הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

17.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56441

⸱

12 באפריל 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

במאמר זה

סיכום

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

תקציר

בשל כלי אימתני שלו ללימודי הגנטי המולקולרי, תודרנית לבנה הוא אחד המינים דגם הבולטים ביותר בביולוגיה צמח, במיוחד, צמח הרבייה הביולוגית. עם זאת, צמח מורפולוגי, אנטומי, וניתוחים ultrastructural באופן מסורתי כוללים גוזלת זמן הטמעה חלוקתה הליכים שדה בהיר, סריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, המדינה-of-the-art תלת-ממדי בעזרת מחשב מיקרוסקופיים ניתוחים ו עידון רציפה של טכניקות מולקולריות כדי לשמש על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל לביקוש מוגבר פיתוח טכניקות עיבוד מדגם מינימלי ויעילה. פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ניקוד כראוי תודרנית ופרחים, בסיסי ניקוי טכניקות, siliques, כמה הליכים מכתימים עבור כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

מבוא

פרחים בין החשובים ביותר מגדיר את האיברים של angiosperms. צמחים פורחים הופיע לפני כמה שנים 90-130 מיליון1, ואת המגוון כל כך מהר כי הופעתם מהירה תוארה "תעלומה הזוועה" מאת צ'רלס דרווין2. האינטרסים של חוקרי הצמחים בהתפתחות פרחים מגוונים. מחקר התמקדה הבנת המקור האבולוציוני של הפרח כולו, או את האבולוציה של תכונות אנטומיות מבניות, פונקציונלי ספציפי של פרחים3,4,5,6 . וריאציית גבוהה ב טופס פרחוני, מבנה, כמו גם את דרכי רבייה אל-זוויגית ופוגע להסתמך עליהם, להפוך הפרח מבנה מורכב מאוד. זה הוביל במאמצים מגוונים לאפיון התכונות אנטומיה מבניים איברים פרחוני, תוך שימוש בטכניקות microscopical אלקטרון ואור זה יכול להיות משולב עם חקירות גנטית ומולקולרית7. יתרה מזאת, כמקור של פירות וזרעים, פרחים הם בחשיבות עליונה על תזונת האדם ושל בעלי החיים. לכן, אפיון ופיתוח פרחים ופירות יש השלכות רבות על מחקר יישומי, כולל מזון אבטחה עבור אוכלוסיה אנושית וגובר ואסטרטגיות שימור אקולוגי תחת סביבה משתנה8 , 9 , 10.

פיתוח פרח תודרנית מתחיל עם פרח אינדוקציה, הטרנספורמציה של meristem וגטטיבי כדי meristem תפרחת (קבוצה של פרחים). פרח primordia מבוצעים רוחבית לאגף מ meristem תפרחת11. Primordia איברים פרחוני בהדרגה בצורה המעגלים הקונצנטריים מבחוץ אל מרכז הפרח, ובסופו של דבר לפתח לתוך עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels7. אלו איברים פרחוני להגשים הגנתי התזונתי, ברורים, ואת פונקציונלי (למשל, המשיכה המאביק) תפקידי מיני צמחים שונים, עם איברי המין סופגת את התפתחות gametophytes זכר ונקבה, בהתאמה12 , 13. gametophytes, בתורו, להבדיל כל זוג של זכר (זרע) ולהכפיל גמטות הנשי (ביצה, תא מרכזי), אשר התאחדו על הפריה כדי ליצור את הדור הבא של הזיגוטה, את האנדוספרם העיקרי, רקמות מסוף המשנה התפתחות העובר ה-14,15. פיתוח זרעים ופירות תומכת צמיחה, התבגרות, שימור העובר ופיזור, בסופו של דבר, שלה. מחקר מקיף בוצעה כדי לאפיין את הפרחים והתפתחות העובר במיני צמחים שונים, במיוחד במינים דגם תודרנית7,16,17.

