אנו מתארים את השלבים מגוונות כדי להשתיל סיליקון כרונית הגששים וכדי להקליט את המקום התאים בעכברים כי הם הראש-קבוע על מנגנון מועשרת cue הליכון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השרשה של הגששים סיליקון כרונית ורישום של תאים בהיפוקמפוס המקום מכשיר הליכון מועשר
במאמר זה
סיכום
תקציר
נחוץ חשוב להבנת תפקוד המוח הוא הזיהוי של התנהגות, פעילות התאים מופיע. סיליקון רגשים מתקדמים אלקטרודות להקלטה אלקטרופיזיולוגיות בקנה מידה גדול של פעילות. עצבית, אך נהלי השרשה כרונית שלהם לא מפותחים. הפעילות של תאים בהיפוקמפוס המקום ידוע לתאם עם העמדה של חיה בסביבה, אבל המנגנון הבסיסי לא ברורים. כדי לחקור את המקום התאים, כאן נתאר סט של טכניקות אשר נע הזיוף של מכשירי בדיקה כרונית סיליקון שתלים אל הפיקוח על המקום שדה פעילות מנגנון מועשרת cue הליכון. של מיקרו-נסיעה וכובע נבנים על ידי התאמת והידק יחד מודפס 3D חלקי פלסטיק. בדיקה הסיליקון הוא רכוב על המיקרו-הכונן, ניקה, מצופה צבע. ניתוח הראשון מתבצע כדי לתקן את הכובע על הגולגולת של עכבר. אתרים קטנים מפוברק, המצורפת את החגורה של הליכון. העכבר שאומן להפעיל את הראש-קבוע על ההליכון. ניתוח נוסף מתבצע כדי להשתיל את החללית סיליקון בהיפוקמפוס, בעקבות אותות אלקטרופיזיולוגיות בפס רחב אשר נרשמים. לבסוף החללית הסיליקון הוא התאושש, ניקה לשימוש חוזר. הניתוח של המקום פעילות התאים בתוך ההליכון חושף מגוון של מנגנונים שדה המקום, חלוקה לרמות את היתרון של הגישה.
מבוא
הגששים סיליקון להציג מספר יתרונות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות, לרבות העובדה כי הן מעוצבות עם פרופילים חדה למזער נזק לרקמות, כי הם מציגים פריסה מדויק של בצפיפות הקלטה אתרים1, 3, 2,4. הם משמשים כדי ללמוד מערכות שונות במינים שונים, כולל בני אדם3,5,6, עם גישות מגוונות1,7. ובכל זאת, השימוש חוזרים ונשנים שלהם הוא עדיין מוגבל יחסית בגלל העלות שלהם, השבריריות, והעובדה כי שיטות נוחות כרונית ניסויים חסרים8. ההתקדמות בטכנולוגיית הדפסה תלת-ממד הפכו אפשריות עיצוב מותאם אישית של התקנים כגון מיקרו-כוננים והראש-פלטות כדי לאפשר טיפול קל יותר של האלקטרודות עדין. בשלב הראשון, נתאר כיצד לבנות ולהשתמש סט של כלים אשר פותחו עבור ההשתלה של סיליקון כרונית הגששים14.
אמנם המקום התאים נלמדים בדרך כלל באמצעות בעלי חיים נע בחופשיות םילעופה מבוכים, לאחרונה הם גם נחקרו בסביבות וירטואליות15 , הליכון apparatii9 (איור 1 א'). אלה שיטות נסיוניות מציעים יתרון כי בעלי חיים יכולים הראש-לרסנם, שהופך את השימוש מיקרוסקופים פוטונים 215, תיקון-קלאמפ16ו- optrode9,10,11 טכניקות קל יותר, בנוסף לספק בקרה משופרת על התנהגות בעלי חיים, רמזים סביבתיים12. בשלב השני, נציג את נהלי הדרכה עכברים ורישום פעילות התאים במקום במנגנון הליכון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה קוריאה במכון למדע וטכנולוגיה -
1. הכנת את מיקרו-הכונן ואת אלקטרודה
- להרכבת המיקרו-הכונן.
- להדפיס את החלקים של המיקרו-הכונן (המחוון, גוף ו- shell) 14 משתמשים במדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה. ודא החלקים שיש הפגמים לא.
- לתקן את המחוון לתוך הגוף מיקרו-כונן עם בורג (גודל 000-120 x 1/4).
- הלחמה אגוז (גודל Hex 000-120 000-120/64) אל קצה הבורג.
- לסובב את הבורג כיוון השעון כדי להזיז את המחוון למעלה או נגד כיוון השעון כדי להזיז אותו.
- לתקן את המעטפת לגוף עם בורג (גודל 000-120 x 1/4).
- הרכבה החללית של המיקרו-כונן.
