מאמר שיטה

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

DOI:

10.3791/56446

⸱

12 באוקטובר 2017

 ,  ,  , 
1Cell, Developmental, and Regenerative Biology Department, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Microscopy Core, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש של טכניקות הדמיה-להתקדם תרמה באופן כללי להבנת התפתחות מוגברת. התפתחות טרום השרשה המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות שני תחומי מחקר זה לי כמיותרים במידה רבה ההתפתחויות הללו, בשל האיכות הגבוהה של נתונים שניתן להשיג ישירות מהדמיה טרום השרשה עוברי או ex-vivo האיברים organogenesis. בעוד טרום השרשה עוברי הניבו נתונים עם רזולוציה מרחבית גבוהה במיוחד, בשלבים מאוחרים יותר היו פחות נוטה שחזור תלת מימדי. קבלת נתונים תלת-ממד או נפחי איכותיים למבני עובריים מוכר בשילוב עם גורל מיפוי או מעקב אחר שושלת היוחסין הגנטי יאפשר ניתוח מקיף יותר של morphogenetic ההתרחשויות במהלך מופרה.

פרוטוקול זה מתאר גישה כולה-הר immunofluorescence המאפשר תיוג, ויזואליזציה של כימות של קדמון אוכלוסיות תאים בתוך הלב הסהר המתפתח, מבנה מפתח יצרו במהלך התפתחות הלב. הגישה מיועד כזה דרך שני תאים, רקמות-מידע ברמת שניתן להשיג. מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות עיבוד תמונה, פרוטוקול זה מאפשר שחזור מרחבי תלת מימדי של הסהר הלב, ובכך מספק את היכולת לנתח את לוקליזציה וארגון של אוכלוסיות ספציפיות קדמון במהלך שלב קריטי זה של התפתחות הלב. חשוב, השימוש של נוגדנים ההפניה מאפשרת מיסוך רצופים של הסהר הלב ו מדידות כמותיים הבאים של אזורים בתוך הסהר. פרוטוקול זה בלבד לא תאפשר בדיקה מקיפה של התפתחות הלב מוקדמת, אך עם עיבודים צריך להיות רלוונטי ברוב מערכות איברים ב- gastrula כדי מוקדם somite הבמה העכבר העובר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של organogenesis יש זמן הסתמך על התצפית של אירועים morphogenetic העובר המתפתח. מחקרים אלה לעתים קרובות לסמוך על השימוש של צבעי פלורסנט או שושלת היוחסין כתבים עקיבה בשילוב עם תיוג של אוכלוסיות הפניה מוגדרים. 1 על ידי השוואת היחסיים של תוויות אלה, מידע שאפשר לקרוא את המקור, תנועה או תרומתו האולטימטיבית של אוכלוסיה של עניין. השתלת וניסויים מיפוי גורל להשתמש ציוני מורפולוגיים או הזרקה של חומרי צבע לתוך שושלות שאינם תאי כדי להגדיר את נקודת ההתחלה של תאים מעניינים, אשר לאחר מכן נבדק על תרומה העובר מפותחות. 2 , 3 , 4 , 5 ניסויים גנטיים שושלת היוחסין-עקיבה משתמשים במושג זהה עם אללים כתב מוגדרים היטב המשמשים תווית אוכלוסיות תאים ללא מניפולציה ניסויית. מפתח גישות אלה הוא היכולת לקבוע, עם רזולוציה מרחבית גבוהה, את מיקומם של ניסיוני והתוויות הפניה. גישות אלה הניבו התקדמות בטיפול בהתפתחות טרום השרשה, explant organogenesis מחקרים. 6 , 7 , 8 , 9