ניתוחים מיקרוסקופיים מוקדם של התפתחות פרחים היו מבוססים על מדגם גוזלת זמן עיבוד והתבוננות טכניקות, כמו פרפין או שרף הטבעה ו חלוקתה, בשילוב עם אור או מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקות אלה מיקרוסקופיים מסורתי שימשו לעיתים קרובות בשילוב עם חקירות הגנטי המולקולרי, כגון ניתוחים microscopical של מוטציות, הלוקליזציה של RNA על ידי הכלאה בחיי עיר או חיסונית-זיהוי חלבונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ שדה רחב וקונפוקלי פלורסצנטיות, התמונה בעזרת מחשב תלת-ממדי המדינה-of-the-art ניתוחים, עידון רציפה של שיטות מולקולריות שניתן להשתמש בהם על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל צורך טכניקות עיבוד מינימלי ויעילה מדגם נתונות מעדיפים כמותני. בשנים האחרונות הפך התקדמות משמעותית בפיתוח טכניקות ניקוי על הדגימה בעלי חיים שלמים-הר. הם לעיבוד המדגם שקוף באמצעות מימית אוריאה - או סוכר מבוססי ריאגנטים (למשל, קנה מידה, SeeDB, מעוקב)18,19,20, או על ידי באופן סלקטיבי הסרת שומנים (באמצעות הנוזל מרחביות) לאחר הטבעה דגימות ב hydrogels יציב; הסרת שומנים יכולה להיות מושגת באמצעות דיפוזיה פסיבית (שונה,למשלפרוטוקול בהירות21, ברית-PARS-חישוקים22) או באופן פעיל על-ידי אלקטרופורזה (בהירות המקורי פרוטוקול23 ו מעשה-פרסטו24). בעידודה של התקדמות מהירה זו, כמה טכניקות נגזר גם מתגלים לשימוש בצמחים.

בנייר זה שיטות התמקדו המודל תודרנית, נתאר ההליך את הקרע הנכון של ניצני פרחים, פרחים, siliques צעיר, קרחת היער של דגימות כולה-הר עבור צביעת מגוונות ונהלים התבוננות באמצעות קלאסית או שיטה סליקה מבוססי מרחביות האחרונות. דוגמאות עמילן, callose של כרומטין מכתים ניתנת. אף על פי נהלים אלה עליך בהמשך שיפורים והתאמות בעת שימוש עם מינים אחרים, אנו מקווים שהם יהיה להגדיר את הבמה עבור מחקר נוסף על שיטות אלה פשוט אבל קריטיים המהווים נקודת ההתחלה של פרויקטי מחקר רבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פרח, קיבוע Silique

  1. Siliques מצמחים ופרחים הקציר מסונכרנים בטקס הפתיחה של הפרח הראשון.
    הערה: בתנאים ניסיוני המשמש כאן, להתחיל צמחים פורחים כ 21 ימים לאחר ההשתלה של צלחות Murashige ו- Skoog (MS) אל הקרקע. זרעים מרובדת במשך 3-4 ימים ב 4 ° C, מונבטים/גדל על צלחות MS-22 ° C/16 שעות אור ו- 18 ° C/8 h כהה במשך 8-10 ימים, לפני משתילים את השתילים באדמת עשירות בעציצים תחת באותם התנאים (איור 1). המספר של משכפל תלוי המטרה מחקר ספציפי, אך מומלץ מינימום של התפרחות 5 (מ 5 צמחים בודדים) עבור כל טיפול. אם הפרחים יחידת ניסויי, מומלץ מינימום של 10 פרחים לכל שכפול.
  2. התפרחות או פרחים (איור 1E-H) באמצעות מספריים קטנות (למשל, מספריים לציפורניים) ולמקם אותם מיד צינור microcentrifuge (עבור קיבוע תפרחת/פרח יחיד) או צינור חרוטי (עבור הקיבועים קולקטיבית) המכיל טרי גרם של Carnoy, חומצה אצטית/מתנול או כתות ומייצבים FPA50 (בהתאם ליישום, ראה להלן) על קרח.
    הערה: דוגמאות צריך להיות לגמרי שקועים מקבע.
  3. להשאיר הריקמה שבתוך מקבע במשך 4 שעות ללון ב 4 º C.
    הערה: חדירת אבק יכול לשמש לצורך זירוז חדירת מקבע לתוך הרקמה, אך ייתכן שהדבר מזיק שמירה על המבנה של הרקמה. המחברים לא מיישמת הסתננות ואקום.
  4. הסר את מקבע, הוספת אתנול 70% מספיק כדי לכסות את הדגימות, ולהחזיר אותם עד 4 ° C לפחות 24 שעות; דוגמאות יכול להישאר ללא הגבלת זמן בפתרון זה. לאחר הסרת אתנול, פנה מיד אל השלב הבא; ניתוח או ניקוי מרחביות.