- לתקן המיקרו-הכונן במצב אופקי תחת מיקרוסקופ דו-עינית.
- השתמש קליפ תנין שטוח עם גומי ריפוד כדי לתפוס את הכבל הגמיש של המכשיר סיליקון, תוך ניתוק בקפידה את החללית מהמתחם המשלוח עם מלקחיים. לתקן את הקליפ תנין תחמן.
- באמצעות manipulator, שכב החללית סיליקון על מחוון מיקרו-כונן, במקביל לכיוון התנועה.
- להחיל טיפה של מלט שיניים (טמפרטורת החדר-אשפרה אקריליק שיניים תיקון החומר) כדי לתקן את המקדח כדי במחוון. תקן את מיקום המכשיר אם זה השתנה. דבק לא מומלץ כי זה מרפא מהר מאד והופכת אותו שקשה להתאים מחדש את מיקום האלקטרודות.
- לתקן את המחבר של המכשיר לפני C-מחזיק (מחזיק המחבר) עם מלט שיניים.
- ניקוי ולשים לצבוע על החללית.
מכלול
- תיקון המכשיר/Microdrive על המכשיר לניקוי בדיקה. המכשיר מצויד עם 2 קטנים סיבוב קצף ספוגים (מטליות שאינו סטרילי). התאם את הפער על ידי manipulator.
- להשרות את הספוגים עם חומר ניקוי.
- לאט הניעו את המכשיר למעלה או למטה בין הספוגים, ומאפשר מגע עדין. לפקח על תהליך ניקוי תחת מיקרוסקופ.
- לשטוף את המכשיר עם מים מזוקקים. טובלים את המכשיר אלכוהול עבור עיקור.
- החל דיל (lipophilic הפלורסנט) בגב שאנקס של המכשיר, באמצעות מקלון קצף. זה יאפשר מאוחר יותר את החזיית shank מיקומים במוח.
- בהרכבת הכובע
- להדפיס את החלקים של הכובע (ראש-צלחת, מחזיק המחבר ו cap) 14 משתמשים במדפסת תלת-ממד. 3 החלקים מתחברים כדי ליצור מארז אטום.
- להוסיף אגוזים (גודל M2 ו- 00-90 ב- 90/4) במכונה של הראש-צלחת, תיקון עם דבק ומלט שיניים.
- להוסיף מנקה. בחריץ של המכסה ולתקן עם מלט שיניים.
2. ניתוח קיבוע של הכובע על הגולגולת
כל הכלים המשמשים לניתוח סטריליים מראש על-ידי autoclaving. מכשיר חרוזים חום יבש משמשת לברר לחטא כלים תזדהם צריך לעקר במהלך הניתוח.
- להגדיר את רמת איזופלוריין ל- 4% עבור אתחול של הרדמה. לשים את העכבר בבית הבליעה הרדמה עבור 5 דק
- התקן העכבר מנגנון stereotaxic.
- להפחית את רמת איזופלוריין ל- 1.5-2%. להתאים את רמת במהלך הניתוח על פי מדינה בעלי חיים, קצב נשימה, וכן גוף טמפרטורה 20-
- למרוח משחה עין על העיניים.
- לגלח את הקרקפת ולנקות את הראש של החיה עם חומר חיטוי (iodopovidone). לשמור על תנאים aseptic במהלך כל השלבים של הניתוח.
- הכנס נמשך (1 מ ג/ק ג) תחת הקרקפת. לחתוך ולהסיר חלק העור הקודקוד של הראש העכבר באמצעות מספריים בסדר לחשוף את הגולגולת-הקצוות שלה. השתמש תמיסת מלח וספוג hemostatic כדי לשלוט בדימום במהלך הניתוח ונקי.
- להסיר את קרום העצם בעזרת כלי המגרד.
- למצוא את נקודות ההתייחסות על הגולגולת 21: bregma, למבדה, ניתן לומר, המשונן. התאם את הראש ' s זווית לאורך הציר הסאגיטלי כזה Bregma ואת הנקודות למבדה הם באותו גובה.
- תרגיל שני חורים (~0.5 מ"מ קוטר) בתוך הגולגולת עבור הפניה ואת הקרקע האלקטרודות. החורים צריך להיות כ סימטרית 1 מ"מ ו 1 מ מ לרוחב של למדא-
- להוסיף הקרקע והפניה האלקטרודות (בגודל מיניאטורי 000-120 000-120/16 מפלדת ברגים מצמידים תיל למחברי ה-pin).
- החל אור אולטרה סגול (UV) מליטה דנטין activator על הגולגולת ולאחר מכן להחיל אור UV עבור 45-60 s
- למרוח שכבה של מלט שיניים בקצוות של הגולגולת. למנוע הפצת מלט על העור, השיער של העכברים.