האירועים התפתחותית העומדים מורפוגנזה הלב כבר מתואר יותר ויותר בשנים האחרונות. 10 אחת התגליות הגדולות באזור זה של המחקר הוא התיאור של מספר אוכלוסיות קדמון ניתן להבחין על ידי ביטוי של סמנים ייחודיים. 11 אוכלוסיות אלה כוללים את הראשון ואת שדות הלב השני (FHF ו- SHF), אשר נמצאים בתוך הסהר לב לצד הקדמי של העובר ביום עובריים (E) 8.25 ההתפתחות העכבר. 12 אוכלוסיות אלה נבדקים לעתים קרובות באמצעות שילוב של wide-מיקרוסקופיית שדה, אשר מספק מידע ברמת הרקמות ולאחר חלוקתה סדרתי עם מבחני immunofluorescence, אשר מציע ברזולוציה הסלולר גבוהה אבל רק מימדי מידע מרחבי. 13 כך, בעוד מחקרים אלה קידמו מאוד את ההבנה שלנו של התפתחות הלב, השיטות הזמינות מוגבלת עומק ניתוח כמותי של מורפוגנזה בשלבים אלה, יוצרים את הצורך גישות לבחון ארגון של אוכלוסיות אלה ברמה כל-אורגניזם.

האחרונים מאפשרים ההתקדמות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של תפוקה גבוהה אלגוריתמית שחזורים של תאים ומבנים בחיי עיר בקלות יחסית, ובכך לסלול את הדרך ללימודי מפורט של המתחם מבנים הסלולר. 14 עם העלייה של כוח חישובית ופיתוח אלגוריתמים ניהול נתונים גדול, שני הצורך להתמודד עם הגידול המעריכי של הגודל של הדמיה ערכות נתונים, ניתוח יכול עכשיו להיות אוטומטי לחלוטין. 15 ניתוח אוטומטי של ערכות נתונים הדמיה יש את היתרון של להיות לא משוחד, אבל זה רק אמינים ככל שאיכות ערכת הנתונים קלט; זה הכרחי, אז כי מומלצות משמשים במהלך רכישת ועיבוד תמונה מראש כדי להבטיח את האיכות הגבוהה ביותר, ניתוח לא משוחדת. 16 פרוטוקולים יכול להיות אוטומטי לחלוטין, משותפת עבור הפארמצבטית, האלגוריתמים בשימוש תוכנה קניינית הם בקלות זמין דרך ספריות כדי לשמש על ידי מדענים שיש להם היכרות עם קניינית מודרני או פתוח כלי פיתוח. 17

הפרוטוקול הבא מסביר את הצעדים הדרושים לביצוע ניתוח כזה על מודל אחד מוגדרת היטב של organogenesis, היווצרות של הסהר לב במהלך הפיתוח הלב. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) הקציר, לנתח בשלב חרמש לב עוברי, (2) לבצע את כל הר immunofluorescence לעיון (Nkx2-5) ו ניסיוני סמנים (18,Foxa2Cre:YFP19), (3) הכנה של תמונה העוברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ולבסוף (4) לנתח ולכמת את התמונות המתקבלות באמצעות גישות תלת-ממדי מתקדם. בעוד הסהר הלב משמש דוגמה כאן, עם השינוי המתאים, פרוטוקול זה עשוי לשמש לניתוח של שושלות מרובים ב- gastrula כדי עוברים שלב somite בשלב מוקדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני.