2. ניתוח תחת Stereomicroscope

  1. לשים ומדברי 70% אתנול בכוס של יוצר השעון מניחים על צלחת פטרי קטנים לקבלת תמיכה.
  2. המקום תפרחת/הפרח/silique על זה טרי עשה מקבע ומנתחים תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים מזרק עם מחט.
    1. שימוש של יצרנית שעון זכוכית או התקן דומה המאפשר את הדוגמאות כדי להיות מכוסה לגמרי עם אתנול (מומלץ) עבור ניתוח התפרחות, ועבור קורע איברים פרחוני של פרחים בוגרת (עלי גביע, עלי כותרת, אבקן יכול להיות גזור בשלב זה ) כדי למנוע את הסיכון של דגימות מתייבשת.
  3. לנתח siliques, ניצני פרחים קטנים בשקופית כמתואר להלן.
    1. לשים בצד של היוצר שעון הזכוכית עם דגימות מעובד מראש ולהשתמש שקופית רגילה של החתך האחרון.
    2. להעביר את הדגימה עניין לשקופית ולהוסיף 10 µL של אתנול 70% טרי. לעבוד במהירות על החתך האחרון ולהוסיף 10 µL של אתנול, במידת הצורך, כדי לשמור את הדגימה לחות ללא נוזל מוגזמת.
    3. ולשחרור גרגרי אבקה מן האבקנים, ראה שלב 5.1. ניקוד carpels ו- ovules, בצע את ההליך המתואר באיור2. הליך זה חל על כל שלבי התפתחות שחלה, כולל בשלב ההתפתחות של siliques ירוק.
      הערה: לא להוסיף אתנול אם יש מספיק carry-over אתנול מלעבור את הדגימות; לנתח דגימות קטן מאוד קל בהרבה בכמות מינימלית של נוזל. תמיד לשמור רק את האיברים של עניין (עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels, ovules, זרעים או גרגרי אבקה) בשקופית. הליך זה יבטיח עובי אחיד בין שקופיות coverslip, התואם העובי של האיבר תחת בדיקה, וכתוצאה מכך הומוגניות גבוה יותר, ולכן יעילות עבור בדיקות מיקרוסקופיות (מספר גבוה יותר של דגימות היעד באותו מוקד מישור).
  4. השתמש חתיכה קטנה של נייר סופג כדי לספוג ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. במהירות להמשיך לשלב הבא (סעיף 3, 4 או 6) לפני מדגם מתייבש החוצה.

3. קלוראל-הידרייט המבוסס על חישוף, מכתים סליקה משולב

הערה: התוצאות הטובות ביותר עבור סליקה מבוססי קלוראל-הידרייט מתקבלים עם FPA50 קבוע חומר.

  1. מקום 20 µL ניקוי פתרון (קלוראל-הידרייט/גליצרול, שונה בינוני של שותפה עסקית, 4½ של אדון או איקי-4½ פתרונות של אדון) בשקופית מניבי הדגימה. באמצעות זוג מזרקים עם מחטים hypodermal, מקם את דגימות כנדרש על ידי הפחתת שביניהם, סובבי אותם איפה האיבר עניין פונה כלפי מטה. הסר את כל בועות האוויר הנותרים בעזרת המחט.
  2. הנמך את coverslip על הצד בעדינות למקם אותו, לחיצה בעדינות ו לחכות עד הפתרון סליקה ממלאת את הרווח בין. להוסיף פתרון סליקה מינימלית, במקרה הצורך, כדי למלא את החלל כולו תחת coverslip.
  3. מניחים את השקופית על בעל שקופית ולהשאיר את זה מתחת למכסה המנוע fume. המשך תצפיות מיקרוסקופיות לאחר לפחות 4 שעות, במהלך הימים הבאים 4 – 5.

