטנים יותר, במרווחים קטנים יותר יש צורך בין מישורי.
  • שמור את הסכום הכולל הדמיה זמן קצר ככל האפשר לכל פרוסה.
    הערה: רוב ההפעלות הדמיה דיווחו כאן היו תחת 18 min/פרוסה. עם זאת, לנו יש תמונה כמה פרוסות עשר או יותר פעמים, אפילו בתור עוד 40 דקות במושב בודד, ללא פגיעה נראית לעין ההישרדות לטווח ארוך של הפרוסה.

    • הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    כדי לקבוע במדויק איך יכול להיות מנוצל סימני fiducial כדי reimage אותם התאים בתוך אותם שדות לאורך זמן, בדקנו פרוסות גדל על coverslips photoetched (איור 6א). נוירונים היו דמיינו ידי מכתימה עם צבע חיוני (100 ננומטר עבור 2 h; אינו מכתים תאים שאינם עצבית), אשר נעלם נוירונים לאורך זמן מבלי לפגוע בתאים25. זיהינו fiducial של מארק בכיכר רשת יחיד (איור 6A, B), נמצא באזור של נוירונים...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    צינור רולר השיטה המתוארת כאן מאפשר לטווח ארוך culturing והדימות ברזולוציה גבוהה בשידור חי של רקמת המוח הפרוס. בעיה גדולה אחת עם טכניקה פרוסה כפי שהוא מיושם כאן הוא הרכבה ותחזוקה של פרוסות. ציפויים Coverslip התומכים אדהזיה פרוסה, לקדם פרוסה דליל על ידי שיפור את המוצלח neurites והעברה של תאים מחוץ הפרוסה; לכן, אנחנו נמנע השימוש של סובסטרטים אלה. הכניסה של קבוצות אמינו לתוך הזכוכית על ידי טיפול עם 3-aminopropyltriethoxysilane שיפור הדבקות של פרוסות, אבל פלזמה עוף קטן מדי או יותר מדי על coverslip עשוי גם לגרום לבעיות הדבקות ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    תחתיות מכלי תרבות 15 ס"מVWR Scientific25384-326
    ברגי מכונת ראש פיליפס (#10-32)Ace Hardwareבאורך 2.5 אינץ' ובקוטר 3/16 אינץ'
    דסקיות שטוחות #10למכונת חומרה
    (#10-32)חומרה
     חומרת5/16 אינץ', עובי; 5/8 אינץ', קוטר חור; 1.125 אינץ',
    צינורות פוליאתילן OD (5/16 אינץ'; OD, 3/16 אינץ'; מזהה)חומרתחתוכה באורך 1.8 אינץ'
    מכונת כביסה מנעול #10מקדחה חומרה
    ACE, 5 מהירויות Ace HardwareProTech דגם 1201
    Nunclon Delta צינורות שטוחיםVWR62407-076
    מקדחים, 3 מ"מ, 6 מ"מ ו-15 מ"מ Ace HardwareDiablo freud מותגמקדחים לחיתוך פלסטיק.
    Ace Hardware1.5 ס"מ ו-1 מ"מ
    , תפסי קפיצים עגוליםAce Harware
    , מחזיק הצמד 16 מ"מAce Hardware
    יריעת סיליקון דביקה
    ניקוב חורים 6 מ"מניקוב חורים Office Max
    12 מ"מthepunchbunch.com
    70% אתנול
    כיסויים פוטוטכנולוגיים, קוטר 12 מ"מBellco Glass, Inc.1916-91012
    מבער
    אתנול
    מים
    3-אמינופרופילטריאתוקסילןסיגמא-אולדריץ'A3648
    אצטוןסיגמא-אולדריץ'179124
    #5 מלקחיים דומונטכלים מדעיים עדינים11251-30
    קוצץ רקמות מקלוויןטד פלה, בע"מ10180
    סכיני גילוח כפוליםטד פלה, בע"מ121-6
    נייר סינון WhatmanVWR28450-182חתוך לעיגולים בקוטר 5.8 ס"מ
    פולי-כלורו-טריפלואורו-אתילן (Aclar)טד פלה, בע"מ10501-10חתוך לעיגולים בקוטר 5.8 ס"מ
    #21 להב כירורגיVWR Scientific25860-144
    #5 מלקחיים של דומונטכלים מדעיים עדינים11251-30
    מרית, אל חלד עם קצה מחודדVWR82027-518
    תמיסת מלח מאוזנת של גייסיגמא-אולדריץ'G9779 
      גלוקוזThermoFisher Scientific15023-021תמיסת 25% (w/v), מסנן 0.2 מ"מ
    מעוקר עוף פלזמהCocalico Biologicals30-0300-5Lלחות במים סטריליים, צנטריפוגה ב-2500 x גרם 30 דקות ב-4 מעלות; C, הקפאה מהירה של חנקן נוזלי ואחסון ב-  -80 מעלות צלזיוס.
    תרומבין, מקומי (בקר)פייזרתרומבין-JMIהקפאה מהירה בחנקן נוזלי ב-1,000 יחידות בינלאומיות/מ"ל בדילול המסופק ומאוחסן ב-80&80 מעלות צלזיוס. יש להשתמש ב-250 יחידות/מ"ל.
    מערכת רולר תאיםBellco BiotechSciERA
    חממת רולרפורמהדגם 3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    עט / סטרפטוקוק (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 מ"מ גלוטמיןThermoFisher Scientific25030081
    גלוקוזThermoFisher Scientific15023-021תמיסת 25% (w/v), מסנן 0.2 מ"מ מעוקר