1-קציר, עיבוד עוברי הבמה הסהר לב

  1. חבר עכבר נקבה פורייה עם גבר חטוב פורייה.
    2. הכנס
  2. בדיקת נוכחות של הזדווגות הנרתיק באמצעות בדיקה בוטה או מלקחיים. בצהרי היום של זיהוי הכנס נחשב מתחלקים היום (ה) 0.5 (ראה איור 1A עבור ציר הזמן מלאה).
    הערה: תקעים צריך להיבדק על בבוקר, כאשר הם הולכים לאיבוד לאורך כל היום.
  3. בבוקר של היום ה 8 (E8.25), להקריב את הסכר בהריון על ידי שאיפת 2 CO, או לפי תקנות מקומיות ומוסדיים.
    הערה: תזמון מדויק יכול להיות תלויות מתח, צריך להיקבע מדעית על ידי מורפולוגיה.
  4. תרסיס בבטן של העכבר עם 70% אתנול כדי לנקות את האזור ולצמצם את שפיכת. לחשוף את הקרביים על-ידי ביצוע חתך בבטן דרך העור והן לגוף החומה.
  5. אתר הרחם ולאחר הסר בזהירות את הצופר הרחם כולו מהחיה. התחל על ידי חיתוך מעל oviduct אחד, זמירה שומן מן הרחם תוך כדי שתמשיך עד הסוף צוואר הרחם. לחתוך צוואר הרחם והמשיכו לקצה העליון של oviduct אחרים, חיתוך כדי לשחרר את הרחם כולה.
    6. תבשיל
  6. מקום הרחם ב 10 ס"מ עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) כדי לשטוף את הדם עודף. תת לנתח את הרחם על ידי גזירה את mesometrium בין כל deciduum, אשר מכיל את העוברים. להעביר את העוברים מאכל 6 ס מ עם PBS טריים.
  7. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, השתמש בסדר מלקחיים (#5) כדי להסיר את רקמת הרחם מן הרקמה decidual.
  8. באמצעות מלקחיים, פורסים בזהירות את קצה חצי עובריים deciduum כדי לחשוף את העובר. לצבוט את deciduum כדי לדחוף את העובר החוצה, משוך בזהירות את העובר.
  9. לפרק רקמות extraembryonic הרחק ככל האפשר מבלי להזיק המורפולוגיה של העובר ( איור 1B).
  10. להשתמש פיפטה העברה כדי למקם את העוברים בצינור 1.5 mL עם PBS טריים ומניחים על קרח. חזור על 1.7-1.9 העוברים הנותרים לפני שתמשיך.
  11. לשאוב PBS, שטיפה פעם אחת עם PBS. האחות PBS.
    הערה: נסה להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מבלי להזיק או ייבוש העוברים. הסרה ידנית של פתרונות מומלץ על כל הצעדים כדי למנוע אובדן של העוברים.
  12. תיקון העוברים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS עבור 1 h RT.
    הערה: עוברי ניתן לתקן לילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס
  13. שטיפה שלוש פעמים עם PBS. לשמור עוברי ב 4 ° C עד מוכן להמשיך עם immunofluorescence.
    הערה: השהה נקודה. עוברי ניתן בבטחה לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.

2. Immunofluorescence Staining

הערה: התנאים הדגירה בהמשך יכול להיות מותאם כדי להכיל את לוחות זמנים שונים. השימוש עדין טלטולים או נדנדה עבור כל שלבי דגירה ארוך מומלץ.

  1. להסיר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של מאגר חסימה (סאפונין 0.5%, 1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS).
  2. דגירה לפחות 4 h RT. ניתן גם לבצע זאת O/N ב- 4 מעלות צלזיוס
  3. להסיר חסימה מאגר ולהוסיף תערובת נוגדן ראשוני מדולל במאגר חסימה. דגירה O/N ב 4 º C
    הערה: ראה חומרים סעיף לתיאור של נוגדנים בשימוש והציע דילולים. נוגדן דילולים צריך להיקבע מדעית. השימוש Nkx2-5 כמו כתם הפניה עבור הסהר הלב מומלץ, הוא דמות מפתח כדי במורד הזרם פילוח וניתוח צעדים.
  4. להסיר נוגדנים הראשי על-ידי שאיפה.
  5. 3 פעמים בשביל 1 h כל עם 0.1% Triton ב- PBS.
  6. להסיר שטיפת ולהוסיף תערובת נוגדנים משניים מדולל במאגר חסימת. תקופת דגירה של 3 h RT. ניתן גם לבצע זאת O/N ב- 4 מעלות צלזיוס
  7. שטיפת 3 פעמים עבור 1 h כל עם 0.1% Triton ב- PBS. ניתן גם לבצע זאת O/N ב- 4 מעלות צלזיוס
  8. Counterstain עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ב- PBS במשך 10 דקות
    הערה: counterstain זה יכול להתבצע בו זמנית עם נוגדנים משניים.
  9. שטיפת פי 2 עבור חמש דקות כל עם 0.1% Triton ב- PBS.
  10. לאט להשעות את העוברים במדיה אנטי-לדעוך הרכבה (מספר n-Propyl 2% w/v (npg ב), 90% גליצרול, 1 x PBS; ראה סעיף חומרים לפרטים נוספים). מאפשרים equilibrate לפחות שעה לפני הרכבה. בעדינות קפיצי צינור מעת לעת כדי לסייע עוברי לתוך פתרון לדעוך אנטי-
    הערה: השהה נקודה. עוברי ניתן לאחסן במשך מספר ימים בפתרון אנטי לדעוך עד מוכן הר ותמונה.