4. בשילוב אלכסנדר מכתים, ניקוי 4½ של הר של פורים

הערה: פרוטוקול אלכסנדר המקורי מבוסס על שחרור גרגרי אבקה על השקופית לפני צביעת. יעיל ואינפורמטיבי יותר, שונה אלכסנדר מכתים ולניקוי הליך זה ההכתמה של בוגר גרגירי אבקה בתוך פורים בוגרת אבל ללא dehiscent.

  1. לבחור ניצני פרחים שנקטפו זה עתה על מנת לפתוח עם פורים dehiscent.
    הערה: לא לקחת ניצני פרחים הצעיר כי אלכסנדר מכתים מיועד בוגרת גרגירי אבקה, אינו מכתים ביעילות גרגרי אבקה לא בוגר. מומלץ מינימום של 5 פרחים לכל טיפול שנקטפו התפרחות וצמחים שונים.
  2. להכין צלחת 96-ובכן פתרון של אלכסנדר מספיק. להציף ניצן של פרח. לחשוף את פורים על-ידי הסרת את עלי גביע, עלי כותרת, לטבול אותם בפתרון של אלכסנדר. שומרים את הדגימות מתחת למכסה המנוע fume עבור h 1 – 3.
  3. להחליף את הפתרון של אלכסנדר עם פתרון 4½ של אדון ולמקם את הצלחת רב טוב בחזרה מתחת למכסה המנוע fume עבור דגירה לילה.
  4. באמצעות מלקחיים, להניע בעדינות את ניצני פרחים שנוקה על שקופית חדשה. מאז כמה carry-over של הפתרון של אלכסנדר עלולה להתרחש, להשתמש בנייר סופג כדי להסיר כמה שיותר פתרון סליקה ככל האפשר.
  5. האבקנים לנתח ולהסיר כל רקמות אחרות. בצע את השלבים בסעיף 3 באמצעות פתרון 4½ של הר.

5. הסרת Exine את גרגרי אבקה

הערה: מומלץ להשתמש לשבועיים של Carnoy עבור צביעת דאפי.

  1. בצע את ההליכים קיבעון, דיסקציה שמתואר בסעיפים 1 ו- 2. עד עכשיו, אחד צריך אחד כדי האבקנים רבים בשקופית בתוך סכום מינימלי של 70% אתנול.
  2. להשתמש בנייר סופג כדי להסיר עודפי אתנול, ולהוסיף 5 – 10 µL של דאפי פתרון. באמצעות כמה מזרקים עם מחטים, שחרר את גרגרי אבקה בתוך זה כמות קטנה של פתרון (למשל, שימוש במזרק אחד על מנת לשתק את האבקן והשני כדי לשחרר את גרגרי אבקה). להוסיף עוד 5 µL של דאפי אם הפתרון מתייבש.
  3. הסרת כל פסולת של האבקן הוא שלב קריטי, כזה רק גרגרי אבקה נותרו בין השקופית את coverslip.
  4. במקום coverslip בשקופית מניבי הדגימה על ידי הורדתו לצדדים ולהוסיף את כמות מינימלית של דאפי הפתרון הנדרש כדי למלא את החלל. במקום של האצבע המורה על coverslip, בלי מועך גם הרבה תפני מהר, המשרד, וקצר התנועה החלקה.
    הערה: כדי לאמוד את הכוח הדרוש ואת משרעת של התנועה הזזה, שלב זה צריך להיות מתורגל מספר פעמים, בדיקת התוצאות בכל פעם תחת המיקרוסקופ.
  5. הוספת פתרון דאפי במידת הצורך ולשפר את המקום שהשקופית בקופסה לח בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות 1 ח' להמשיך להתבונן דגימות תחת שדה רחב זריחה או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך ה 24 מנסים לשלב הליך זה עם מרחביות ניקוי כדי לבדוק אם נוספת ניתן להשיג את הקצאות.

6. נתרן גופרתי Dodecyl (מרחביות) ניקוי

הערה: בהתאם האיבר פרחוני כדי להיות מנותח, על המיומנויות של החוקר לנתח דגימות מאוד רך וקטן, הטיפול מרחביות יכול להתבצע גם בעבר (עבור חוקרים מנוסים) או לאחר הקרע צעד (עבור פחות מנוסים חוקרים) על חומצה אצטית-מתנול קבוע חומר.