- לתקן את הראש-בלוח תחמן stereotaxic ומקם אותה מעל הגולגולת. לאט לאט להוריד את הראש-הצלחת עד מעט שייגע הגולגולת ולהחיל מלט שיניים בצומת עם הגולגולת. לתת את התרופה מלט שיניים במשך 15 דקות
- להסיר את ההרדמה. מתקן בעל מחבר וכובע הראש-לצלחת. לשים את העכבר בכלוב שלו לאחר מתן זריקה תת עורית של ketaprofen 5 מ"ג/ספקית
- לתת זריקות תת עורית של ketaprofen 5 מ"ג/ק"ג על שני הבא ימים ועל צג בקפידה עבור כל סימן של כאב. עכברים בדרך כלל מתעורר מן ההרדמה בתוך 20-40 דקות. השתל הכובע הוא יחסית קל ( 3.34 ז), כגון עכברים יש צרות להרים את ראשם, לרוץ מבוכים ולטפס על הקצוות של הכלוב שלהם הביתה.
3. אימון התנהגותי
- לאחר 7 ימים תקופת ההחלמה לאחר הניתוח, להתחיל את ההגבלה של מים על 1 מ"ל ליום.
- להפוך את החגורה על ההליכון, לחתוך חתיכה של בד קטיפה (5 ס מ 1-2 מ') ותקן חפצים קטנים באמצעות דבק חם. צרף אובייקטים שביסודה בקצוות של החגורה כדי לא להפריע התנועה של העכבר.
- לתקן את החגורה על הגלגלים של ההליכון על-ידי תפירת ביחד את שני הקצוות.
- להתקין העכבר הראש-קבוע בתוך ההליכון על-ידי הוספת והידוק את שני הברגים של הראש-הצלחת לתוך החריצים של צלחת קיבוע הראש.
- להתחיל לאמן את העכבר כדי להפעיל את הראש-מרוסן על ההליכון בשביל הפרס מים. להעביר את הפרס מים דרך יציאת ליקוק. בתחילה, לשים את העכבר על ההליכון לפרקי זמן של 10 דקות, 3 פעמים ביום.
- בעכבר יתרגל הראש-הקיבעון ומתחיל להזיז את החגורה (בדרך כלל לאחר ~ 3 ימים), להגדיל את האימון משך כדי 30 דקות. לאחר 2-3 שבועות, עכברים לרוץ יותר מ-100 ניסויים 30 דקות (משפט להיות סיבוב מלא של רצועת).
- בחרו העכברים מציג ההופעות ההתנהגות הטובה ביותר עבור הניסויים הקלטה.
4. השרשת לחקור הסיליקון
- לשים את העכבר תחת הרדמה.
- התקן העכבר המנגנון stereotaxic על ידי תיקון שלוחית הראש. לנקות את השטח הגולגולת עם תמיסת מלח.
- למצוא סמנים stereotaxic: bregma, למבדה, ניתן לומר, המשונן. למדוד את המרחק עד לנקודה של ההכנסה ולסמן את זה
- תרגיל העצם בזהירות עד שיהפוך דק ושקוף. להרטיב ולנקות עם תמיסת מלח בזמן קידוח.
- הסר בזהירות את העצם ורקמת והחומר דורא שימוש precision בכוחps. לשמור את פני השטח של המוח רטוב עם תמיסת מלח כל הזמן.
- לתקן את מכלול בדיקה Microdrive/סיליקון כדי תחמן stereotaxic. להביא את המכשיר הסיליקון מעל הניתוח. בורג בעל מחבר סיליקון בדיקה הראש-לצלחת.
- חיבור האלקטרודות מגבר ועיון/הקרקע הקלטה. מגן העכבר עם רדיד אלומיניום כדי להגן מפני רעש אלקטרו-מגנטי. להפעיל את מערכת הקלטה כדי לנטר את הפעילות החשמלית של המוח.
- אט-אט את הגשוש סיליקון למוח באמצעות את micromanipulator. בדוק ללא הרף את האותות החשמליים, המרחק מניפולטור נסע, ושנקס של המכשיר (ודא הם חודרות במוח). פעילות יחידת מוצגת ב קליפת אמנם בחומר הלבן מתחת נאלמים. פעילות יחידת מופיע שוב שאנקס נוגעים השכבה כפירמידה של ההיפוקמפוס. מנקודה זו, תמשוך את מיקרומטר בדיקה 200 סיליקון (השתמש המיקרו-הכונן למחרת כדי להחזיר את הסכין לתוך השכבה כפירמידה).
- לכסות את המשטח של המוח עם תערובת של שעווה לאיטום שמן מינרלי-
- לתקן המיקרו-לכונן הראש-הצלחת באמצעות מלט שיניים. לתת את התרופה מלט שיניים למשך 15 דקות. לנתק את המיקרו-נסיעה stereotaxic manipulator ואז תלבש בחזרה את כובע כובע.