3. הרכבה העוברים על מיקרוסקופ

  1. הכן מיקרוסקופ שקופיות עבור הרכבה באמצעות הקלטת כפול-מקל או מפרידי סיליקון. אם באמצעות הקלטת כפול-מקל, להפוך שתי ערימות מקבילים של 5-6 שכבות כ 15-20 מ מ אחד מהשני. זה ישאיר מספיק מקום כדי למקם את העוברים ולאבטח את coverslip ( איור 1C).
  2. במקום טיפת 15 µL לדעוך אנטי על השקופית, בין הקלטת כפול-מקל. להעביר בזהירות העובר אחת לשקופית.
    הערה: ניתן להניח עובר אחד או יותר בשקופית. עם זאת, השלבים הבאים התמצאות קשים יותר עם העוברים ולאחר זמן הדמיה משכים עלול להוביל הלבנת-צילום-
  3. תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מלקחיים בסדר, מיקום העובר כך הצד הקדמי פונה הרחק השקופית הכוללת ציר הגוף בהתאם לציר הארוך של השקופית. ראה איור 1C סכימטי של ההתקנה של הרכבה.
  4. הצב בזהירות coverslip על המדגם על ידי נח בצד אחד במחסנית אחת כפול-מקל דבק באמצעות מלקחיים להורדת בעדינות את coverslip עד זה יוצר קשר את הקלטת אחרים.
    הערה: השלבים 3.3 ו- 3.4 הם קריטיים כדי להבטיח את הכיוון הנכון של העובר עבור הדמיה. על-ידי הורדת את coverslip לאורך הצד האחורי לכיוון הקדמי, העובר לא צריך לגלגל ותישאר האזור חרמש לב אוריינטציה הרחק השקופית, אשר הינו אידיאלי עבור הדמיה-מיקרוסקופ הפוך.
  5. השתמש פיפטה כדי להוסיף לדעוך אנטי נוספים בין שקופיות coverslip כדי למנוע את הדגימה מת במהלך אחסון/הדמיה-

4. הדמיה קונאפוקלית

תמונות
  1. רכוש באמצעות המטרה ההגדלה הגבוהה ביותר המאפשרת עבור האזור חרמש כל הלב להיות בשבי אחד שדה ראייה. השתמש המחירים הדגימה של נייקוויסט כדי לקבוע מידות voxel x-y-z. רוב היצרנים מיקרוסקופ יהיו " לייעל את " הלחצן כדי לוודא הדגימה של נייקוויסט.
    הערה: צביעת Nkx2-5 הוא מועיל, כמו זה יגדירו את האזור כולו חרמש הלב. Z-צעד קטן מידות (oversampling) תניב תוצאות עיצוב טוב יותר בתלת-מימד, אבל עלול להוביל רכישת המורחבת פעמים ו/או הלבנת עבור דגימות.
  2. להגדיר הדמיה פרמטרים באמצעות שיטות הדמיה הכי סטנדרטי. כלומר, להשתמש את עוצמת הלייזר אפשרי הנמוך כדי להשיג יחס אות לרעש טוב עבור כל fluorophore ואת לבחור רווח לקזז רמות המניבים טווח דינמי רחב ללא להרוות את האות.
    הערה: להיות עקבי עם הדמיה פרמטרים בין דגימות יושוו ישירות. זה חשוב במיוחד עבור ניתוח תלת-ממד הזרם ו כמת.

5. בתמונה ניתוח כמותי בתלת-מימד

הערה: עבור פרוטוקול זה, תמונות נותחו באמצעות חבילת התוכנה Imaris. ניתוח דומה ייתכן באמצעות חבילות חלופי. התיאור שלהלן מכסה את הצינור ניתוח עבור ערוץ הפניה (דהיינו Nkx2-5) וערוץ אחד ניסיוני (קרי YFP). ערוצים נוספים ניתן לנתח באמצעות שינון של השלבים. ערכת נתונים דוגמה היה בתנאי זה יכול לשמש כדי לשכפל את הניתוח שלהלן.