  1. השתמש הזכוכית של מכונת watch, שקופית קעורה או צינור microcentrifuge כדי דגירה דגימות ביתור או שאינם גזור ב 1% מרחביות והפתרון 0.2 N NaOH ללילה בטמפרטורת החדר.
  2. לטפל כי המדגם הוא רך מאוד ובעל מראה שקוף. לשטוף מספר פעמים עם מים.
    הערה: שרידי הפתרון מרחביות עלול להוביל משקעים בעת הוספת מכתימים הפתרון, למשל, אנילין כחול.
  3. לקבלת דוגמאות ללא-גזור, בצע את ההליך לנתיחה המתוארות בסעיף 2, באמצעות מים במקום 70% אתנול. לאחר לנתח את הרקמה הרצויה, להסיר את כל שאריות פסולת ואת כל המים העודפים עם נייר סופג, ולאחר מכן להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים, להמשיך עם שלב 6.5.
  4. לקבלת דוגמאות גזור, בזהירות להעביר את הדגימה הפתרון כביסה למקם אותו לשקופית נקי ו להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים.
  5. הנח בעדינות coverslip בשקופית על-ידי הורדת אותו לצדדים. הקפידו לא למעוך את ההכנה. אם הרקמה רכה מדי, במקום כל דק המפריד בין השקופית את coverslip בפינות שלו (למשל, קלטת או של coverslip שבורים), משאיר רווח קאמרית כמו בין שקופיות coverslip, כך coverslip לא לרסק את הדגימה.
  6. מקם כל השקופיות בתוך קופסה לח, לכסות אותו ברדיד אלומיניום, ומקם אותו ב 4 ° C לפחות 1 ח' להמשיך להתבונן הדגימה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך 24 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תודרנית שייך למשפחת Brassicacea, הנושאת את התפרחות עם פרחים דו מיניים מסודרים בתפרחת (איור 1). כל פרח יש ארבעה עלי גביע, 4 עלי כותרת, 6 אבקנים (ארבעה ארוך וקצר שני), שחלה syncarpous המורכבת carpels שני מלידה מאוחה (איור 1F-H) מסודרים ארבעת המעגלים הקונצנטריים25,26. תודרנית יש tenuinucellate, ovules anatropous מסודרים הקודקודית placentati...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קיומו של ניצני פרחים רבים בתוך תפרחת בודדת של תודרנית, המתפרסות על-פני כל שלבים התפתחותיים של פרח, מציע הזדמנות ייחודית ללימודי מכוון אפיון אפקט של טיפול או תכונה התפתחותית בו זמנית על פני בשלבים שונים של פיתוח פרח. נקודת התייחסות טובה בין מיני צמחים בודדים הוא פתיחת הפרח הראשון של התפרחת הראשי. צמחים מטופלים בצורה כזאת, כי הפריחה מסונכרנים ככל האפשר (למשל, 3 – 4 ימים ריבוד ב 4 ° C הגדלת נביטת הזרעים סינכרונית, ולכן אפילו יותר פריחה), וצמחים רק לפתוח את הפרח הראשון שלהם באותו יום הם נלקח כאצווה להפיץ בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ציריך, הפורום הישראלי לאנרגיה מארי קירי גרנט (מענק. לא. TransEpigen-254797 אל A.H.), גרנט מתקדם של המועצה האירופית למחקר (מענק. לא. MEDEA-250358 אל U.G.), ומחקר ופיתוח טכנולוגיה פרוייקט (גרנט MecanX כדי U.G.) מ- SystemsX.ch, היוזמה שוויצרי במערכות ביולוגיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים וחומרים
אתנולשרלאוET00102500
חומצה אצטיתApplichemA3686,2500100% ביולוגיה מולקולרית כיתה
חומצה אצטית קרחוניתסיגמא-אולדריץ'320099ביולוגיה מולקולרית כיתה