    NeuroBasal AThermoFisher Scientific10888-022 מדיום מלא: 48 מ"ל נוירובזל A, 1 מ"ל N21-MAX, 0.625 מ"ל 200 מ"מ גלוטמין, 0.180 מ"ל 25% גלוקוז, 0.250 מ"ל 100x עט/סטרפטוק.
    אריזות לנטי-וירוס מהדור השלישיLife TechnologiesK4975-00
    159 K מסננים צנטריפוגליים מנותקים (צנטריקון)EMD Millipore
    מערכת שיבוט לנטי-ויראלית (InFusion)Clonetech
    Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
    Neuronal Cell כדאיות צבע (NeuO)טכנולוגיות תאי גזע1801להפשיר פעם אחת ולהקפיא במהירות ב-4 ומיקרו; L aliquots. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
    מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX83
    מטרות מיקרוסקופאולימפוסאוויר: 4X, 20; שמן: 40X, 60X,
    מערכת קונפוקלית דיסק מסתובבYokagawaCSU22
    מיקרוסקופ EMCCD מצלמתפוטומטריהמפל II
    מקודד ליניארי (x,y), piezo z שטוח שלב עליוןASI
    מיקרוסקופ לייזרים ואינטגרציהחידושי הדמיה חכמה HEK293T תאים
    Type Culture CollectionCRL-3216
    HumanPlasmin Sigma AldrichP18670.002 U/mL ב-0.1% אלבומין בסרום בקר 0.1% (0.2 מ"מ מסנן מעוקר), הקפאה מהירה בחנקן נוזלי ואחסון ב-80 מעלות צלזיוס.
    אגוזי בורג ACE לולאות גומי ACE ACE ACE מקדחים לעץ, קובץ עץ של כלי פירוק ראש מסתובב של , 5 אינץ' Ace Hardware 26307 (חותם מאובטח) Grace Bio-Labs 666581 עובי 0.5 מ"מבונסןמוחלטננו-טהורים American

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
    2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
    3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
    4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
    5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
    6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
    7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
    8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
    9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
    10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
    11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
    12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
    13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
    14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
    15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
    16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).
    17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
    18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
    19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
    20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
    21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).
    22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
    23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27(2010).
    24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89(2015).
    25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
    26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
    27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
    28. Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
    29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
    30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10(2011).
    31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).
    32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6(2015).
    33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    Brain Slice CultureRoller Tube MethodPhotoetched CoverslipsFluorescence ImagingViral Vector ExpressionNeuronal Vital DyeConfocal MicroscopyHippocampal SlicesLong term CultureEnclosed System

    מאמרים קשורים