  1. לטעון תמונת raw ערכות נתונים לתוך תצוגה Imaris ארנה, פתח קובץ עבור העובר הרצוי בתצוגת Surpass. הנתונים צריכים לטעון בתצוגה תלת-ממדית במצב (מרבית) MIP. לפתוח את החלון התאמה תצוגה ובחר רק את הערוץ הפניה.
  2. להתאים את הסף של התמונה במידת הצורך עבור כדי שתראי טוב יותר. ניתוח זה, להתאים את הגמא אם יחס אות לרעש נמוכה מדי עבור פילוח.
    הערה: אם ביצוע תיקונים גמא, שהן התאמות לא לינאריות, לתמונות שעברו התאמה אינם יכולים לשמש עבור עוצמת מדידות או השוואות. בשלב זה ניתן לבצע עוד טרום עיבוד תמונה (כלומר תאורה תיקונים, טשטוש לפי עקומת גאוס או סינון אחרים), אם את יחס אות לרעש שלך לא משביעת רצון. אם תבחר לעשות עיבוד קדם, עליך לבצע אותם שלבים טרום עיבוד לכל התמונות ב- dataset שלך.
  3. ליצור משטח חדש עבור הערוץ הפניה באמצעות הדיאלוג אלגוריתם השטח.
    1. בחר " קטע רק האזור של עניין " תיבת סימון.
    2. להתאים את האזור התיבה התוחמת יכלול אזור עניין (ROI, כלומר האזור חרמש הלב) כפי שסומנו על-ידי הפניה הכתם.
    3. בחרו בערוץ הפניה מתוך התפריט הנפתח ערוץ המקור. הגדרת ברירת המחדל עבור Smoothing (שווה לגודל voxel z) מספיקה בדרך כלל, אך עשויים לדרוש אופטימיזציה אמפירי. לניתוח זה, השתמש בהחלקת שווה לגודל חצי z voxel-.
    4. בצע סף באינטנסיביות מוחלטת. כדי להבטיח כי השטח לא להרחיב מעבר האות ערוץ, להתאים את הגבול התחתון באמצעות המחוונים.
      הערה: לתמונות מסוים שבו התאים יכולים מאפשרת בקלות, באפשרותך לכלול " פיצול לגעת אובייקטים " אלגוריתם, עוד יותר להפריד את האות שלך רקע.
    5. סינון אובייקטים לפי מספר voxel או נפח, ולדחות את אובייקטי הרקע (קטן או שנמצאו באזורים מחוץ לאזור Nkx2-5) אולי יש להפיק את האלגוריתם. לסיים את אלגוריתם ה-
  4. באמצעות השטח החדש שנוצר, ליצור ערוץ רעולי פנים עבור הערוץ ניסיוני.
    1. Surface(s) שנבחר, ובחר " מסיכת Sel. ͟ " הפונקציה מתוך חלון עריכה.
    2. בחר ערוץ ניסיוני של הריבית (כלומר YFP). ודא " לשכפל ערוץ לפני החלת מסיכת " תיבת הסימון מסומנת.
  5. , התאמת תצוגת חלון בחר רק את הערוץ רעולי פנים. ליצור משטח חדש עבור הערוץ רעולי פנים על-ידי ביצוע השלבים 5.3-5.3.5.
    הערה: בשלב זה עשוי להיות שימושי להתאים את המראה של כל מסכה כדי להקל על הפריט החזותי של דגם התלת-ממד: בחר כל אחד מממדי ובחר את צבע בכרטיסיית התאמת צבע הבסיס והשקיפות כנדרש. משטח צבעים אל תמזג באופן בלתי צפוי כאשר חפפו.
  6. כדי לקבל את הנתונים נפחי, עם כל השטח שנבחר, בחר את הכרטיסיה סטטיסטיקה. ב " מפורט " תת בכרטיסיה, בחר " ממוצע של ערכים " מתוך התפריט הנפתח. הנפח הכולל של פני השטח ניתן למצוא בעמודה סכום של העניינים שייווצר.
    הערה: אם המשטח שנוצר מכיל קטעים שגויים (קרי שברי כי הרקע אות לא נכללים בתקופת פילוח או אזורים מקוטע מהמשטח הראשי), ייתכן צורך לחשב את הנפח הכולל באופן ידני, או לסנן את המשטחים לפי נפח או מספר voxels ולהבטיח כי רק אות מקטעי כלולים בחישוב. ניתן למצוא את עוצמת הקול עבור כל חלק של פני השטח על-ידי בחירה " כל הערכים " מתוך התפריט הנפתח. בחירת כל ערך יגרום האזור המקביל מופיעים צהוב, אשר מסייע בקביעת ערכי כדי לא לכלול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איכות ניתוח והנתונים הסופי תלוי במידה רבה מורפולוגיה של העוברים גזור, (2) השימוש של נוגדנים גבוה ירידה לפרטים (3) התקנה נכונה של הדמיה פרמטרים של תקינות (1). עוברי פגום לבלבל את תהליך יצירת משטח ומעכבים אנליזה כמותית. דוגמאות של עוברי כראוי גזור, בשלבים מוצגים באיור 2B. העוברים יכול ניסויים נוספים על-ידי הסרת שק החלמון, שבה נוגדנים לעתים קרובות ילכוד הלא ספציפית. עם זאת, הסרה של שק החלמון יהפכו את העוברים פחות חזקים, אז כדאי לשים לב במהלך הטיפול במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנ ל מתאר אסטרטגיה להשגת נתונים כמותיים מתמונות באיכות גבוהה כל הר immunofluorescence של העוברים העכבר שלאחר ההשתלה. כאשר מבוצעת כהלכה, הנתונים הנפחי 3D שנוצר הצעדים הללו יכול לשמש לניתוח השוואתי של intersectional של תחומים מרובים בתוך העובר. האות משטח מיסוך הגישה המתוארת היא של שימוש מסוים כאשר חוקרים אוכלוסיות תאים הרומן בהשוואה ומבוססת הפניה מבנים.