מתנולשרלאוME03062500
תמיסת פורמלדהידסיגמא-אולדריץF1635
חומצה פרופיוניתסיגמא-אולדריץ81910-250 מ"ל
כלורל הידרטסיגמא-אולדריץ'15307
גליצרולרוט3783.1
גומי ערביפלוקה51198
חומצה לקטיתפלוקה69773
פנולסיגמא-אולדריץ'77607-250 מ"להשתמשנו בפנול נוזלי (השתמש בצפיפות כדי למצוא את הנפח הנדרש לתמיסה שלך)
שמן ציפורןסיגמא-אולדריץ'C8392-100 מ"ל
קסילןרוט4436.1
יודפלוקה57665
אשלגן יודידMerck5043
מלכיט ירוקפלוקה63160
חומצת פוקסיןFluka84600
תפוז GSigma7252
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'L3771ביולוגיה מולקולרית כיתה
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'71690
נתרן די-מימן פוספטApplichemA1047,1000
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'S9763-1KG
אשלגן פוספטסיגמא-אולדריץ'04347
EDTAApplichemA2937,1000
CalcofluorSigmaF6259מבהיר פלורסנט 28
AuramineChroma10120
DAPISigmaD9542רעיל
Triton-X-100SigmaT8787
כחול אניליןMerck1275
MS בינוניקרולינה19-57030
מצע עשיר בחומרים מזיניםEinheitserdeED73
זכוכיתאין מותג ספציפי
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה בזVWR62406-200
מלקחיים של דומונדActimed0208-5SPSF-PS
מלקחייםDUMONT BIOLOGY0108-5
מזרקBDBD Plastipak 3000131 מ"ל
מחט הכנהBDBD Microlance 304000
שקופיות מיקרוסקופThermo Scientific10143562CEקצוות חתוכים
CoverslipsThermo ScientificDV40008
קופסתקופסת פלסטיק עם מגבת נייר לחה ותומכי שקופיות בפנים
שםחברהCatalogComments
>Solutions>
Fixatives
של Carnoy (Farmer's):חומצה אצטית קרחונית 3:1 (מ"ל:מ"ל)
מתנול/חומצה אצטיתמקבע 50% (v/v) מתנול, 10% (v/v) חומצה אצטית קרחונית במים נטולי יונים
FPA50 פורמליןחומצה פרופיונית, 50% אתנול; 5:5:90 (מ"ל:מ"ל:מ"ל)
<תמיסות ניקוי>חזקות
כלורל הידרט/גליצרולכלורל הידרט: גליצרול: מים, 8:1:2 (גרם:מ"ל:מ"ל). יכול לשמש לכל שלבי התפתחות הפרחים ולהתפתחות סיליק במיקרוסקופ DIC. הקיבוע הטוב ביותר הוא FPA50
Modified HoyerGum ערבי מבוסס פורמלין 7.5 גרם, כלורל הידרט 100 גרם, גליצרול 5 מ"ל , מים 30 מ"ל. יכול לשמש לכל שלבי התפתחות הפרחים ולהתפתחות סיליק במיקרוסקופ DIC. הקיבוע הטוב ביותר הוא FPA50
Herr's 4½ המבוסס על פורמלין; נוזלחומצה לקטית, כלורל הידרט, גבישי פנול, שמן ציפורן, קסילן; 2:2:2:2:1, לפי משקל. יכול לשמש לכל שלבי התפתחות הפרחים (במיוחד להתפתחות אבקנים) ולהתפתחות סיליק במיקרוסקופ DIC. הקיבוע הטוב ביותר הוא
SDS/NaOHלדלל את ה-SDS ואת תמיסת ה-NaOH ל-1% SDS / 0.2 N NaOH (דילול פי 10). לכל שלבי התפתחות הפרחים והסיליק. הקיבוע הטוב ביותר הוא מקבע מתאנו/חומצה אצטית; ניתן להשתמש גם בשני המקבעים האחרים. ניתן לשלב עם תמיסת צביעה קלקופלואור, אורמין, DAPI וכחול אנילין.
תמיסת10% (w/v) נתרן דודציל סולפט. ממיסים 10 גרם נתרן דודציל סולפט ב-80 מ"ל מים נטולי יונים ויוצרים עד 100 מ"ל עם מים נטולי יונים.
תמיסת2 N תמיסת NaOH: ממיסים 4 גרם NaOH ב-40 מ"ל מים נטולי יונים ויוצרים עד 100 מ"ל עם מים נטולי יונים
<חזקים >תמיסות ניקוי וצביעה משולבות
Herr's IKI-4½ל-4½ סטנדרטי; (סה"כ 9 גרם) להוסיף: 100 מ"ג יוד, 500 מ"ג אשלגן יודי. פתרון פינוי זה יכול לשמש לכל שלבי התפתחות הפרחים ולהתפתחות סיליק, בין אם להגברת הניגודיות או לאפיון דינמיקת העמילן. השתמש ב-FPA50 לניתוח מבני ובקיבוע של קרנוי לניתוח עמילן כמותי.
אלכסנדר מכתיםאתנול 95% 10 מ"ל, מלכיט ירוק (1% ב-95% EtOH) 1 מ"ל, חומצת פוקסין (1% ב-ddH2O) 5 מ"ל, תפוז G (1% ב-ddH2O) 0.5 מ"ל, פנול 5 גרם, כלורל הידרט 5 גרם, חומצה אצטית קרחונית 2 מ"ל, גליצרול 25 מ"ל. ניקוי / צביעה זו לבד או בשילוב עם 4½ של הר; ניתן להשתמש בתמיסה כדי להעריך הפלת אבקה בפרחים עם גרגרי אבקה בוגרים ותלת-תאיים. הוא משמש על חומר לא קבוע טרי.
<תמיסות צביעה חזקות>
תמיסתCalcofluor Calcofluor 0.007% במים (גרם:מ"ל). שימש במקור כמבהיר אופטי. יכול לשמש לצביעה של תאית, פוליסכרידים קרבוקסיליים וקלוז בדפנות התאים. משמש לעתים קרובות להכתמת גרגר האבקה. ניתן להשתמש בכל שלושת המקבעים עם פתרון זה.
תמיסתAuramine 0.01% במים (g:ml). צבע פלואורסנטי ליפופילי זה יכול לשמש בין היתר לצביעה של ציפורניים, קוטין ואקסין. ניתן להשתמש בכל שלושת המקבעים עם תמיסה זו
Calcofluor-Auramineתמיסת Auramine: תמיסת Calcofluor, 3: 1. יכול לשמש לצביעה משולבת על ידי שני הפתרונות. ניתן לאמוד פרופורציות אחרות תוך שמירה על שיעור קטן יותר של קלקופלואור ביחס לאורמין.
תמיסתDAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M מאגר נתרן פוספט (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. ניתן להשתמש בתמיסה זו לצביעה של התפשטות כרומוזומים במהלך מיוזה זכרית ונשית, וגרעיני תאים של כל רקמה. משמש לעתים קרובות לחקר התפתחות גרגירי אבקה. קרנוי ומתנול / חומצה אצטית הם הקיבוע הטוב ביותר לתמיסה זו. מקבעים מבוססי פורמלדהיד כגון FPA50 עלולים להפריע לצביעה. עירור ב-UV ופליטה מקסימלית בסביבות 461 ננומטר.
מאגר נתרן פוספט (0.1 M)קולטן פרוטון: 0.2 M Na2HPO4, תורם פרוטון: 0.2 M NaH2PO4, יחס תורם פרוטון / קולטן פרוטון: 1.364 (עבור pH 7)
תמיסה0.1% (w/v) כחול אנילין, 108 מ"מ K3PO4 (pH 11), 2% גליצרול. ניתן להשתמש בתמיסה זו לצביעה של קלוז ותאית בשלבי התפתחות רבים (למשל שקיעת קלוז בטרדות זכר ונקבה, פקקי קלוז בצינורות אבקה). עירור ב-UV ופליטה מקסימלית בסביבות 455. ניתן גם לרגש אותו ב-514 ננומטר עם פליטה באדום להכתמת תכולת התאים.
' ' של יצרנית שעונים לחות אתנול אבסולוטי מקבע מקבע, ניקוי תמיסת FPA50 מבוססת פורמלין מלאי SDS מלאי NaOH אורמין תערובת DAPI כחולה אנילין

מקורות

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127(2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075(2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631(2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129(2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ArabidopsisHerrSDSDAPI
כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.