- לשים את העכבר לכלוב ולתת זריקה תת עורית של ketaprofen 5 מ"ג/ק"ג. בדוק אם יש סימן לכאב. ניתוח זה הרבה פחות פולשניים הראשון, עכברים פעילים בדרך כלל בתוך 45 דקות אחרי שהם התעוררות מההרדמה. בכל אופן, תן את העכבר לשחזר יום שלם כמו החללית סיליקון צריך להתייצב במוח.
5. הקלטה
- התקן העכבר הראש-קבוע על ההליכון. להסיר את הכובע הצוואה
- להתחבר המגבר הקלטה, להתחיל את ההקלטה.
- ביום הראשון, השתמש המיקרו-בכונן כדי להזיז את החללית הסיליקון לתוך השכבה כפירמידה של ההיפוקמפוס. כל סיבוב נגד כיוון השעון המברג מעביר את מיקרומטר שאנקס 200 עמוק יותר. להתאים את מיקום shank לאט (~ 20-50 מיקרומטר בכל פעם) עד 13 תנודות גלי ופעילות יחידת יופיעו.
- על הימים הבאים, לכוון את מיקום shank ולחכות ~ 1 h לפני הקלטת הפעילות בהיפוקמפוס בזמן העכבר פועלת על החגורה. כדי לשמור על איכות האות הקלטה טובה במשך מספר ימים, להסיר אובייקטים קשה, נמוך תקרה מהעכבר ' s הכלוב למזער את הסיכוי הכובע מתנגש משטחים קשים.
6. שחזור המכשיר
- לשים את העכבר תחת הרדמה.
- התקן העכבר המנגנון stereotaxic על ידי תיקון שלוחית הראש. להסיר את הכובע הצוואה
- להביא manipulator stereotaxic מעל המיקרו-הכונן. לתקן המיקרו-לכונן manipulator. להתיר בעל מחבר מהצלחת-הראש. הסר את הבורג המחבר את מעטפת הגוף של המיקרו-הכונן.
- תחת מיקרוסקופ דו-עינית פיקוח, אט אט למשוך את מכלול מיקרו-נסיעה/סיליקון בדיקה עם stereotaxic manipulator, משאירים את החלק של מעטפת מאחור.
- לנקות את המכשיר סיליקון עם מכשיר ניקוי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עכבר הוכשר קודם לרוץ על חגורה ארוך שני מטר ללא רמזים (איור 1C). בעקבות ההשתלה אלקטרודה, חגורה חדשה באותו אורך, אבל מציג 3 זוגות רמזים הותקן על ההליכון, על מנת ליצור allocentric ייצוגים מרחביים12,14. אותות פס רחב נרשמו בקצב דגימה של 30,000 Hz, באמצעות מערכת 250-ערוץ ההקלטה (מגבר פנסיון ממשק USB ואוכל בהזמנה אישית ממשק Labview), שני רגשים סיליקון (איור 1A, שאנקס 4, 8 אתרים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקלטה כרונית של פעילות. עצבית הינה קריטית להבנת תהליכים עצביים כגון שדות המקום בהיפוקמפוס. הגישה שלנו לבצע סיליקון כרונית בדיקה implantantation מבדיל עצמו אחרים שיטות7,18,19,20 על ידי העובדה כי זה פשוט יחסית לשחזר את החבילה אלקטרודה בסוף הניסוי. אמנם המקום התאים נלמדים בדרך כלל ב נע בחופשיות תנאים, המנגנון הליכון מפשט לא רק באופן משמעותי את תכנון ניסויים וניתוח נתונים, הוא גם מאפשר לחוקרים לבחו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון קוריאה למדע טכנולוגיה תוכנית מוסדיים (מספר פרויקטים 2E26190 ו- 2E26170) ואת התוכנית המדע הגבול האנושי (RGY0089 2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סיליקון Probe | Neuronexus | Buzsabi32 | מערכת הקלטה אלקטרודה |
| Intantech | RHD2132/RHD2000 | ||
| מדפסת תלת מימד | Asiga | Pico Plus 27 | מדפסת ברזולוציה גבוהה למדפסת תלת מימד מיקרו-כונן |
| Stratasys | Mojo | מדפסת ברזולוציה נמוכה יותר לרכיבי כובע | |
| מכשיר סטריאוטקסי | Kopf | דגם 963 | |
| מיקרוסקופ משקפת | Leica | M60 | |
| הליכון | אנו בונים אותם |
מקורות
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
- Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
- Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
- Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180(2016).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568(2012).
- Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531(2017).
- Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
- Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
- Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
- Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
- Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
- Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
- Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012(2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