אנו מאמינים כי גישה זו מציע יתרון משמעותי על פני הגישות הקיימות. Immunofluorescence הר שלם עם הדמיה שדה רחב יכול להציע מידע ברמת רקמות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומן על ידי NIH/NHLBI R56 HL128646 ואת בריאות הילד Mindich מכון לפיתוח (MCHDI) ב ISMMS (כדי N.D.). אי. בי נתמכת של NIH/NIDCR Traineeship T32 HD075735. מיקרוסקופ וניתוח התמונה בוצעה בתוך ליבת מיקרוסקופ בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני, אשר נתמך בחלקה על-ידי מכון הסרטן ה"טיש הר CA196521 P30 סיני – סרטן מרכז תמיכה גרנט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בדיקה בוטהRobozRS-9580
מלקחייםRobozRS-8100
מלקחיים עדיניםRobozRS-5015
מספריים לדיסקציהRobozRS-5912
SaponinSigma Aldrich84510
סרום בקר אלבומיןסיגמא אולדריץ'A8022
TritonRPIA4490
עז אנטי-NKX2-5סנטה קרוז ביוטקsc-8697בשימוש ב 1:100-1:500
עוף נגד GFPabcamab13970בשימוש ב 1:500
ארנב אנטי-אי1abcamab109517בשימוש ב 1:100
ארנב נגד Hcn4MilliporeAB5808בשימוש ב 1:100
488 נגד עוףג'קסון מחקר חיסוני703-546-155משוחזר במים ומאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C בריכוז סופי של 50% גליצרול. בשימוש בשעה 1:500.
555 נגד עזיםתרמו פישר סיינטיפיקA21432בשימוש ב 1:500
647 אנטי ארנבג'קסון אימונומחקר711-606-152משוחזר במים ומאוחסן ב -20 מעלות; C בריכוז סופי של 50% גליצרול. בשימוש בשעה 1:500.
DAPISigma AldrichD9542
n-Propyl gallateSigma Aldrich2370פתרון מלאי הוא 20% w/v ב-DMSO. פתרון עבודה שהוכן על ידי ערבוב חלק אחד 10x PBS עם 9 חלקים 100% גליצרול והוספה איטית של תמיסת מלאי 0.1 חלקים.
שקופיות מיקרוסקופיה Superfrost PlusVWR Scientific48311-703
22x22 מ"מ כיסוייםVWR Scientific48366-227
Imaris 8.4.1Bitplane

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
  2. Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
  3. Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
  4. Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
  5. Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
  6. Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463(2016).
  7. Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654(2016).
  8. Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
  10. Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
  11. Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
  12. Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
  13. Cai, C. -L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
  14. Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
  15. Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
  16. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
  17. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
  18. Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
  19. Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428(2017).
  20. Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
  22. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
  23. Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
  24. Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים